Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen
Summary
Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.
Abstract
Cochleaire haarcellen zijn de sensorische receptoren van het auditieve systeem. Deze cellen bevinden zich in het orgaan van Corti, het zintuig dat verantwoordelijk is voor het gehoor, in het botlabyrint van het binnenoor. Cochleaire haarcellen bestaan uit twee anatomisch en functioneel verschillende typen: buitenste en binnenste haarcellen. Schade aan een van beide leidt tot gehoorverlies. Met name omdat de binnenste haarcellen niet kunnen regenereren en de schade aan hen permanent is. Daarom is in vitro kweek van primaire haarcellen onmisbaar voor het onderzoeken van de beschermende of regeneratieve effecten van cochleaire haarcellen. Deze studie had tot doel een methode te ontdekken voor het isoleren en kweken van haarcellen van muizen.
Na handmatige verwijdering van de cochleaire zijwand werd het auditieve epitheel onder een microscoop minutieus uit de cochleaire modiolus ontleed, gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd in een mengsel bestaande uit 0,25% trypsine-EDTA en voorzichtig gesuspendeerd in kweekmedium met behulp van een pipetpunt van 200 μl. De celsuspensie werd door een celfilter geleid, het filtraat werd gecentrifugeerd en de cellen werden gekweekt in platen met 24 putjes. Haarcellen werden geïdentificeerd op basis van hun vermogen om een mechanotransductiecomplex, myosine-VIIa, tot expressie te brengen, dat betrokken is bij motorische spanningen, en via selectieve labeling van F-actine met behulp van phalloidine. Cellen bereikten >90% samenvloeiing na 4 dagen in kweek. Deze methode kan ons begrip van de biologische kenmerken van in vitro gekweekte haarcellen vergroten en de efficiëntie van cochleaire haarcelculturen aantonen, waardoor een solide methodologische basis wordt gelegd voor verder auditief onderzoek.
Introduction
Cochleaire haarcellen spelen een belangrijke rol bij de detectie van geluid en de signaaloverdracht naar de gehoorzenuw. Haarcellen zijn mechanistische cellen die functioneren als primaire sensorische receptoren en geluidstrillingen omzetten in elektrische signalen bij gewervelde dieren. Het sensorische epitheel van het binnenoor van zoogdieren bestaat uit een enkele rij binnenste haarcellen en drie rijen buitenste haarcellen. In verschillende basische membraangebieden nemen haarcellen geluiden waar op verschillende frequenties (tussen 20 en 2.000 Hz)1. De functie van buitenste haarcellen is een actief mechanisch versterkingsproces dat helpt bij het verfijnen van het binnenoor van zoogdieren, waardoor een hoge gevoeligheid voor geluid ontstaat. Interne haarcellen zijn verantwoordelijk voor het detecteren van geluiden. Na graduele depolarisatie wordt akoestische informatie via de gehoorzenuwvezels naar de hersenen verzonden2.
Gehoorverlies kan worden veroorzaakt door genetische defecten, veroudering, lawaaitrauma of overmatig gebruik van ototoxische geneesmiddelen, die wereldwijd een groot gezondheidsprobleem vormen 3,4. Gehoorverlies is voornamelijk het gevolg van onomkeerbare schade aan haarcellen5. Hoewel onderzoekers het eens zijn geworden over verschillende details van de etiologie ervan, ontbreekt het aan een alomvattend begrip van de talrijke onderliggende mechanismen, hoewel onderzoekers het eens zijn geworden over verschillende details van de etiologie. Buitenste haarcellen zijn bijzonder kwetsbaar voor akoestische overbelichting6. Mechanosensitieve cochleaire haarcellen zijn betrokken bij leeftijdsgebonden gehoorverlies; De moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de degeneratie van haarcellen blijven echter onbekend. Verschillende veranderingen in de moleculaire processen leiden tot veroudering van haarcellen, oxidatieve stress, reactie op DNA-schade, autofagie en ontregeling van de expressie en transcriptie van genen die verband houden met haarcelspecialisatie7.
Omdat het binnenoor is ingekapseld in het slaapbeen, diep in het hardste bot van het lichaam, is het experimenteel ontoegankelijk, wat een uitdaging vormt voor onderzoek naar de mechanismen van herstel en regeneratie van haarcellen. Daarom is het opzetten van in vitro culturen voor het onderzoeken van de functie van haarcellen een ideale methode geworden voor onderzoek naar de regeneratie- en letselmechanismen van het binnenoor. De procedures voor het bereiden van cochleaire organotypische culturen zijn beschreven in eerdere studies 8,9,10. Onderzoekers over de hele wereld hebben verschillende cochleaire microdissectie- en oppervlaktevoorbereidingstechnieken gebruikt. Ondanks de aanhoudende uitdagingen zijn verschillende primaire haarcelkweeksystemen met succes in vitro opgezet. Cochleaire orgaanculturen bevatten verschillende celtypen, waaronder haarcellen, Deiters-cellen, Hensen-cellen, pilaarcellen en gehoorzenuwvezels. Een diepgaand begrip van de veranderingen in haarcellen op cellulair en moleculair niveau na letsel zal de ontwikkeling van krachtigere onderzoeksinstrumenten mogelijk maken. Deze studie had tot doel de stappen aan te tonen voor het isoleren van cochleaire organen van neonatale muizen en het enzymatisch losmaken van de overvloedige haarcellen voor in vitro studies. De aard van de gekweekte cellen werd bevestigd met behulp van immunofluorescentiekleuring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergeleken met de HEI-OC1-cellijn repliceerden primaire culturen van haarcellen nauwkeuriger de fysiologische toestand van cellen in vivo. Daarom lijkt de auditieve primaire kweekmethode die is ontwikkeld door levende cellen uit cochleaire organen te isoleren en ze onmiddellijk te kweken, een waardevol hulpmiddel te zijn voor uitgebreid onderzoek naar auditieve systemen. Bepaalde technieken zijn cruciaal voor een succesvolle cultuur. Ten eerste vergroot het minimaliseren van de duur van de scheiding van het orgaan van Co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 aan YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
