Isolering og dyrkning af primære cochlear hårceller fra neonatale mus
Summary
Heri præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering og dyrkning af primære cochlear hårceller fra mus. Indledningsvis blev Corti-organet dissekeret fra neonatal (i alderen 3-5 dage) murin cochleae under et mikroskop. Derefter blev cellerne enzymatisk fordøjet i en enkeltcellesuspension og identificeret ved anvendelse af immunofluorescens efter flere dage i kultur.
Abstract
Cochlear hårceller er de sensoriske receptorer i det auditive system. Disse celler er placeret i Corti-organet, det sensoriske organ, der er ansvarlig for hørelsen, inden for det indre øres osseøse labyrint. Cochlear hårceller består af to anatomisk og funktionelt forskellige typer: ydre og indre hårceller. Skader på en af dem resulterer i høretab. Især da indre hårceller ikke kan regenerere, og skader på dem er permanente. Derfor er in vitro-dyrkning af primære hårceller uundværlig for at undersøge de beskyttende eller regenerative virkninger af cochlear hårceller. Denne undersøgelse havde til formål at opdage en metode til isolering og dyrkning af musehårceller.
Efter manuel fjernelse af cochlear sidevæggen blev det auditive epitel omhyggeligt dissekeret fra cochlear modiolus under et mikroskop, inkuberet i en blanding bestående af 0,25% trypsin-EDTA i 10 minutter ved 37 °C og forsigtigt suspenderet i dyrkningsmedium ved hjælp af en 200 μL pipettespids. Cellesuspensionen blev ført gennem et cellefilter, filtratet blev centrifugeret, og celler blev dyrket i plader med 24 brønde. Hårceller blev identificeret baseret på deres evne til at udtrykke et mekanotransduktionskompleks, myosin-VIIa, som er involveret i motoriske spændinger, og via selektiv mærkning af F-actin ved hjælp af phalloidin. Celler nåede >90% sammenløb efter 4 d i kultur. Denne metode kan øge vores forståelse af de biologiske egenskaber ved in vitro-dyrkede hårceller og demonstrere effektiviteten af cochlear hårcellekulturer og etablere et solidt metodologisk fundament for yderligere auditiv forskning.
Introduction
Cochlear hårceller spiller vigtige roller i lyddetektering og signaloverførsel til hørenerven. Hårceller er mekanistiske celler, der fungerer som primære sensoriske receptorer og omdanner lydvibrationer til elektriske signaler hos hvirveldyr. Det sensoriske epitel i pattedyrs indre øre består af en enkelt række indre hårceller og tre rækker ydre hårceller. I forskellige grundlæggende membranområder opfatter hårceller lyde ved forskellige frekvenser (mellem 20 og 2.000 Hz)1. Funktionen af ydre hårceller er en aktiv mekanisk forstærkningsproces, der hjælper med at finjustere pattedyrets indre øre, hvilket giver høj følsomhed over for lyd. Indre hårceller er ansvarlige for at detektere lyde. Efter gradueret depolarisering overføres akustisk information til hjernen gennem de auditive nervefibre2.
Høretab kan skyldes genetiske defekter, aldring, støjtraumer eller overdreven brug af ototoksiske lægemidler, som udgør et stort sundhedsproblem på verdensplan 3,4. Høretab skyldes hovedsageligt irreversibel skade på hårceller5. Med hensyn til støjinduceret høretab, selvom forskere er nået til enighed om flere detaljer i dets ætiologi, mangler der en omfattende forståelse af de mange underliggende mekanismer. Ydre hårceller er særligt sårbare over for akustisk overeksponering6. Mekanofølsomme cochlear hårceller er involveret i aldersrelateret høretab; Imidlertid forbliver de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for hårcelledegeneration, ukendte. Flere ændringer i de molekylære processer fører til hårcellers aldring, oxidativ stress, DNA-skaderespons, autofagi og dysregulering af ekspression og transkription af gener relateret til hårcellespecialisering7.
Da det indre øre er indkapslet i tindingeknoglen, dybt inde i kroppens hårdeste knogle, er det eksperimentelt utilgængeligt, hvilket udgør en udfordring for undersøgelser af mekanismerne for reparation og regenerering af hårceller. Derfor er etablering af in vitro-kulturer til undersøgelse af hårcellers funktion blevet en ideel metode til forskning i det indre øres regenererings- og skademekanismer. Procedurerne til fremstilling af cochlear organotypiske kulturer er blevet beskrevet i tidligere studier 8,9,10. Forskere over hele verden har anvendt forskellige cochlear mikrodissektion og overfladebehandlingsteknikker. På trods af de vedvarende udfordringer er forskellige primære hårcellekultursystemer med succes blevet etableret in vitro. Cochlear organkulturer indeholder forskellige celletyper, herunder hårceller, Deiters-celler, Hensens celler, søjleceller og auditive nervefibre. En dybdegående forståelse af ændringerne i hårceller på cellulært og molekylært niveau efter skade vil muliggøre udviklingen af mere kraftfulde forskningsværktøjer. Denne undersøgelse havde til formål at demonstrere trinene til isolering af cochlear organer fra neonatale mus og enzymatisk løsrivelse af de rigelige hårceller til in vitro-undersøgelser. Arten af de dyrkede celler blev bekræftet ved anvendelse af immunofluorescensfarvning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med HEI-OC1-cellelinjen replikerede primære kulturer af hårceller mere præcist den fysiologiske tilstand af celler in vivo. Derfor synes den auditive primære kulturmetode, der er etableret ved at isolere levende celler fra cochlear organer og straks dyrke dem, at være et værdifuldt værktøj til omfattende forskning i auditive systemer. Visse teknikker er afgørende for en vellykket kultur. For det første øger minimering af varigheden af adskillelsen af Corti-organet fra den tidlige knogle sandsynlig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 til YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
