Isolement et culture de cellules ciliées cochléaires primaires de souris néonatales
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des cellules ciliées cochléaires primaires de souris. Initialement, l’organe de Corti a été disséqué à partir de cochlées murines néonatales (âgées de 3 à 5 jours) au microscope. Par la suite, les cellules ont été digérées enzymatiquement dans une suspension unicellulaire et identifiées par immunofluorescence après plusieurs jours de culture.
Abstract
Les cellules ciliées cochléaires sont les récepteurs sensoriels du système auditif. Ces cellules sont situées dans l’organe de Corti, l’organe sensoriel responsable de l’audition, dans le labyrinthe osseux de l’oreille interne. Les cellules ciliées cochléaires se composent de deux types anatomiquement et fonctionnellement distincts : les cellules ciliées externes et internes. Les dommages causés à l’un ou l’autre d’entre eux entraînent une perte auditive. Notamment, car les cellules ciliées internes ne peuvent pas se régénérer et les dommages qui leur sont causés sont permanents. Par conséquent, la culture in vitro de cellules ciliées primaires est indispensable pour étudier les effets protecteurs ou régénérateurs des cellules ciliées cochléaires. Cette étude visait à découvrir une méthode d’isolement et de culture des cellules ciliées de souris.
Après l’ablation manuelle de la paroi latérale cochléaire, l’épithélium auditif a été méticuleusement disséqué du modiolus cochléaire au microscope, incubé dans un mélange composé de 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 10 min à 37 °C, et délicatement suspendu dans un milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. La suspension cellulaire a été passée à travers un filtre cellulaire, le filtrat a été centrifugé et les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits. Les cellules ciliées ont été identifiées en fonction de leur capacité à exprimer un complexe de mécanotransduction, la myosine-VIIa, qui est impliquée dans les tensions motrices, et par marquage sélectif de la F-actine à l’aide de la phalloïdine. Les cellules ont atteint >90% de confluence après 4 jours de culture. Cette méthode peut améliorer notre compréhension des caractéristiques biologiques des cellules ciliées cultivées in vitro et démontrer l’efficacité des cultures de cellules ciliées cochléaires, établissant ainsi une base méthodologique solide pour la recherche auditive ultérieure.
Introduction
Les cellules ciliées cochléaires jouent un rôle important dans la détection des sons et la transmission du signal au nerf auditif. Les cellules ciliées sont des cellules mécanistes qui fonctionnent comme des récepteurs sensoriels primaires et convertissent les vibrations sonores en signaux électriques chez les vertébrés. L’épithélium sensoriel de l’oreille interne des mammifères comprend une seule rangée de cellules ciliées internes et trois rangées de cellules ciliées externes. Dans différentes zones membranaires de base, les cellules ciliées perçoivent des sons à différentes fréquences (entre 20 et 2 000 Hz)1. La fonction des cellules ciliées externes est un processus d’amplification mécanique actif qui aide à affiner l’oreille interne des mammifères, conférant une grande sensibilité au son. Les cellules ciliées internes sont responsables de la détection des sons. Après une dépolarisation graduée, l’information acoustique est transmise au cerveau par les fibres nerveuses auditives2.
La perte auditive peut être causée par des défauts génétiques, le vieillissement, les traumatismes sonores ou l’utilisation excessive de médicaments ototoxiques, qui constituent un problème de santé majeur dans le monde entier 3,4. La perte auditive résulte principalement de dommages irréversibles aux cellules ciliées5. En ce qui concerne la perte auditive induite par le bruit, bien que les chercheurs soient parvenus à un consensus sur plusieurs détails de son étiologie, une compréhension globale des nombreux mécanismes sous-jacents fait défaut. Les cellules ciliées externes sont particulièrement vulnérables à la surexposition acoustique6. Les cellules ciliées cochléaires mécanosensibles sont impliquées dans la perte auditive liée à l’âge ; Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la dégénérescence des cellules ciliées restent inconnus. Plusieurs changements dans les processus moléculaires conduisent au vieillissement des cellules ciliées, au stress oxydatif, à la réponse aux dommages de l’ADN, à l’autophagie et à la dérégulation de l’expression et de la transcription des gènes liés à la spécialisation des cellules ciliées7.
Comme l’oreille interne est enfermée dans l’os temporal, profondément dans l’os le plus dur du corps, elle est expérimentalement inaccessible, ce qui pose un défi aux recherches sur les mécanismes de réparation et de régénération des cellules ciliées. Par conséquent, l’établissement de cultures in vitro pour étudier la fonction des cellules ciliées est devenu une méthode idéale pour la recherche sur les mécanismes de régénération et de lésion de l’oreille interne. Les procédures de préparation des cultures organotypiques cochléaires ont été décrites dans des études antérieures 8,9,10. Les chercheurs du monde entier ont utilisé diverses techniques de microdissection cochléaire et de préparation de surface. Malgré les défis persistants, divers systèmes de culture de cellules ciliées primaires ont été établis avec succès in vitro. Les cultures d’organes cochléaires contiennent divers types de cellules, notamment des cellules ciliées, des cellules de Deiters, des cellules de Hensen, des cellules piliers et des fibres nerveuses auditives. Une compréhension approfondie des changements dans les cellules ciliées aux niveaux cellulaire et moléculaire après une blessure permettra de développer des outils de recherche plus puissants. Cette étude visait à démontrer les étapes permettant d’isoler les organes cochléaires de souris néonatales et de détacher enzymatiquement les cellules ciliées abondantes pour des études in vitro. La nature des cellules cultivées a été confirmée par coloration par immunofluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport à la lignée cellulaire HEI-OC1, les cultures primaires de cellules ciliées ont reproduit plus précisément l’état physiologique des cellules in vivo. Par conséquent, la méthode de culture primaire auditive établie en isolant des cellules vivantes des organes cochléaires et en les cultivant immédiatement semble être un outil précieux pour des recherches approfondies sur les systèmes auditifs. Certaines techniques sont cruciales pour une culture réussie. Tout d’abord, la minimisation de la dur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NFSC 82101224 à YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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