Microinyección de retrovirus RCAS(A) recombinante en lentes embrionarias de pollo
Summary
Este documento de protocolo describe la metodología de microinyección de un retrovirus RCAS(A) en el cristalino de pollo embrionario como herramienta para estudiar in situ la función y la expresión de proteínas durante el desarrollo del cristalino.
Abstract
El pollo embrionario (Gallus domesticus) es un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino, dado su alto grado de similitud con el cristalino humano. RCAS(A) es un retrovirus de pollo competente para la replicación que infecta las células en división, que sirve como una poderosa herramienta para estudiar la expresión y función in situ de proteínas mutantes y de tipo salvaje durante el desarrollo del cristalino mediante microinyección en la luz vacía de la vesícula del cristalino en las primeras etapas de desarrollo, restringiendo su acción a las células proliferativas del cristalino circundantes. En comparación con otros enfoques, como los modelos transgénicos y los cultivos ex vivo , el uso de un retrovirus aviar competente para la replicación de RCAS(A) proporciona un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. Específicamente, la transferencia génica dirigida puede limitarse a las células proliferativas de la fibra del cristalino sin necesidad de promotores específicos de tejido. En este artículo, haremos un breve resumen de los pasos necesarios para la preparación de RCAS(A) de retrovirus recombinantes, proporcionaremos una descripción detallada y completa del procedimiento de microinyección y proporcionaremos resultados de muestra de la técnica.
Introduction
El objetivo de este protocolo es describir la metodología de microinyección embrionaria de lente de pollo de un RCAS(A) (retrovirus A de sarcoma aviar / leucosis con replicación competente). Se ha demostrado que la administración retroviral efectiva en una lente de pollo embrionaria es una herramienta prometedora para el estudio in vivo del mecanismo molecular y la estructura-función de las proteínas del cristalino en la fisiología, las condiciones patológicas y el desarrollo normales del cristalino. Además, este modelo experimental podría utilizarse para la identificación de dianas terapéuticas y el cribado de fármacos para enfermedades como las cataratas congénitas humanas. En definitiva, este protocolo pretende establecer los pasos necesarios para el desarrollo de una plataforma personalizable para el estudio de las proteínas del cristalino.
Los polluelos embrionarios (Gallus domesticus), debido a su similitud en la estructura y función del cristalino con el cristalino humano, son un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino 1,2,3,4. El uso de un retrovirus aviar competente para la replicación de RCAS(A) se ha considerado un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. En particular, tiene una capacidad única para confinar la transferencia de genes diana a las células proliferativas de la fibra del cristalino sin necesidad de promotores específicos del tejido, utilizando el marco de tiempo de desarrollo embrionario único en el que la presencia de la luz vacía del cristalino permite la microinyección in situ de RCAS(A) en el sitio restringido para la expresión de proteínas exógenas dentro de las células proliferativas de la fibra del cristalino5, 6,7,8.
El procedimiento de microinyección de embriones de pollo, descrito en profundidad aquí, se basa originalmente parcialmente en el trabajo de Fekete et. al.6 y desarrollado por Jiang et. al.8 y se ha utilizado como medio para introducir plásmidos virales y no virales en el cristalino de pollitos embrionarios 1,9,10,11,12,13. En general, el trabajo anterior demuestra el potencial de utilizar esta metodología para estudiar el desarrollo, la diferenciación, la comunicación celular y la progresión de la enfermedad en el cristalino, y para el descubrimiento y prueba de dianas terapéuticas para afecciones patológicas del cristalino, como las cataratas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este modelo experimental ofrece la oportunidad de expresar la(s) proteína(s) de interés en el cristalino intacto, lo que lleva al estudio de la relevancia funcional de estas proteínas en la estructura y función del cristalino. El modelo de microinyección de pollitos embrionarios se basa parcialmente en el trabajo de Fekete et. al.6 y fue desarrollado por Jiang et. al.8 y se ha utilizado como medio para insertar plásmidos virales y agentes como agonistas, ARN interfere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) y F32DK134051 (a F.M.A.), y la subvención de la Fundación Welch: AQ-1507 (a J.X.J.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Las figuras fueron creadas parcialmente con Biorender.com.
Materials
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | – | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | – | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | – | – | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | – | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Biologie du développement. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).
