Fotokonversiyon Kullanarak Akciğer Metastazlarından Tümör Hücresi Yayılımının İzlenmesi
Summary
Akciğer metastazlarından tümör hücresi yayılımını incelemek için, akciğer metastazlarının seçici fotokonversiyonu için cerrahi bir protokol ve ardından üçüncül organlarda redissemine tümör hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Metastaz – kanserin sistemik yayılımı – kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Metastaz genellikle primer tümörden gelen hücrelerin metastazları yaydığı ve tohumladığı tek yönlü bir süreç olarak düşünülse de, mevcut metastazlardaki tümör hücreleri de “metastazdan metastaz” veya “metastazdan metastaza tohumlama” olarak bilinen bir süreçte üçüncül bölgelerde yenidenyayılabilir ve yeni lezyonlara yol açabilir. Metastazdan metastaza tohumlama, metastatik yükü artırabilir ve hastanın yaşam kalitesini ve sağkalımını azaltabilir. Bu nedenle, bu fenomenin arkasındaki süreçleri anlamak, metastatik kanserli hastalar için tedavi stratejilerini geliştirmek için çok önemlidir.
Kısmen lojistik ve teknolojik sınırlamalar nedeniyle metastazdan metastaza tohumlama hakkında çok az şey bilinmektedir. Metastaz-metastaz tohumlama üzerine yapılan çalışmalar, öncelikle, metastaz-metastaz tohumlama olaylarının tam zamanlamasını veya bunları neyin teşvik ettiğini veya önlediğini inceleyen araştırmacılar için pratik olmayabilecek sıralama yöntemlerine dayanmaktadır. Bu, metastazdan metastaza tohumlama çalışmasını kolaylaştıran metodolojilerin eksikliğini vurgulamaktadır. Bunu ele almak için, akciğer metastazlarının seçici fotokonversiyonu için bir murin cerrahi protokolü geliştirdik ve burada açıkladık, akciğerden üçüncül bölgelere yeniden yayılan tümör hücrelerinin spesifik işaretlenmesine ve kader takibine izin verdik. Bildiğimiz kadarıyla, genomik analiz gerektirmeyen akciğerlerden tümör hücresi yeniden yayılımını ve metastazdan metastaza tohumlamayı incelemek için tek yöntem budur.
Introduction
Metastaz, kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir1. Metastatik kanser, primer tümörden gelen hücreler vücuda yayıldığında ve uzak organlarda klinik olarak saptanabilir tümörlere çoğaldığında ortaya çıkar 2,3.
Metastaz genellikle tümör hücrelerinin primer tümörden yayıldığı ve uzak organları kolonize ettiği tek yönlü bir süreç olarak düşünülse de4, artan klinik ve deneysel kanıtlar daha karmaşık, çok yönlü bir sürecin oyunda olduğunu göstermektedir. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin primer tümörü yeniden tohumlayabildiği gösterilmiştir (eğer hala yerindeyse)5,6,7,8,9 ve mevcut metastatik odaklardan gelen tümör hücreleri üçüncül bölgelere gidebilir ve yeni lezyonlara yol açabilir 10,11,12,13. Gerçekten de, son genomik analizlerden elde edilen kanıtlar, bazı metastatik lezyonların primer tümörden değil, diğer metastazlardan kaynaklandığını göstermektedir – “metastazlardan metastaz” veya “metastazdan metastaza tohumlama” olarak bilinen bir fenomen14,15,16. Metastazdan metastaza tohumlama, primer tümör çıkarıldıktan sonra bile hastalık sürecini devam ettirebilir, metastatik yükü artırabilir ve hastanın yaşam kalitesini ve sağkalımını azaltabilir. Bu nedenle, metastazdan metastaza tohumlamanın arkasındaki süreçleri anlamak, metastatik hastalığı olan hastalar için tedavi stratejilerini geliştirmek için çok önemlidir.
Potansiyel olarak ciddi klinik etkilere rağmen, kısmen lojistik ve teknolojik sınırlamalar nedeniyle metastazdan metastaza tohumlama hakkında çok az şey bilinmektedir. İnsan çalışmaları, klinik örneklerin yetersizliği ile sınırlıdır. Metastatik lezyonların klinik rezeksiyonu ve biyopsisi, tek yayılmış tümör hücrelerinin gizlenebileceği görünüşte sağlıklı organların biyopsisi gibi nadirdir. Bu, insan çalışmalarının tipik olarak yalnızca birincil tümörleri hala yerinde olan veya daha önce rezeke edilmiş ancak araştırmacılar için hala mevcut olan bireylerden alınan otopsi örnekleri kullanılarak mümkün olduğu anlamına gelir. Bu tür örnekler mevcut olduğunda, kanser ilerlemesinin soy analizleri, dizileme yöntemleri14 kullanılarak yapılmalıdır. Bununla birlikte, eşleşen primer tümörlerin ve metastazların toplu dizilimi, kapsamlı soy takibi için gereken duyarlılığa sahip değildir. Örneğin, bir lezyonun toplu dizilimi, eşleşen lezyonlarının hiçbirinde tespit edilemeyen bir alt klonu ortaya çıkarabilir. Bu durumda, bu alt klonun kökeni belirlenemez. Primer tümörde veya başka bir metastazda tespit sınırının altında bir frekansta mevcut olabilir veya bulunduğu metastatik lezyonun ilk kolonizasyonundan sonra ortaya çıkmış olabilir. Tek hücreli dizileme, artan hassasiyet sağlar, ancak yüksek maliyeti, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamasını sınırlar. Bu çalışmaların retrospektif doğası, aynı zamanda geçici metastatik olaylar ve farklı zaman noktalarındaki hastalık manzarası hakkında sınırlı bilgi sağladıkları anlamına gelir.
Hayvan modellerinde, son teknolojik gelişmeler artık yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle ileriye dönük filogenetik haritalamayaizin vermektedir 17,18,19,20. Bu teknikler, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesini, zamanla biriken kalıtsal mutasyonlar olan evrimleşen bir barkodla hücreleri tasarlamak için kullanır. Dizileme üzerine, her hücrenin soyu, 17,18,19,20 barkodunun mutasyon profiline göre izlenebilir. Gerçekten de, bu tür bir teknoloji zaten metastaz-metastaz tohumlamasını haritalamak için kullanılıyor. Yakın tarihli bir makalede, Zhang ve ark. kemik metastazlarındaki meme ve prostat kanseri hücrelerinin kemikten yeniden yayıldığını ve birden fazla organda ikincil metastazları tohumladığını göstermiştir21.
Bu yeni yöntemler, kanser ilerlemesinin ayrıntılı, yüksek çözünürlüklü filogenetik haritalarını oluşturmak için büyük bir potansiyele sahip olsa da, metastaz-metastaz tohumlama olaylarının kesin zamanlamasını ve bunları neyin teşvik ettiğini veya önlediğini inceleyenler için oldukça pratik değildir. Bu bilgi boşluklarını doldurmak, metastatik kanser anlayışımızı ve tedavimizi geliştirmek için çok önemlidir, ancak bu tür çalışmaları kolaylaştıracak teknolojilerde gözle görülür bir eksiklik vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, yakın zamanda tümör hücrelerini metastatik bir bölgede (akciğer) fotokonversiyon yoluyla spesifik olarak işaretlememize ve daha sonra onları üçüncül organlarda yeniden tanımlamamıza izin veren yeni bir teknik geliştirdik ve burada sunuyoruz. Bu tekniği kullanarak, yakın zamanda meme kanseri hücrelerinin akciğer metastazlarından yeniden yayıldığını ve üçüncül organları tohumladığını gösterdik13. Bu teknik aynı zamanda dar bir pencere içinde yeniden yayılma olaylarının zamanlamasını belirlemek ve yeniden döllenmiş tümör hücrelerini ölçmek için kullanılabilir, bu da redisseminasyon hücrelerinin organotropizminin ve yeniden yayılmayı neyin teşvik ettiğini/önlediğini araştırmayı kolaylaştırır.
Tümör hücrelerini işaretlemek ve izlemek için daha önce bir floresan proteini diğeriyle kalıcı olarak değiştiren fotokonversiyon ve lokal olarak indüklenebilir cre/lox sistemleri kullanılmış olsa da 11,22,23, bildiğimiz kadarıyla, tümör hücrelerinin uzay-zamansal işaretlenmesi için hiçbir yaklaşım, en yaygın 14 kanserden herhangi biri teşhisi konan kadın ve erkekler arasında en yaygın metastaz bölgelerinden biri olan akciğeri hedef alacak şekilde optimize edilmemiştir24. Herhangi bir kanser hücresi tipi ve akciğer metastazı üretimi için herhangi bir protokol prosedürümüzle birlikte kullanılabilir, bu da onu metastaz araştırmacıları için geniş ölçüde yararlı kılar. Akciğer metastazı oluşturmak için kullanılan tüm kanser hücreleri, fotokontabible veya foto-değiştirilebilir bir proteini ifade etmelidir ve araştırmacılar, özel ihtiyaçlarına ve kaynaklarına göre hangi proteini kullanacaklarını seçebilirler. Bu çalışmada, histon H2B’ye etiketlenmiş fotokonvertibl yeşilden kırmızıya floresan protein Dendra2’yi (6DT1-Dendra2 hücreleri)25 stabil bir şekilde eksprese eden 6DT1 meme kanseri hücrelerini kullandık. 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 hücrelerini dişi Rag2-/- farelerin dördüncü meme yağ yastığına enjekte ettik. Primer tümörler enjeksiyondan 12 ila 16 gün sonra palpe edilebilir ve deney süresince rezeke edilmedi. Tümör hücre enjeksiyonundan 19-26 gün sonra spontan akciğer metastazları gelişti. Fotokonversiyon ameliyatları, tümör hücresi enjeksiyonundan 26 ila 29 gün sonra yapıldı. Fareler, akciğer metastaz yükü nedeniyle ameliyattan 72 saat sonra sakrifiye edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, akciğerdeki tümör hücrelerinin selektif fototransformasyonu için bir cerrahi protokol tanımlanmıştır. Bu teknik, araştırmacıların akciğerdeki tümör hücrelerini seçici olarak işaretlemelerini ve daha sonraki bir zaman noktasında onları vücutta yeniden tanımlayarak kaderlerini izlemelerini sağlar ve akciğer metastazlarından metastaz çalışmasını kolaylaştırır. Bu protokolü kullanarak, fotokonversiyon ile ameliyat geçiren farelerin beyin, karaciğer ve fotokonversiyon olmayan s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, mikro bilgisayarlı tomografi (S10RR029545) konusundaki yardımları için Wade Koba’ya, Analitik Görüntüleme Tesisi’nden Vera DesMarais ve Hillary Guzik’e mikroskopi konusundaki eğitimleri ve yardımları için, Einstein Montefiore Kanser Merkezi’ne, Ulusal Kanser Enstitüsü’ne (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biyofotonik Merkezi’ne, Kanser Araştırmaları için Entegre Görüntüleme Programı’na teşekkür eder. Sir Henry Wellcome Doktora Sonrası Bursu (221647/Z/20/Z) ve METAvivor Kariyer Geliştirme Ödülü.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Recherche en cancérologie. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Recherche en cancérologie. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
