تجارب علم البصريات الوراثية عالية الإنتاجية في الخميرة باستخدام المنصة الآلية Lustro
Summary
يحدد هذا البروتوكول خطوات استخدام المنصة الآلية Lustro لإجراء توصيف عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية في الخميرة.
Abstract
يوفر علم البصريات الوراثي تحكما دقيقا في السلوك الخلوي من خلال استخدام البروتينات الحساسة للضوء المشفرة وراثيا. ومع ذلك ، فإن تحسين هذه الأنظمة لتحقيق الوظيفة المطلوبة غالبا ما يتطلب دورات متعددة لاختبار التصميم والبناء ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. ولمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير منصة لوسترو، وهي منصة تجمع بين التحفيز الضوئي وأتمتة المختبرات، مما يتيح الفحص الفعال عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية.
تستخدم Lustro محطة عمل أتمتة مزودة بجهاز إضاءة وجهاز اهتزاز وقارئ ألواح. من خلال استخدام ذراع روبوتية ، يقوم Lustro بأتمتة حركة لوحة microwell بين هذه الأجهزة ، مما يسمح بتحفيز سلالات البصريات الجينية وقياس استجابتها. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا حول استخدام Lustro لتوصيف أنظمة البصريات الوراثية للتحكم في التعبير الجيني في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae. يغطي البروتوكول إعداد مكونات Lustro ، بما في ذلك دمج جهاز الإضاءة مع محطة عمل الأتمتة. كما يوفر تعليمات مفصلة لبرمجة جهاز الإضاءة وقارئ اللوحات والروبوت ، مما يضمن التشغيل السلس والحصول على البيانات طوال العملية التجريبية.
Introduction
علم البصريات الوراثي هو تقنية قوية تستخدم البروتينات الحساسة للضوء للتحكم في سلوك الخلايا بدقةعالية 1،2،3. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولية للتركيبات الوراثية البصرية وتحديد ظروف الإضاءة المثلى يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تحسين أنظمة البصرياتالوراثية 4,5. يمكن للطرق عالية الإنتاجية لفحص وتوصيف نشاط الأنظمة الوراثية البصرية بسرعة تسريع دورة اختبار التصميم والبناء لاختبار تركيبات النماذج الأولية واستكشاف وظيفتها.
تم تطوير منصة Lustro كتقنية أتمتة للمختبرات مصممة لفحص وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية عالية الإنتاجية. إنه يدمج قارئ الصفائح الدقيقة وجهاز الإضاءة وجهاز الاهتزاز مع محطة عمل الأتمتة6. يجمع Lustro بين الزراعة الآلية والتحفيز الضوئي للخلايا في ألواح microwell (الشكل 1 والشكل التكميلي 1) ، مما يتيح الفحص والمقارنة السريعة لأنظمة البصريات الوراثية المختلفة. منصة Lustro قابلة للتكيف بدرجة كبيرة ويمكن تعميمها للعمل مع روبوتات أتمتة المختبرات الأخرى ، وأجهزة الإضاءة ، وقارئات الألواح ، وأنواع الخلايا ، وأنظمة علم البصريات الوراثية ، بما في ذلك تلك التي تستجيب لأطوال موجية مختلفة من الضوء.
يوضح هذا البروتوكول إعداد واستخدام Lustro لتوصيف نظام البصريات الوراثي. يستخدم التحكم البصري الوراثي لعوامل النسخ المنقسمة في الخميرة كمثال على النظام لتوضيح وظيفة وفائدة المنصة من خلال التحقيق في العلاقة بين مدخلات الضوء والتعبير عن جين مراسل الفلورسنت ، mScarlet-I7. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين تبسيط تحسين أنظمة البصريات الوراثية وتسريع اكتشاف استراتيجيات جديدة للتحكم الديناميكي في الأنظمة البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعمل بروتوكول Lustro المعروض هنا على أتمتة عمليات الزراعة والإضاءة والقياس ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصرياتالوراثية 6. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج جهاز الإضاءة وقارئ الألواح الدقيقة وجهاز الاهتزاز في محطة عمل الأتمتة. يوضح هذا البروتوكول على وجه التحديد فائد?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM128873 ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية 2045493 (منحت ل M.N.M.). ميغان نيكول ماكلين ، دكتوراه حاصلة على جائزة مهنية في الواجهة العلمية من صندوق بوروز ويلكوم. تم دعم ZPH من خلال منحة تدريب NHGRI لبرنامج التدريب على علوم الجينوم 5T32HG002760. نحن نقدر المناقشات المثمرة مع أعضاء مختبر ماكلين ، وعلى وجه الخصوص ، نحن ممتنون لكيران سويني لتقديم تعليقات على المخطوطة.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bio-ingénierie. 7 (4), 151 (2020).
