新生小鼠原代耳蜗毛细胞的分离和培养
Summary
在此，我们提出了从小鼠中分离和培养原代耳蜗毛细胞的详细方案。最初，在显微镜下从新生儿（3-5天龄）鼠耳蜗中解剖Corti的器官。随后，将细胞酶消化成单细胞悬液，并在培养数天后使用免疫荧光进行鉴定。
Abstract
耳蜗毛细胞是听觉系统的感觉受体。这些细胞位于内耳骨迷宫内负责听觉的感觉器官Corti器官中。耳蜗毛细胞由两种解剖学和功能上不同的类型组成：外毛细胞和内毛细胞。其中任何一个的损坏都会导致听力损失。值得注意的是，由于内部毛细胞无法再生，并且对它们的损害是永久性的。因此，原代毛细胞的 体外 培养对于研究耳蜗毛细胞的保护或再生作用是必不可少的。本研究旨在发现一种分离和培养小鼠毛细胞的方法。
手动去除耳蜗侧壁后，在显微镜下从耳蜗中仔细解剖听觉上皮，在由0.25%胰蛋白酶-EDTA组成的混合物中在37°C下孵育10分钟，并使用200μL移液器吸头轻轻悬浮在培养基中。将细胞悬液通过细胞过滤器，离心滤液，并在 24 孔板中培养细胞。根据毛细胞表达参与运动张力的机械转导复合物肌球蛋白-VIIa的能力以及通过使用鬼笔环肽选择性标记 F-肌动蛋白来鉴定毛细胞。细胞在培养 4 天后达到 >90% 的汇合度。该方法可以增强我们对体外培养毛细胞生物学特性的理解，并证明耳蜗毛细胞培养的效率，为进一步的听觉研究奠定了坚实的方法学基础。
Introduction
耳蜗毛细胞在声音检测和信号传递到听觉神经中起着重要作用。毛细胞是机械细胞，在脊椎动物中充当主要感觉受体并将声音振动转化为电信号。哺乳动物内耳的感觉上皮包括单排内毛细胞和三排外毛细胞。在不同的基本膜区域，毛细胞感知不同频率（20 至 2,000 Hz）的声音1。外毛细胞的功能是一个主动的机械放大过程，有助于微调哺乳动物的内耳，赋予对声音的高灵敏度。内毛细胞负责检测声音。分级去极化后，声学信息通过听觉神经纤维2传递到大脑。
听力损失可能是由遗传缺陷、衰老、噪音创伤或过度使用耳毒性药物引起的，这些都是世界范围内的主要健康问题 3,4。听力损失主要由毛细胞不可逆的损伤引起5.关于噪声引起的听力损失，尽管研究人员已就其病因的几个细节达成共识，但缺乏对众多潜在机制的全面了解。外毛细胞特别容易受到声学过度暴露的影响6.机械敏感的耳蜗毛细胞与年龄相关的听力损失有关;然而，毛细胞变性的分子和细胞机制仍然未知。分子过程的几种变化导致毛细胞老化、氧化应激、DNA 损伤反应、自噬以及与毛细胞特化相关的基因表达和转录失调7.
由于内耳被包裹在颞骨中，深入身体最坚硬的骨骼，因此在实验上无法进入，这对研究毛细胞修复和再生机制提出了挑战。因此，建立用于研究毛细胞功能的体外培养物已成为研究内耳再生和损伤机制的理想方法。制备耳蜗器官型培养物的程序已在早期研究中描述8,9,10。世界各地的研究人员采用了各种人工耳蜗显微切割和表面处理技术。尽管存在持续的挑战，但各种原代毛细胞培养系统已成功在体外建立。耳蜗器官培养物包含多种细胞类型，包括毛细胞、Deiters 细胞、Hensen 细胞、支柱细胞和听觉神经纤维。深入了解损伤后毛细胞在细胞和分子水平上的变化将有助于开发更强大的研究工具。本研究旨在证明从新生小鼠中分离耳蜗器官并酶促分离丰富的毛细胞用于体外研究的步骤。使用免疫荧光染色确认培养细胞的性质。
Protocol
Representative Results
Discussion
与HEI-OC1细胞系相比，毛细胞的原代培养更准确地复制了体内细胞的生理状态。因此，通过将活细胞从耳蜗器官中分离出来并立即培养它们而建立的听觉原代培养方法似乎是广泛研究听觉系统的宝贵工具。某些技术对于成功的文化至关重要。首先，最小化Corti器官与颞骨分离的持续时间可增强毛细胞持续活动的可能性。因此，研究人员必须尽量减少器官解剖和浸入PBS之间的时间间隔。根据我们的实?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金（NFSC 82101224 to YG）的支持
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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