Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen
Summary
Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.
Abstract
De cellulaire functie hangt in belangrijke mate af van het metabolisme, en de functie van de onderliggende metabole netwerken kan worden bestudeerd door intermediairen met kleine moleculen te meten. Het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare metingen van het cellulaire metabolisme, met name in zeldzame celtypen zoals hematopoëtische stamcellen, vereist echter van oudsher het poolen van cellen van meerdere dieren. Een protocol stelt onderzoekers nu in staat om metabolieten in zeldzame celtypen te meten met slechts één muis per monster, terwijl ze meerdere replicaten genereren voor meer voorkomende celtypen. Dit vermindert het aantal dieren dat nodig is voor een bepaald project. Het hier gepresenteerde protocol omvat verschillende belangrijke verschillen ten opzichte van traditionele metabolomics-protocollen, zoals het gebruik van 5 g/L NaCl als omhulselvloeistof, het rechtstreeks sorteren in acetonitril en het gebruik van gerichte kwantificering met rigoureus gebruik van interne normen, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere metingen van het cellulaire metabolisme mogelijk zijn. Ondanks de tijd die nodig is voor het isoleren van afzonderlijke cellen, fluorescerende kleuring en sortering, kan het protocol de verschillen tussen celtypen en medicamenteuze behandelingen voor een groot deel behouden.
Introduction
Metabolisme is een essentieel biologisch proces dat in alle levende cellen voorkomt. Metabolische processen omvatten een uitgebreid netwerk van biochemische reacties die strak worden gereguleerd en met elkaar verbonden zijn, waardoor cellen energie kunnen produceren en essentiële biomoleculen kunnen synthetiseren. Om de functie van metabole netwerken te begrijpen, meten onderzoekers de niveaus van intermediairen van kleine moleculen in cellen. Deze tussenproducten dienen als belangrijke indicatoren van metabole activiteit en kunnen kritische inzichten in de cellulaire functie onthullen.
Massaspectrometrie (MS) is de meest populaire keuze voor de specifieke detectie van metabolieten in complexe monsters 1,2. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) heeft voordelen bij de absolute kwantificering van verbindingen en structuuropheldering, maar MS kan vaak meer componenten oplossen in complexe mengsels zoals biovloeistoffen of celextracten. Vaker wel dan niet, wordt MS gecombineerd met eerdere scheiding van de verbinding door capillaire elektroforese (CE), gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC)3. De keuze van het scheidingsplatform wordt meestal bepaald door het bereik van de doelmetabolieten en het type monster en, in de praktijk, door de beschikbaarheid van machines en expertise. Alle drie de scheidingsplatforms hebben een breed en overlappend scala aan geschikte metabolieten, maar verschillende beperkingen. Kortom, CE kan alleen geladen moleculen scheiden en vereist veel expertise om een robuuste analyse van een groot aantal monsters uit te voeren4. GC is beperkt tot moleculen die klein en apolair genoeg zijn om te verdampen voordat ze uiteenvallen3. Rekening houdend met alle in de handel verkrijgbare LC-kolommen, kunnen twee willekeurige metabolieten door deze technologie worden gescheiden5. Veel LC-methoden vertonen echter minder oplossend vermogen dan CE- of GC-methoden van vergelijkbare lengte.
De typische hoeveelheid uitgangsmateriaal voor metabolomics-metingen ligt meestal in het bereik van 5 x 105 tot 5 x 107 cellen per monster, 5-50 mg nat weefsel of 5-50 μL lichaamsvloeistof6. Het kan echter een uitdaging zijn om dergelijke hoeveelheden uitgangsmateriaal te verkrijgen bij het werken met primaire cellen van zeldzame celtypen, zoals bijvoorbeeld hematopoëtische stamcellen (HSC’s) of circulerende tumorcellen. Deze cellen zijn vaak in zeer lage aantallen aanwezig en kunnen niet worden gekweekt zonder kritieke cellulaire kenmerken in gevaar te brengen.
HSC’s en multipotente voorlopercellen (MPP’s) zijn de minst gedifferentieerde cellen van het hematopoëtische systeem en produceren gedurende het hele leven van een organisme voortdurend nieuwe bloedcellen. De regulatie van hematopoëse is van klinisch belang bij aandoeningen zoals leukemie en bloedarmoede. Ondanks hun belang behoren HSC’s en MPP’s tot de zeldzaamste cellen binnen het hematopoëtische systeem. Van een enkele muis kunnen doorgaans ongeveer 5000 HSC’s worden geïsoleerd 7,8,9. Omdat traditionele metabolomics-methoden meer inputmateriaal vereisen, was het vaak nodig om cellen van meerdere muizen te bundelen om zeldzame celtypen te analyseren10,11.
Hier wilden we een protocol ontwikkelen dat het mogelijk maakt om metabolieten te meten in slechts 5000 cellen per monster om het genereren van metabolomics-gegevens van de HSC’s van een enkele muis mogelijk te maken12. Tegelijkertijd maakt deze methode het mogelijk om meerdere replicaten uit een enkele muis te genereren voor meer voorkomende celtypen zoals lymfocyten. Deze aanpak vermindert het aantal dieren dat nodig is voor een bepaald project en draagt zo bij aan de “3R” (vermindering, vervanging, verfijning) van dierproeven.
Metabolieten in cellen kunnen een zeer hoge omloopsnelheid hebben, vaak in de orde van seconden13. Het voorbereiden van monsters voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan echter uren duren, en FACS-sortering zelf kan minuten tot uren duren, wat leidt tot mogelijke veranderingen in het metaboloom als gevolg van niet-fysiologische omstandigheden. Sommige van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt (zoals ammoniumchloride-kalium [ACK] lysisbuffer) kunnen vergelijkbare effecten hebben. Deze omstandigheden kunnen cellulaire stress veroorzaken en de niveaus en verhoudingen van metabolieten in cellen beïnvloeden, wat leidt tot onnauwkeurige of bevooroordeelde metingen van het cellulaire metabolisme 14,15,16. De metabolische veranderingen als gevolg van monstervoorbereiding worden soms sorteerartefacten genoemd. Lange spijsverteringsprotocollen en agressieve reagentia die nodig kunnen zijn om eencellige suspensies te produceren uit harde of taaie weefsels, kunnen dit probleem verergeren. Welke veranderingen kunnen optreden, hangt waarschijnlijk af van het celtype en de verwerkingsconditie. De precieze aard van de veranderingen blijft onbekend, omdat de metabolische toestand van de ongestoorde cellen in het levende weefsel niet kan worden gemeten.
Het hier gepresenteerde protocol omvat een aantal belangrijke verschillen ten opzichte van traditionele methoden, namelijk het gebruik van 5 g/L NaCl als omhulselvloeistof, het rechtstreeks sorteren in de extractiebuffer, het injecteren van grote monstervolumes op hydrofiele interactievloeistofchromatografie-massaspectrometrie (HILIC-MS), en het gebruik van gerichte kwantificering, rigoureus gebruik van interne normen en achtergrondcontroles (Figuur 1). Dit protocol heeft de potentie om verschillen tussen celtypen en tussen medicamenteuze behandeling en mediumcontrole voor een groot deel in stand te houden. Zelfs voor gekweekte cellen steekt het gunstig af bij alternatieve benaderingen, zoals de meer gevestigde centrifugatie en handmatige verwijdering van supernatant. Omdat er echter nog steeds sorteerartefacten kunnen optreden, moeten gegevens met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Ondanks deze beperking betekent het protocol een aanzienlijke verbetering op het gebied van metabole profilering, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere metingen van het cellulaire metabolisme in zeldzame primaire cellen mogelijk zijn.
De mogelijkheid om brede metabole profielen in zeldzame primaire cellen robuust te meten, opent de deur naar nieuwe experimenten in biomedisch onderzoek met deze cellen. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat metabolisch gemedieerde regulatie in HSC’s van invloed is op het zelfvernieuwingsvermogen van de rustperiode, met implicaties voor bloedarmoede en leukemie11,17. In van de patiënt afkomstige circulerende tumorcellen zijn verschillen in de expressie van metabole genen tussen tumor en aangrenzende cellen aangetoond18,19. Dit protocol stelt onderzoekers nu in staat om deze verschillen systematisch te bestuderen op een metabolisch niveau, dat over het algemeen wordt beschouwd als dichter bij het cellulaire fenotype dan bij genexpressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle implementatie van gerichte metabolomics met behulp van dit protocol zijn 1) een robuuste kleurings- en gatingstrategie die schone celpopulaties zal opleveren 2) nauwkeurige behandeling van vloeistofvolumes, 3) reproduceerbare timing van alle experimentele stappen, in het bijzonder alle stappen voorafgaand aan metabolietextractie. Idealiter zouden alle monsters die tot één experiment behoren, in één batch moeten worden verwerkt en gemeten om batcheffecten te minimalisere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de dierenfaciliteit van het Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica bedanken voor het leveren van de dieren die in deze studie zijn gebruikt.
Materials
| 13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
| 40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
| Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
| ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
| Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
| Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
| Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
| B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
| B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
| CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
| CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
| CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
| CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
| CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
| CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
| cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
| Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
| FACSAria III | BD | ||
| Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
| Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
| Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
| JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
| Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
| NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
| TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
| Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
| Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
| UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
| UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
| UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
| UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |
References
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
- Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
- Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
- Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
- Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
- Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
- Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
- Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
- Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
- Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
- Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
- Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
- Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
- Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
- Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
