Suivi de la dissémination des cellules tumorales à partir de métastases pulmonaires à l’aide de la photoconversion
Summary
Nous présentons une méthode d’étude de la rediffusion des cellules tumorales à partir de métastases pulmonaires impliquant un protocole chirurgical de photoconversion sélective des métastases pulmonaires, suivi de l’identification des cellules tumorales redisséminées dans les organes tertiaires.
Abstract
Les métastases, c’est-à-dire la propagation systémique du cancer, sont la principale cause de décès liés au cancer. Bien que les métastases soient généralement considérées comme un processus unidirectionnel dans lequel les cellules de la tumeur primaire disséminent et ensemencent les métastases, les cellules tumorales des métastases existantes peuvent également se dissémineret donner naissance à de nouvelles lésions dans les sites tertiaires dans un processus connu sous le nom de « métastases à partir de métastases » ou « ensemencement de métastases à métastases ». L’ensemencement de métastase à métastase peut augmenter la charge métastatique et diminuer la qualité de vie et la survie du patient. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les processus à l’origine de ce phénomène afin d’affiner les stratégies de traitement des patients atteints d’un cancer métastatique.
On sait peu de choses sur l’ensemencement de métastases à métastases, en partie à cause des limites logistiques et technologiques. Les études sur l’ensemencement de métastases à métastases reposent principalement sur des méthodes de séquençage, ce qui peut ne pas être pratique pour les chercheurs qui étudient le moment exact des événements d’ensemencement de métastase à métastase ou ce qui les favorise ou les prévient. Cela met en évidence le manque de méthodologies qui facilitent l’étude de l’ensemencement de métastase à métastase. Pour y remédier, nous avons développé – et décrivons ici – un protocole chirurgical murin pour la photoconversion sélective des métastases pulmonaires, permettant un marquage spécifique et un suivi du devenir des cellules tumorales qui se rediffusent du poumon vers les sites tertiaires. À notre connaissance, il s’agit de la seule méthode d’étude de la rediffusion des cellules tumorales et de l’ensemencement de métastases à métastases à partir des poumons qui ne nécessite pas d’analyse génomique.
Introduction
Les métastases sont la principale cause de décès liés au cancer1. Le cancer métastatique survient lorsque les cellules de la tumeur primitive se dispersent dans tout le corps et prolifèrent en tumeurs cliniquement détectables dans des organes distants 2,3.
Bien que les métastases soient généralement considérées comme un processus unidirectionnel dans lequel les cellules tumorales se disséminent à partir de la tumeur primaire et colonisent des organes distants4, l’augmentation des preuves cliniques et expérimentales suggère qu’un processus multidirectionnel plus complexe est en jeu. Il a été démontré que les cellules tumorales circulantes peuvent réensemencer la tumeur primaire (si elle est encore en place)5,6,7,8,9, et que les cellules tumorales des foyers métastatiques existants peuvent se déplacer vers les sites tertiaires et donner lieu à de nouvelles lésions 10,11,12,13. En effet, les résultats d’analyses génomiques récentes suggèrent que certaines lésions métastatiques ne proviennent pas de la tumeur primitive, mais d’autres métastases, un phénomène connu sous le nom de « métastases à partir de métastases » ou « ensemencement de métastases à métastases »14,15,16. L’ensemencement de métastase à métastase peut perpétuer le processus pathologique même après l’ablation de la tumeur primitive, augmentant ainsi la charge métastatique et diminuant la qualité de vie et la survie du patient. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les processus qui sous-tendent l’ensemencement de métastases à métastases afin d’affiner les stratégies de traitement pour les patients atteints d’une maladie métastatique.
Malgré les implications cliniques potentiellement graves, on sait peu de choses sur l’ensemencement de métastase à métastase, en partie en raison de limitations logistiques et technologiques. Les études humaines sont limitées par la rareté des échantillons cliniques. La résection clinique et la biopsie des lésions métastatiques sont rares, tout comme la biopsie d’organes apparemment sains, où des cellules tumorales disséminées peuvent se cacher. Cela signifie que les études humaines ne sont généralement possibles qu’à l’aide d’échantillons d’autopsie d’individus dont les tumeurs primaires sont toujours en place ou ont déjà été réséquées mais sont toujours disponibles pour les chercheurs. Lorsque de tels échantillons sont disponibles, des analyses de lignées de la progression du cancer doivent être effectuées à l’aide de méthodes de séquençage14. Cependant, le séquençage en masse des tumeurs primaires et des métastases appariées n’a pas la sensibilité nécessaire pour un traçage complet de la lignée. Par exemple, le séquençage en vrac d’une lésion peut révéler un sous-clone qui est indétectable dans l’une de ses lésions correspondantes. Dans ce cas, il serait impossible de déterminer l’origine de ce sous-clone. Il peut avoir été présent dans la tumeur primitive ou une autre métastase à une fréquence inférieure à la limite de détection, ou il peut être apparu après la colonisation initiale de la lésion métastatique dans laquelle il a été trouvé. Le séquençage unicellulaire offre une sensibilité accrue, mais son coût élevé limite l’application à grande échelle de cette technique. La nature rétrospective de ces études signifie également qu’elles fournissent un aperçu limité des événements métastatiques transitoires et du paysage de la maladie à différents moments.
Dans les modèles animaux, les avancées technologiques récentes permettent aujourd’hui une cartographie phylogénétique prospective avec une haute résolution spatiale et temporelle 17,18,19,20. Ces techniques utilisent l’édition du génome CRISPR/Cas9 pour concevoir des cellules avec un code-barres évolutif – des mutations héréditaires qui s’accumulent au fil du temps. Lors du séquençage, la lignée de chaque cellule peut être retracée sur la base du profil mutationnel de son code-barres 17,18,19,20. En effet, une telle technologie est déjà utilisée pour cartographier l’ensemencement de métastases à métastases. Dans un article récent, Zhang et al. ont démontré que les cellules cancéreuses du sein et de la prostate dans les métastases osseuses se rediffusent de l’os pour ensemencer des métastases secondaires dans plusieurs organes21.
Bien que ces nouvelles méthodes aient un grand potentiel pour générer des cartes phylogénétiques détaillées et à haute résolution de la progression du cancer, elles sont très peu pratiques pour ceux qui étudient le moment exact des événements d’ensemencement de métastases à métastases et ce qui les favorise ou les prévient. Il est essentiel de combler ces lacunes dans les connaissances pour affiner notre compréhension et notre traitement du cancer métastatique, mais il y a un manque notable de technologies pour faciliter de telles études. Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment développé – et présentons ici – une nouvelle technique qui nous permet de marquer spécifiquement les cellules tumorales par photoconversion dans un site métastatique (le poumon) et de les réidentifier ensuite dans les organes tertiaires. À l’aide de cette technique, nous avons récemment montré que les cellules cancéreuses du sein se rediffusent à partir des métastases pulmonaires et ensemencent les organes tertiaires13. Cette technique peut également être utilisée pour déterminer le moment des événements de rediffusion dans une fenêtre étroite et quantifier les cellules tumorales redisséminées, facilitant ainsi l’étude de l’organotropisme des cellules redisséminées et de ce qui favorise/empêche la rediffusion.
Alors que la photoconversion et les systèmes cre/lox localement inductibles qui remplacent définitivement une protéine fluorescente par une autre ont déjà été utilisés pour marquer et suivre les cellules tumorales11,22,23, à notre connaissance, aucune approche de marquage spatio-temporel des cellules tumorales n’a été optimisée pour cibler le poumon – l’un des sites de métastases les plus courants chez les hommes et les femmes diagnostiqués avec l’un des 14 cancers les plus courants24. N’importe quel type de cellule cancéreuse et n’importe quel protocole pour la génération de métastases pulmonaires peuvent être utilisés avec notre procédure, ce qui la rend largement utile pour les chercheurs sur les métastases. Toutes les cellules cancéreuses utilisées pour générer des métastases pulmonaires devraient exprimer une protéine photoconvertible ou photocommutable, et les chercheurs peuvent choisir la protéine à utiliser en fonction de leurs besoins et de leurs ressources spécifiques. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules cancéreuses du sein 6DT1 qui exprimaient de manière stable la protéine fluorescente photoconvertible vert-rouge Dendra2 (cellules 6DT1-Dendra2)25 marquées à l’histone H2B. Nous avons injecté 5,0 × 104 cellules 6DT1-Dendra2 dans le quatrième coussinet adipeux mammaire de souris femelles Rag2-/-. Les tumeurs primaires étaient palpables entre 12 et 16 jours après l’injection et n’ont pas été réséquées pendant toute la durée de l’expérience. Des métastases pulmonaires spontanées se sont développées entre 19 et 26 jours après l’injection de cellules tumorales. Les chirurgies de photoconversion ont été réalisées entre 26 et 29 jours après l’injection de cellules tumorales. Les souris ont été sacrifiées 72 h après la chirurgie en raison de la charge des métastases pulmonaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous décrivons un protocole chirurgical pour la photoconversion sélective des cellules tumorales dans le poumon. Cette technique permet aux chercheurs de marquer sélectivement les cellules tumorales dans le poumon et de suivre leur devenir en les réidentifiant dans tout le corps à un moment ultérieur, facilitant ainsi l’étude des métastases des métastases pulmonaires. En utilisant ce protocole, il a été possible de visualiser des cellules photoconverties dans le cerveau, le foie et le poumo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Wade Koba pour son aide en microtomodensitométrie (S10RR029545), Vera DesMarais et Hillary Guzik de l’Analytical Imaging Facility pour leur formation et leur assistance en microscopie, le Centre de cancérologie Einstein Montefiore, l’Institut national du cancer (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), le Centre de biophotonique Gruss Lipper, le Programme intégré d’imagerie pour la recherche sur le cancer, une bourse postdoctorale Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) et une bourse de développement de carrière METAvivor.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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