Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant de mesurer avec précision et fiabilité les métabolites dans les types de cellules rares. Des améliorations techniques, y compris un fluide de gaine modifié pour le tri cellulaire et la génération d’échantillons à blanc pertinents, permettent une quantification complète des métabolites avec une entrée de seulement 5000 cellules par échantillon.

Abstract

La fonction cellulaire dépend de manière critique du métabolisme, et la fonction des réseaux métaboliques sous-jacents peut être étudiée en mesurant les intermédiaires de petites molécules. Cependant, l’obtention de mesures précises et fiables du métabolisme cellulaire, en particulier dans les types de cellules rares comme les cellules souches hématopoïétiques, a traditionnellement nécessité la mise en commun de cellules provenant de plusieurs animaux. Un protocole permet désormais aux chercheurs de mesurer les métabolites dans des types de cellules rares en utilisant une seule souris par échantillon tout en générant plusieurs répétitions pour des types de cellules plus abondants. Cela réduit le nombre d’animaux nécessaires pour un projet donné. Le protocole présenté ici comporte plusieurs différences clés par rapport aux protocoles métabolomiques traditionnels, telles que l’utilisation de 5 g/L de NaCl comme fluide de gaine, le tri directement dans l’acétonitrile et l’utilisation d’une quantification ciblée avec une utilisation rigoureuse d’étalons internes, permettant des mesures plus précises et plus complètes du métabolisme cellulaire. Malgré le temps nécessaire à l’isolement des cellules individuelles, à la coloration fluorescente et au tri, le protocole permet de préserver dans une large mesure les différences entre les types de cellules et les traitements médicamenteux.

Introduction

Le métabolisme est un processus biologique essentiel qui se produit dans toutes les cellules vivantes. Les processus métaboliques impliquent un vaste réseau de réactions biochimiques étroitement régulées et interconnectées, permettant aux cellules de produire de l’énergie et de synthétiser des biomolécules essentielles¹. Pour comprendre la fonction des réseaux métaboliques, les chercheurs mesurent les niveaux de petites molécules intermédiaires dans les cellules. Ces intermédiaires servent d’indicateurs importants de l’activité métabolique et peuvent révéler des informations essentielles sur la fonction cellulaire.

La spectrométrie de masse (MS) est le choix le plus populaire pour la détection spécifique des métabolites dans des échantillons complexes ^1,2. La résonance magnétique nucléaire (RMN) présente des avantages dans la quantification absolue des composés et l’élucidation de la structure, mais la spectrométrie de masse peut souvent résoudre davantage de composants dans des mélanges complexes tels que des biofluides ou des extraits cellulaires. Le plus souvent, la MS est associée à une séparation préalable du composé par électrophorèse capillaire (EC), chromatographie en phase gazeuse (GC) ou chromatographie liquide (LC)³. Le choix de la plate-forme de séparation est principalement motivé par la gamme de métabolites cibles et le type d’échantillon et, dans un contexte réel, par la disponibilité des machines et de l’expertise. Les trois plates-formes de séparation ont une gamme large et chevauchante de métabolites appropriés, mais des limites différentes. En bref, l’EC ne peut séparer que des molécules chargées et nécessite beaucoup d’expertise pour mettre en œuvre une analyse robuste d’un grand nombre d’échantillons⁴. La GC est limitée aux molécules suffisamment petites et apolaires pour s’évaporer avant de se décomposer³. Si l’on considère toutes les colonnes LC disponibles dans le commerce, deux métabolites quelconques peuvent être séparés par cette technologie⁵. Cependant, de nombreuses méthodes LC présentent un pouvoir de résolution inférieur à celui des méthodes CE ou GC de longueur similaire.

La quantité typique de matière première pour les mesures métabolomiques est généralement de l’ordre de 5 x 10⁵ à 5 x 10⁷ cellules par échantillon, 5 à 50 mg de tissu humide ou 5 à 50 μL de liquide corporel⁶. Cependant, il peut être difficile d’obtenir de telles quantités de matière première lorsque l’on travaille avec des cellules primaires de types cellulaires rares, comme par exemple les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ou les cellules tumorales circulantes. Ces cellules sont souvent présentes en très faible nombre et ne peuvent pas être cultivées sans compromettre les caractéristiques cellulaires critiques.

Les CSH et les cellules progénitrices multipotentes (MPP) sont les cellules les moins différenciées du système hématopoïétique et produisent continuellement de nouvelles cellules sanguines tout au long de la vie d’un organisme. La régulation de l’hématopoïèse est d’une pertinence clinique dans des conditions telles que la leucémie et l’anémie. Malgré leur importance, les CSH et les MPP sont parmi les cellules les plus rares du système hématopoïétique. À partir d’une seule souris, en général, environ 5000 CSH peuvent être isolées ^7,8,9. Comme les méthodes métabolomiques traditionnelles nécessitent plus de matériel d’entrée, la mise en commun de cellules de plusieurs souris était souvent nécessaire pour analyser des types de cellules rares^10,11.

Ici, nous avons cherché à développer un protocole qui permet de mesurer les métabolites dans aussi peu que 5000 cellules par échantillon afin de permettre la génération de données métabolomiques à partir des CSH d’une seule souris¹². En même temps, cette méthode permet de générer plusieurs répétitions à partir d’une seule souris pour des types de cellules plus abondants comme les lymphocytes. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux requis pour un projet donné, contribuant ainsi aux « 3R » (réduction, remplacement, raffinement) de l’expérimentation animale.

Les métabolites dans les cellules peuvent avoir des taux de renouvellement très élevés, souvent de l’ordre de quelques secondes¹³. Cependant, la préparation des échantillons pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut prendre des heures, et le tri FACS lui-même peut prendre de quelques minutes à quelques heures, ce qui entraîne des altérations potentielles du métabolome en raison de conditions non physiologiques. Certains des réactifs utilisés dans ce protocole (tels que le tampon de lyse de chlorure d’ammonium-potassium [ACK]) peuvent avoir des effets similaires. Ces conditions peuvent causer un stress cellulaire et avoir un impact sur les niveaux et les ratios de métabolites dans les cellules, ce qui conduit à des mesures inexactes ou biaisées du métabolisme cellulaire 14,15,16. Les changements métaboliques dus à la préparation des échantillons sont parfois appelés artefacts de tri. Les longs protocoles de digestion et les réactifs agressifs qui pourraient être nécessaires pour produire des suspensions unicellulaires à partir de tissus durs ou durs peuvent aggraver ce problème. Les changements qui peuvent se produire dépendent probablement du type de cellule et des conditions de traitement. La nature précise de ces changements reste inconnue, car l’état métabolique des cellules non perturbées dans les tissus vivants ne peut pas être mesuré.

Le protocole présenté ici comporte plusieurs différences clés par rapport aux méthodes traditionnelles, à savoir l’utilisation de 5 g/L de NaCl comme fluide de gaine, le tri directement dans le tampon d’extraction, l’injection de grands volumes d’échantillons sur la chromatographie liquide à interaction hydrophile-spectrométrie de masse (HILIC-MS), et l’utilisation d’une quantification ciblée, l’utilisation rigoureuse d’étalons internes et de contrôles de fond (Figure 1). Ce protocole a le potentiel de préserver les différences entre les types de cellules et entre le traitement médicamenteux et le contrôle des véhicules dans une large mesure¹². Même pour les cellules en culture, elle se compare favorablement à d’autres approches, telles que la centrifugation plus établie et l’élimination manuelle du surnageant. Cependant, comme des artefacts de tri peuvent encore se produire, les données doivent être interprétées avec prudence. Malgré cette limitation, le protocole représente une amélioration significative dans le domaine du profilage métabolique, permettant des mesures plus précises et plus complètes du métabolisme cellulaire dans les cellules primaires rares¹².

La capacité de mesurer de manière robuste de larges profils métaboliques dans des cellules primaires rares ouvre la porte à de nouvelles expériences de recherche biomédicale impliquant ces cellules. Par exemple, il a été démontré que la régulation à médiation métabolique dans les CSH a un impact sur la capacité d’auto-renouvellement de la dormance, avec des implications pour l’anémie et la leucémie^11,17. Dans les cellules tumorales circulantes dérivées de patients, des différences dans l’expression des gènes métaboliques entre la tumeur et les cellules adjacentes ont été démontrées^18,19. Ce protocole permet aujourd’hui aux chercheurs d’étudier systématiquement ces différences au niveau métabolique, généralement considéré comme plus proche du phénotype cellulaire que de l’expression des gènes.

Protocol

L’élevage et l’élevage de toutes les souris utilisées pour ce protocole ont été effectués dans une animalerie conventionnelle de l’Institut Max Planck d’immunobiologie et d’épigénétique (MPI-IE) conformément aux réglementations des autorités locales (Regierungspräsidium Freiburg). Les souris ont été euthanasiées avec du CO2 et une luxation du col de l’utérus par du personnel formé par FELASA B conformément aux directives et réglementations approuvées par le comité de protectio…

Representative Results

Le tri FACS permet d’isoler des populations propres de différents types cellulaires à partir d’une même suspension cellulaire (Figure 2 et Figure 3). La spécificité de cette méthode repose sur la coloration des différents types de cellules avec des marqueurs de surface spécifiques (par exemple, les lymphocytes B et les lymphocytes T de la rate) ou des combinaisons spécifiques de marqueurs de surface (par exemple les CSH et les MPP). La coloration de…

Discussion

Les étapes les plus critiques pour une mise en œuvre réussie de la métabolomique ciblée à l’aide de ce protocole sont 1) une stratégie robuste de coloration et de déclenchement qui permettra d’obtenir des populations cellulaires propres 2) une manipulation précise des volumes liquides, 3) un calendrier reproductible de toutes les étapes expérimentales, en particulier toutes les étapes précédant l’extraction des métabolites. Idéalement, tous les échantillons appartenant à une expérience devraient …

Materials

13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A