تتبع انتشار الخلايا السرطانية من نقائل الرئة باستخدام التحويل الضوئي
Summary
نقدم طريقة لدراسة إعادة نشر الخلايا السرطانية من نقائل الرئة تتضمن بروتوكولا جراحيا للتحويل الضوئي الانتقائي لنقائل الرئة ، يليه تحديد الخلايا السرطانية المعاد نشرها في الأعضاء الثالثة.
Abstract
ورم خبيث – الانتشار المنهجي للسرطان – هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان. على الرغم من أن ورم خبيث يعتقد عادة أنه عملية أحادية الاتجاه حيث تنتشر خلايا الورم الرئيسي وتنبعث البذور ، إلا أن الخلايا السرطانية في النقائل الموجودة يمكن أيضا أن تعيدالانتشار وتؤدي إلى آفات جديدة في المواقع الثالثية في عملية تعرف باسم “ورم خبيث من النقائل” أو “ورم خبيث إلى ورم خبيث البذر”. قد يؤدي البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث إلى زيادة العبء النقيلي وتقليل نوعية حياة المريض وبقائه على قيد الحياة. لذلك ، فإن فهم العمليات الكامنة وراء هذه الظاهرة أمر بالغ الأهمية لتحسين استراتيجيات العلاج للمرضى الذين يعانون من السرطان النقيلي.
لا يعرف سوى القليل عن بذر ورم خبيث إلى ورم خبيث ، ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود اللوجستية والتكنولوجية. تعتمد الدراسات حول البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث بشكل أساسي على طرق التسلسل ، والتي قد لا تكون عملية للباحثين الذين يدرسون التوقيت الدقيق لأحداث البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث أو ما يعززها أو يمنعها. هذا يسلط الضوء على عدم وجود منهجيات تسهل دراسة البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتطوير – ووصف هنا – بروتوكولا جراحيا للفئران للتحويل الضوئي الانتقائي لنقائل الرئة ، مما يسمح بوضع علامات محددة وتتبع مصير الخلايا السرطانية التي تعيد الانتشار من الرئة إلى المواقع الثالثية. على حد علمنا ، هذه هي الطريقة الوحيدة لدراسة إعادة نشر الخلايا السرطانية وبذر ورم خبيث إلى ورم خبيث من الرئتين التي لا تتطلب التحليل الجينومي.
Introduction
ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان1. ينشأ السرطان النقيلي عندما تنتشر خلايا الورم الرئيسي في جميع أنحاء الجسم وتتكاثر إلى أورام يمكن اكتشافها سريريا في الأعضاء البعيدة 2,3.
على الرغم من أن ورم خبيث يعتقد عادة أنه عملية أحادية الاتجاه حيث تنتشر الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي وتستعمر الأعضاء البعيدة4 ، إلا أن الأدلة السريرية والتجريبية المتزايدة تشير إلى وجود عملية أكثر تعقيدا ومتعددة الاتجاهات. لقد ثبت أن الخلايا السرطانية المنتشرة يمكن أن تعيد زرع الورم الرئيسي (إذا كان لا يزال في مكانه)5،6،7،8،9 ، ويمكن للخلايا السرطانية من البؤر النقيلية الموجودة أن تنتقل إلى مواقع ثالثية وتؤدي إلى آفات جديدة10،11،12،13. في الواقع ، تشير الأدلة من التحليلات الجينومية الحديثة إلى أن بعض الآفات النقيلية لا تنشأ من الورم الرئيسي ، ولكن من النقائل الأخرى – وهي ظاهرة تعرف باسم “ورم خبيث من النقائل” أو “ورم خبيث إلى ورم خبيث”14،15،16. يمكن أن يؤدي البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث إلى إدامة عملية المرض حتى بعد إزالة الورم الرئيسي ، وزيادة العبء النقيلي ، وتقليل نوعية حياة المريض وبقائه على قيد الحياة. لذلك ، فإن فهم العمليات الكامنة وراء البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث أمر بالغ الأهمية لتحسين استراتيجيات العلاج للمرضى الذين يعانون من مرض النقيلي.
على الرغم من الآثار السريرية الشديدة المحتملة ، لا يعرف سوى القليل عن البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث ، ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود اللوجستية والتكنولوجية. الدراسات البشرية محدودة بسبب ندرة العينات السريرية. الاستئصال السريري وخزعة الآفات النقيلية غير شائعين ، وكذلك خزعة الأعضاء التي تبدو سليمة ، حيث قد تكمن خلايا سرطانية واحدة منتشرة. وهذا يعني أن الدراسات البشرية عادة ما تكون ممكنة فقط باستخدام عينات تشريح الجثة من الأفراد الذين لا تزال أورامهم الأولية في مكانها أو تم استئصالها سابقا ولكنها لا تزال متاحة للباحثين. عندما تتوفر مثل هذه العينات ، يجب إجراء تحليلات النسب لتطور السرطان باستخدام طرق التسلسل14. ومع ذلك ، فإن التسلسل الجماعي للأورام الأولية المتطابقة والانبثاث ليس لديه الحساسية اللازمة لتتبع النسب الشامل. على سبيل المثال ، قد يكشف التسلسل السائب لآفة واحدة عن استنساخ فرعي لا يمكن اكتشافه في أي من الآفات المتطابقة. في هذه الحالة ، لن يتمكن المرء من تحديد أصل هذا الاستنساخ الفرعي. قد يكون موجودا في الورم الرئيسي أو ورم خبيث آخر بتردد أقل من حد الكشف ، أو ربما نشأ بعد الاستعمار الأولي للآفة النقيلية التي تم العثور عليها فيها. يوفر تسلسل الخلية الواحدة حساسية متزايدة ، لكن تكلفته العالية تحد من تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع. تعني الطبيعة الاستعادية لهذه الدراسات أيضا أنها توفر نظرة ثاقبة محدودة للأحداث النقيلي العابرة ومشهد المرض في نقاط زمنية مختلفة.
في النماذج الحيوانية ، تسمح التطورات التكنولوجية الحديثة الآن برسم خرائط تطورية مستقبلية بدقة مكانية وزمنية عالية17،18،19،20. تستخدم هذه التقنيات تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 لهندسة الخلايا باستخدام رمز شريطي متطور – طفرات وراثية تتراكم بمرور الوقت. عند التسلسل ، يمكن تتبع نسب كل خلية بناء على ملف تعريف الطفرات للرمز الشريطي17،18،19،20. في الواقع ، يتم استخدام هذه التكنولوجيا بالفعل لرسم خريطة البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث. في ورقة بحثية حديثة ، أظهر Zhang et al. أن خلايا سرطان الثدي والبروستاتا في النقائل العظمية تعيد الانتشار من العظام إلى النقائل الثانوية للبذور في أعضاء متعددة21.
في حين أن هذه الطرق الجديدة لديها إمكانات كبيرة لإنشاء خرائط تطورية مفصلة وعالية الدقة لتطور السرطان ، إلا أنها غير عملية للغاية بالنسبة لأولئك الذين يدرسون التوقيت الدقيق لأحداث بذر ورم خبيث وما الذي يعززها أو يمنعها. يعد سد هذه الفجوات المعرفية أمرا بالغ الأهمية لتحسين فهمنا وعلاجنا للسرطان النقيلي ، ولكن هناك نقص ملحوظ في التقنيات لتسهيل مثل هذه الدراسات. لتلبية هذه الحاجة ، قمنا مؤخرا بتطوير – ونقدم هنا – تقنية جديدة تسمح لنا بتحديد الخلايا السرطانية على وجه التحديد عن طريق التحويل الضوئي في موقع نقيلي (الرئة) ثم إعادة تحديدها لاحقا في الأعضاء الثالثة. باستخدام هذه التقنية ، أظهرنا مؤخرا أن خلايا سرطان الثدي تعيد الانتشار من نقائل الرئة والأعضاء الثالثيةللبذور 13. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتحديد توقيت أحداث إعادة الانتشار ضمن نافذة ضيقة وتحديد كمية الخلايا السرطانية المعاد نشرها ، مما يسهل دراسة الانتحاء العضوي للخلايا المعاد نشرها وما يعزز / يمنع إعادة الانتشار.
في حين أن التحويل الضوئي وأنظمة cre / lox القابلة للحث محليا التي تستبدل بشكل دائم بروتين فلوري بآخر قد استخدمت سابقا لتمييز وتتبع الخلايا السرطانية11،22،23 ، على حد علمنا ، لم يتم تحسين أي نهج لوضع العلامات الزمانية المكانية للخلايا السرطانية لاستهداف الرئة – أحد أكثر مواقع ورم خبيث شيوعا بين الرجال والنساء الذين تم تشخيصهم بأي من أنواع السرطان ال 14 الأكثر شيوعا24. يمكن استخدام أي نوع من الخلايا السرطانية وأي بروتوكول لتوليد ورم خبيث في الرئة مع الإجراء الخاص بنا ، مما يجعله مفيدا على نطاق واسع للباحثين في ورم خبيث. يجب أن تعبر جميع الخلايا السرطانية المستخدمة لتوليد نقائل الرئة عن بروتين قابل للتحويل الضوئي أو قابل للتبديل الضوئي ، وقد يختار الباحثون البروتين الذي يجب استخدامه بناء على احتياجاتهم ومواردهم الخاصة. في هذه الدراسة ، استخدمنا خلايا سرطان الثدي 6DT1 التي عبرت بثبات عن البروتين الفلوري القابل للتحويل الضوئي من الأخضر إلى الأحمر Dendra2 (خلايا 6DT1-Dendra2) 25 الموسومة بهيستون H2B. قمنا بحقن 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 خلايا في وسادة الدهون الثديية الرابعة لإناث الفئران Rag2-/- . كانت الأورام الأولية واضحة بين 12 و 16 يوما بعد الحقن ولم يتم استئصالها طوال مدة التجربة. تطورت النقائل الرئوية العفوية بين 19 و 26 يوما بعد حقن الخلايا السرطانية. تم إجراء جراحات التحويل الضوئي بين 26 و 29 يوما بعد حقن الخلايا السرطانية. تم التضحية بالفئران بعد 72 ساعة من الجراحة بسبب عبء ورم خبيث في الرئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة ، نصف بروتوكولا جراحيا للتحويل الضوئي الانتقائي للخلايا السرطانية في الرئة. تمكن هذه التقنية الباحثين من تحديد الخلايا السرطانية في الرئة بشكل انتقائي وتتبع مصيرها عن طريق إعادة تحديدها في جميع أنحاء الجسم في وقت لاحق ، مما يسهل دراسة ورم خبيث من نقائل الرئة. باستخدام هذا ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا Wade Koba على مساعدته في التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (S10RR029545) ، وفيرا ديسماريه وهيلاري جوزيك من مرفق التصوير التحليلي لتدريبهم ومساعدتهم في الفحص المجهري ، ومركز أينشتاين مونتيفيوري للسرطان ، والمعهد الوطني للسرطان (P30CA013330 ، R01CA21248 ، R01CA255153) ، ومركز جروس ليبر للفوتونات الحيوية ، وبرنامج التصوير المتكامل لأبحاث السرطان ، زمالة السير هنري ويلكوم لما بعد الدكتوراه (221647 / Z / 20 / Z) ، وجائزة METAvivor للتطوير الوظيفي.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Recherche en cancérologie. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Recherche en cancérologie. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
