Summary
يوضح البروتوكول منهجيتين متميزتين لإزالة الخلايا يتم تطبيقهما على الأنسجة الرئوية البقرية الأصلية ، مما يوفر سردا شاملا لخصائص كل منهما.
Abstract
أصبح استخدام الهلاميات المائية المشتقة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) في هندسة الأنسجة شائعا بشكل متزايد ، حيث يمكنها محاكاة البيئة الطبيعية للخلايا في المختبر. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على المحتوى الكيميائي الحيوي الأصلي ل ECM ، وتحقيق الاستقرار الميكانيكي ، وفهم تأثير عملية إزالة الخلايا على الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية ECM يمثل تحديا. هنا ، تم وصف خط أنابيب لإزالة الخلايا من أنسجة الرئة البقرية باستخدام بروتوكولين مختلفين ، والتوصيف النهائي لفعالية إزالة الخلايا ، وتصنيع الهلاميات المائية ECM الرئوية المعاد تشكيلها وتقييم خصائصها الميكانيكية والتوافق الخلوي. تمت متابعة إزالة الخلايا من الرئة البقرية باستخدام طريقة فيزيائية (دورات تجميد وذوبان) أو طريقة كيميائية (قائمة على المنظفات). تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للتحقق من صحة إزالة الخلايا والاحتفاظ بمكونات ECM الرئيسية. لتقييم محتوى الكولاجين المتبقي والجليكوزامينوجليكان الكبريتي (sGAG) داخل العينات منزوعة الخلايا ، تم استخدام تقنيات تلطيخ سيريوس الأحمر والأزرق الألسياني ، على التوالي. تميزت الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية ECM الرئوية منزوعة الخلايا بالريولوجيا التذبذبية. تشير النتائج إلى أن الهلاميات المائية للرئة البقرية منزوعة الخلايا يمكن أن توفر بديلا عضويا موثوقا به لمنتجات ECM التجارية من خلال الاحتفاظ بمعظم مكونات ECM الأصلية. علاوة على ذلك ، تكشف هذه النتائج أن طريقة إزالة الخلايا المفضلة تؤثر بشكل كبير على حركية الهلام وكذلك الصلابة والخصائص اللزجة المرنة للهلاميات المائية الناتجة.
Introduction
لا تقدم ظروف الاستزراع أحادية الطبقة التقليدية تمثيلا مخلصا للبيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية وتفتقر إلى القدرة على توفير سقالة ثلاثية الأبعاد (3D) مع روابط إرشادية تمكن من تفاعلات مصفوفة الخلية والخلية1. تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) والخصائص الميكانيكية محددة للغاية للأنسجة ، وتعتمد على الوقت ، وتخضع لتغيرات في الحالات المرضية. لذلك ، هناك حاجة لنماذج الأنسجة 3D المحاكاة الحيوية التي تسمح بضبط هذه الخصائص ، وتعديل السلوك الخلوي ، وتحقيق وظائف الأنسجة المطلوبة. تجذب المواد الحيوية الأصلية المشتقة من ECM الكثير من الاهتمام في هندسة الأنسجة مع القدرة على الاستخدام المباشر ل ECM1،2،3،4،5 الخاصة بالأنسجة. تم استخدام الناقلات القائمة على ECM في العديد من التطبيقات التي تمتد من تجديد الأنسجة إلى تطوير نموذج المرض. يتم استخدامها كسقالات للمواد الحيوية القابلة للحقن أو الزرع 4,5 ، في تطبيقات فحص الأدوية 6,7 ، في تطوير المواد التي تحفز نمو الخلايا 8,9,10 ، كأحبار حيوية 11,12,13 ، في علم الموائع الدقيقة14 ، وفي نماذج الأنسجة السرطانية 15,16,17، 18,19.
يعد إزالة الخلايا من الأنسجة والأعضاء طريقة شائعة لتوليد سقالات تحاكي ECM الخاصة بالأنسجة. إعادة تكوين الأنسجة والأعضاء decellularized في الهلاميات المائية يسمح دمج الخلايا في نماذج الأنسجة 3D المحاكاة الحيوية20. تركز تقنيات إزالة الخلايا بشكل أساسي على التخلص من المكونات الخلوية مع الاحتفاظ بتكوين ECM. عادة ما يتم تطبيق الطرق الفيزيائية مثل دورات التجميد والذوبان أو العمليات الكيميائية مثل علاج Triton-X-100 لإزالة الخلايا. علاوة على ذلك ، يفضل علاج DNase لإزالة الحمض النووي المتبقي لتقليل الاستجابات المناعية عند تضمين الخلايا. من الأهمية بمكان تحقيق أقصى قدر من إزالة الخلايا والحد الأدنى من ضعف ECM لتحسين إجراءات إزالة الخلايا21. إلى جانب هذه الجوانب ، يعد توصيف الخصائص البيوكيميائية والميكانيكية للسقالات المعاد تشكيلها ، بما في ذلك مرونة اللزوجة والصلابة ، أمرا بالغ الأهمية لتحسين نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد المهندسة المشتقة من المصفوفات الأصلية20.
يسمح ECM الخاص بالأعضاء في هندسة أنسجة الرئة بمحاكاة البيئة المكروية الرئوية لنمذجة العمليات التنموية أو المتجانسة أو المرضية في المختبر واختبار العلاجات في بيئة محاكاة فيزيائية20،22،23. أظهرت الدراسات السابقة إزالة الخلايا من أنسجة الرئة من عدة أنواع ، مثل الفئران والخنازير والبشر ، ولكن هذه الطرق لم تتكيف بعد مع الأنواع الأقل استخداما مثل الأبقار. إن الفهم الأفضل لمعلمات عملية إزالة الخلايا وكيفية تأثيرها على سقالات ECM المعاد تشكيلها الناتجة فيما يتعلق بالتركيب الكيميائي الحيوي والخواص الميكانيكية سيسمح بضبط أفضل لهذه الجوانب ويمهد الطريق لنماذج أنسجة أكثر موثوقية في الصحة والمرض. في هذه الدراسة ، تم وصف إزالة الخلايا من الرئة البقرية بطريقتين متميزتين ، دورات التجميد والذوبان وعلاج Triton-X-100 ، بشكل صريح ومتبوعا بتحليلات كيميائية حيوية وميكانيكية للهلاميات المائية ECM الرئوية (dECM). تكشف النتائج أن كلتا الطريقتين تسفر عن إزالة الخلايا الفعالة والاحتفاظ بروابط ECM. والجدير بالذكر أن اختيار الطريقة يغير بشكل كبير الصلابة الناتجة ومرونة اللزوجة للهلاميات المائية المعاد تشكيلها. تظهر الهلاميات المائية المشتقة من dECM البقري أوجه تشابه كيميائية حيوية ملحوظة مع المصفوفة خارج الخلية للرئة البشرية ، وتظهر خصائص هلام حراري موثوقة20. كما هو موضح سابقا ، كلتا الطريقتين مناسبتان لثقافة 3D لخلايا سرطان الرئة ، والخلايا الظهارية القصبية السليمة ، وعضويات الرئة المشتقة من المريض20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على رئتين أصليتين طازجتين من متبرعين بقري صغار (1-2 سنة) من مسلخ محلي ونقلهما في حاوية بلاستيكية محكمة الغلق على الجليد إلى المختبر. يتم تقديم التضحية بالحيوانات للاستهلاك العام للحوم (يتم التخلص من الرئتين كنفايات) ولا يرتبط بالدراسة أو بسببها. نؤكد أن المسلخ يتوافق مع القوانين واللوائح الوطنية للتضحية بالحيوانات. علاوة على ذلك ، نؤكد أننا استخدمنا النفايات فقط ولم يكن للمشروع البحثي تأثير على عدد التي تم التضحية بها.
1. حصاد الأعضاء وإعداد الأنسجة
- قم بتخزين أنسجة الرئة البقري التي تم الحصول عليها حديثا في -80 درجة مئوية حتى التجربة.
- في يوم التجربة ، انتظر حتى تذوب أنسجة الرئة المجمدة في درجة حرارة الغرفة.
- تشريح الأنسجة بمشارط ومقص معقمة لإزالة القصبة الهوائية والممرات الهوائية الغضروفية ، وفرمها إلى قطع صغيرة (5 مم3).
- يغسل جيدا بماء عالي النقاء يحتوي على 2٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) على الأقل 3x.
2. إزالة الخلايا من الأنسجة
ملاحظة: تم إزالة الخلايا من أنسجة الرئة البقرية الأصلية باستخدام بروتوكولين متميزين.
- طريقة تجميد الذوبان
- تحضير عينات الأنسجة وفقا للخطوة 1. اغمر الأنسجة المفرومة في محلول اليود 2٪ في ماء مقطر معقم (dH2O) لمدة 1 دقيقة. قم بإجراء غسلتين متتاليتين في dH2O.
- انقل قطع الأنسجة المفرومة إلى أنبوب سعة 50 مل حتى مستوى 15 مل وقم بتنفيذ خمس دورات يدوية للتجميد والذوبان باستخدام حاوية نيتروجين سائل محمولة. املأ الأنابيب إلى الأعلى ب dH2O المعقمة وأنابيب التجميد لمدة دقيقتين في النيتروجين السائل. بعد 2 دقيقة ، انقلها على الفور إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هذا يشكل 1 دورة من تجميد ذوبان الجليد.
- احتضان العينات ب 30 مل من محلول DNase (10 وحدة / مل) في محلول 10 mM MgCl2 (درجة الحموضة 7.5) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت اهتزاز مستمر عند 100 دورة في الدقيقة.
- استمر في الغسيل الشامل باستخدام dH2O المعقم لمدة 3 أيام تحت الاهتزاز المستمر عند 100 دورة في الدقيقة ، مع تجديد المحلول كل 24 ساعة.
- قم بإجراء التجفيد والتبريد على النحو التالي20: قم بتجميد عينات dECM الرطبة عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انقل العينات المجمدة إلى مجفف بالتجميد واعمل في وضع التجفيف تحت الفراغ لمدة 3 إلى 4 أيام حتى تجف تماما. عند الانتهاء من التجفيف بالتجميد ، قم بإجراء طحن العينات في شكل مسحوق ناعم باستخدام جهاز طحن وثلج جاف.
ملاحظة: تعتبر حالة المسحوق الناعم هذه ضرورية بسبب خصائص الذوبان المحسنة خلال المراحل اللاحقة من عملية الهضم.
- طريقة تريتون-X-100
- تحضير عينات الأنسجة وفقا للخطوة 1. عالج أنسجة الرئة ب 1٪ Triton-X-100 لمدة 3 أيام تحت دوران لطيف عند 4 درجات مئوية. حل التبادل كل 24 ساعة.
- احتضان العينات بمحلول DNase (10U / mL) في مخزن مؤقت 10 mM MgCl2 (درجة الحموضة 7.5) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت اهتزاز مستمر.
- استمر في غسل شامل مع dH2O المعقم لمدة 3 أيام تحت دوران لطيف ، مع تجديد المحلول كل 24 ساعة.
- قم بإجراء التجفيد متبوعا بالطحن بالتبريد كما هو موضح في الخطوة 2.1.
3. هضم البيبسين
- هضم عينات مسحوق dECM بتركيز 15 ملغم / مل (وزن / حجم) في محلول البيبسين (1 ملغ / مل من البيبسين في 0.01 M HCl ، الرقم الهيدروجيني 2). نفذ عملية هضم العينة في درجة حرارة الغرفة تحت التحريك المستمر لمدة 48 ساعة وحافظ على درجة حموضة المحلول بشكل متكرر من أجل الهضم الفعال.
- نقل الهضم إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 5000 × غرام لمدة 10 دقائق.
- جمع المواد الطافية وتحييدها وتخزينها في الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7 ، 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS)) من خلال إضافة 5M NaOH و 10x PBS.
ملاحظة: يقترح استخدام المحاليل القلوية المركزة لتعديل درجة الحموضة في الهضم الحمضي ، لأن هذا النهج يتجنب التوسع غير المرغوب فيه في الحجم والذي يمكن أن يؤثر بشكل ضار على الهلام في الخطوات اللاحقة. - قم بتخزين هضمات ما قبل الجل في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمزيد من الدراسات.
4. تلطيخ الأنسجة
- ثبت جزءا صغيرا (5 مم3) من عينة الأنسجة منزوعة الخلايا في 1 مل من محلول الفورمالديهايد 3.7٪ عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- احتضان الأنسجة في أنابيب تحتوي على 1 مل من محلول السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية على صخرة ثابتة.
- لتضمين الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) ، صب 1 مل من OCT في قالب تبريد ، ضع الأنسجة في منتصف القالب بالتبريد ، ثم صب 2 مل من OCT فوق المنديل.
- ضع قوالب التبريد التي تحتوي على مناديل على الثلج الجاف وقم بتجميدها باستخدام النيتروجين السائل. تكون العينات جاهزة عندما يتحول OCT إلى اللون الأبيض بالكامل ، والذي يستغرق عادة 3 دقائق. قم بتخزين المناديل الورقية المضمنة في OCT في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- احصل على أقسام 10 ميكرومتر في cryostat عند -25 درجة مئوية على شريحة زجاجية مطلية بالبولي L-lysine وانقل الشريحة إلى درجة حرارة الغرفة للسماح لقسم الأنسجة بالذوبان على الشريحة. قم بتخزين الشرائح في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- من أجل تأكيد عدم وجود نوى بعد إزالة الخلايا ، قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) كما هو موضح أدناه.
- احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغمر الشرائح في برنامج تلفزيوني وصمة عار عليها مع 50 مل جاهزة للاستخدام من محلول الهيماتوكسيلين في جرة تلطيخ لمدة 3 دقائق ، تليها 3 دقائق غسل بماء الصنبور.
- اغمر الشرائح في 95٪ إيثانول وصمة عار مع 50 مل من محلول Eosin الكحولي 0.5٪ في وعاء تلطيخ لمدة 45 ثانية.
- أداء تلطيخ أحمر سيريوس لإظهار الاحتفاظ بمحتوى الكولاجين بعد إزالة الخلايا.
- رطب الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني واغمرها في 50 مل من 0.1٪ سيريوس الأحمر في محلول مائي مشبع من حمض البكريك في جرة تلطيخ لمدة 1 ساعة.
- شطف الشرائح في محلول حمض الخليك 0.5 ٪ لمدة 5 ثوان وتجفيف جميع الشرائح عن طريق نقعها في 70 ٪ ، 95 ٪ ، و 100 ٪ الإيثانول بالتتابع لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
- لتحليل محتوى sGAG في عينات الأنسجة، قم بإجراء تلطيخ ألسيان الأزرق كما هو موضح أدناه.
- اغمر الشرائح في 50 مل من 1٪ Alcian blue في محلول حمض الأسيتيك 3٪ (درجة الحموضة 2.5) في وعاء تلطيخ لمدة 30 دقيقة. اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 2 دقيقة.
- قم بتجفيف جميع الشرائح عن طريق نقعها في 70٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول بالتتابع لمدة 1 دقيقة لكل منها.
- أضف 0.1 مل من وسط التركيب فوق العينات ، وتصور باستخدام المجهر الضوئي باستخدام تكبير 10x.
5. التوصيف الميكانيكي
- تنفيذ قياسات الريولوجيا التذبذبية باستخدام مقياس ريومتر مع هندسة لوحة متوازية.
- صب 250 ميكرولتر من محلول ما قبل الجل المحفوظ على الثلج على صفيحة سفلية مبردة مسبقا (4 درجات مئوية) لتجنب الهلام السريع.
- اخفض اللوحة المتوازية مقاس 20 مم حتى يشكل محلول ما قبل الهلام قرصا بعرض فجوة 1 مم بين اللوحين.
- ابدأ القياس على الفور. قم بقياس وحدات التخزين والفقد بمرور الوقت بتردد ثابت وإجهاد أثناء تسخين اللوحة السفلية إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمراقبة حركية الهلام. استخدم ترددا ثابتا يبلغ 0.5 هرتز و 0.1٪ إجهاد.
- قم بإجراء اختبار استعادة الزحف بعد توقف قيمة معامل التخزين عن الزيادة والوصول إلى هضبة.
- ضع إجهاد قص 1 باسكال على الهيدروجيل لمدة 15 دقيقة ، وقم بقياس السلالة ، وتفريغ العينة من الإجهاد ، وسجل التغير في قيمة الإجهاد لمدة 15 دقيقة.
- ارسم رسما بيانيا للإجهاد مقابل الوقت لإظهار سلوك تخفيف التوتر. كرر القياسات لثلاثة ملخصات مختلفة ل dECM كمكررات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إزالة الخلوية
تم تحقيق إزالة الخلايا من أنسجة الرئة البقرية لإنتاج الهلاميات المائية dECM التي من شأنها تلخيص البيئة المكروية الأصلية للرئة من خلال كل من الطرق الفيزيائية (تجميد الذوبان) والكيميائية (Triton-X-100). بعد التشريح ، تم غسل قطع الأنسجة في المضادات الحيوية المحتوية على dH2O لإزالة مسببات الأمراض التي يمكن أن تؤثر لاحقا على عقم الهلاميات المائية dECM. تم تطبيق ما مجموعه خمس دورات بالتناوب بين حمام مائي من النيتروجين السائل إلى 37 درجة مئوية لطريقة التجميد والذوبان لتعطيل الهياكل الخلوية. في طريقة إزالة الخلايا الثانية ، تمت معالجة قطع أنسجة الرئة الأصلية بمحلول Triton-X-100 بنسبة 1٪ لمدة 3 أيام تحت التحريك المستمر. في كلتا الطريقتين ، يعد قطع أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة أمرا بالغ الأهمية للسماح بنشر المحاليل في المناطق الأساسية وكذلك الاضطراب المادي للمحتوى النووي. كأول مؤشر مرئي لإزالة الخلايا ، تحول اللون الوردي للأنسجة إلى لون أبيض مع دورات متكررة في كلتا الطريقتين. من الضروري أيضا إزالة الحمض النووي المتبقي ، والذي تم تحقيقه باستخدام علاج DNase في هذا البروتوكول. علاوة على ذلك ، بعد إزالة الخلايا بكلتا الطريقتين ، تم غسل الأنسجة على نطاق واسع لمدة 3 أيام في dH2O مع استكمال المضادات الحيوية للحفاظ على عقم الأنسجة. هناك نقطة أخرى يجب مراعاتها وهي أنه أثناء تحييد هضم dECM وتخزينه مؤقتا للظروف الفسيولوجية ، تم تعقيم جميع المحاليل بالترشيح ، مرة أخرى لأغراض العقم ، والاحتفاظ بها على الجليد لتجنب تكوين هلام سابق لأوانه. ثم تم تحقيق تكوين هيدروجيل الرئة dECM مع الهلام الحراري في الخطوة الأخيرة (الشكل 1).
المقطع بالتبريد والبقع النسيجية
تم إجراء التثبيت والتقطيع بالتبريد لأنسجة الرئة الأصلية والمنزوعة الخلايا متبوعا بتلطيخ نسيجي محدد لتقييم القضاء على النوى والاحتفاظ بجزيئات ECM بعد إزالة الخلايا (الشكل 2 أ). أظهر تلطيخ H&E انخفاضا كبيرا في محتوى النوى في العينات المنزوعة الخلايا باستخدام كل من طرق التجميد والذوبان و Triton-X-100 مقارنة بالأنسجة الأصلية ، مما يعني أن إزالة الخلايا قد تحققت بالطرق الفيزيائية والكيميائية (الشكل 2 ب). أظهر تلطيخ سيريوس الأحمر أن الكولاجين المحتفظ به في الأنسجة المنزوعة الخلايا كان قابلا للمقارنة مع الأنسجة الأصلية ، مما يشير إلى أن كلتا طريقتي إزالة الخلايا كان لهما تأثير ضئيل على محتوى الكولاجين (الشكل 2 ب). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر التلوين الأزرق الألسي أن محتوى sGAG في الأنسجة منزوعة الخلايا تم الحفاظ عليه بكفاءة مقارنة بالأنسجة الأصلية (الشكل 2 ب).
التوصيف الميكانيكي
تم إجراء قياسات الريولوجيا للهلاميات المائية الرئوية منزوعة الخلايا باستخدام لوحة متوازية مقاس 20 مم للحصول على قرص هيدروجيل بسمك 1 مم (الشكل 3 أ). تم استخدام مسح التردد لتحسين قيم الإجهاد المستخدمة في القياسات. كان متوسط معامل التخزين (G') ومعامل الفقد (G'') للهلاميات المائية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التجميد والذوبان 204 باسكال و 28.4 باسكال ، على التوالي ، والتي كانت أكثر صلابة بكثير من الهلاميات المائية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة Triton-X-100 (الشكل 3B-C). ومن المثير للاهتمام ، أن اختبارات استعادة الزحف أظهرت أن الهلاميات المائية التي تم الحصول عليها باستخدام طرق التجميد والذوبان و Triton-X-100 لها استجابات مميزة للإجهاد ، مما يعني أن الهلاميات المائية لها خصائص لزجة مرنة مختلفة (الشكل 3D).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لعملية إزالة الخلايا. تم تشريح أنسجة الرئة البقرية إلى قطع صغيرة وغسلها جيدا. تم تحقيق إزالة المحتوى الخلوي بطريقتين مختلفتين. الطريقة الفيزيائية مع تكرار دورات التجميد والذوبان والطريقة الكيميائية مع علاج Triton-X-100. تم إجراء علاج DNase في كلتا الطريقتين لإزالة الحمض النووي المتبقي. بعد التجفيد للأنسجة المنزوعة الخلايا ، تم اتباع خطوات التبريد ، وهضم البيبسين ، والتحييد ، والهلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التقطيع بالتبريد وتلطيخ أنسجة الرئة البقرية الأصلية والمنزوعة الخلايا. (أ) تم تثبيت قطع أنسجة الرئة البقرية الأصلية ومنزوعة الخلايا بمحلول فورمالديهايد 3.7٪ ، مغمورة في محلول سكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني ، ثم تم تضمينها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وتجميدها المفاجئ. لكل عينة ، تم تركيب أقسام 10 ميكرومتر على شرائح زجاجية للمضي قدما في التلطيخ. (ب) صور تمثيلية للعينات الأصلية والمنزوعة الخلايا بطريقة التجميد والذوبان أو Triton-X-100. تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) للنوى ، وتلطيخ سيريوس الأحمر للكولاجين وتلطيخ ألسيان الأزرق ل sGAGs. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: قياس الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية ECM في الرئة منزوعة الخلايا. (أ) صورة تمثيلية لهيدروجيل رئوي متشابك حراريا بعد التوصيف الميكانيكي. تم إجراء الريولوجيا التذبذبية باستخدام مقياس ريومتر مع هندسة لوحة متوازية. الخواص الريولوجية للهلاميات المائية منزوعة الخلايا ، (ب) معامل التخزين (G') ، (ج) معامل الفقد (G'') ، (د) اختبار استعادة الزحف لتقييم سلوك استرخاء الإجهاد للهلاميات المائية. تمثل أشرطة الخطأ s.d. (* p < 0.05) ، n = 3. تم استخدام اختبار t غير المزاوج مع تصحيح ويلش للتحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبحت الهلاميات المائية المشتقة من الأعضاء نماذج واعدة تلخص الأنسجة الأصلية ECM وتحاكي الوظيفة الخلوية العضوية. على الرغم من أن ECM الرئوي منزوع الخلايا غالبا ما يستخدم في هندسة الأنسجة ، فإن التوصيف الشامل لتكوين المواد الحيوية والخصائص الميكانيكية سيفيد فهما أفضل لكيفية تعديل تفاعلات الخلايا و ECM لنمذجة العمليات البيولوجية أثناء التوازن أو المرض. وعلى وجه الخصوص، فإن تقييم ومراقبة الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية المعاد تشكيلها، مثل الصلابة والمرونة اللزوجية، له أهمية كبيرة لأنها كانت متضمنة في تنظيم العديد من الظواهر الخلوية. لذلك ، من الأهمية بمكان مقارنة وتقييم طرق إزالة الخلايا المختلفة لإنتاج الهلاميات المائية dECM من حيث المحتوى الكيميائي الحيوي والجوانب الميكانيكية20,23. هنا ، تم توضيح إزالة الخلايا من الرئة البقرية بنهجين متميزين: دورات التجميد والذوبان ، والتي كانت تعتمد بشكل أساسي على الاضطراب الميكانيكي وإزالة محتوى الحمض النووي ، وكذلك الإزالة الكيميائية للمحتوى النووي باستخدام منظف شائع ، Triton-X-100 (الشكل 1). بالنسبة لطريقة التجميد والذوبان ، من الضروري التأكد من تجميد جميع عينات الأنسجة وإذابتها بشكل مناسب بين النيتروجين السائل وحمام مائي في مسار آلي ومتكرر24. من أجل تحقيق ذلك ، يمكن تقسيم عينات الأنسجة إلى عدة أنابيب وغرقها في حاوية النيتروجين للتجميد ثم حمام مائي للذوبان. يعد تغيير محلول Triton-X-100 كل 24 ساعة أمرا بالغ الأهمية للطريقة الكيميائية لتعطيل المحتوى الخلوي بشكل فعال21. تم استخدام علاج DNase في كلتا الطريقتين لزيادة تعزيز انهيار الحمض النووي المتبقي ، مما قد يقلل من صلاحية الخلايا المغلفة. نجحت كلتا الطريقتين في القضاء على المواد الخلوية أثناء إزالة الخلايا ، مع بقاء كميات ضئيلة من الحمض النووي في كلتا الحالتين20. والجدير بالذكر أن منتجات المصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا قد تم الإبلاغ عنها بالمثل لتحتوي على كميات صغيرة من الحمض النووي المتبقي دون أي تأثير سلبي على التوافق الخلوي أو الاستجابات المناعية في المضيفين عند الزرع لاستخدامها في هندسة الأنسجة والدراسات الانتقالية20،25.
يتكون ECM من العديد من جزيئات البروتين والسكريات الكبيرة ، مثل الكولاجين والإيلاستين والبروتيوغليكان ، والتي لها أدوار تنظيمية حاسمة في الإشارات الخلوية26. لذلك ، يجب أن تظهر السقالات الأصلية المشتقة من ECM الاحتفاظ بروابط ECM المفيدة للخلية. لهذا الغرض ، تم إجراء تلطيخ الكولاجين و sGAG لمقارنة تركيبة ECM للمصفوفات منزوعة الخلايا بتلك الموجودة في الأنسجة الأصلية. تظهر النتائج أنه تم الاحتفاظ بمحتوى الكولاجين و sGAG في الأنسجة المنزوعة الخلايا عن طريق التجميد والذوبان وطرق إزالة الخلايا Triton-X-100 ، مما يشير إلى أنها توفر بيئة دقيقة ECM تشبه الأصلية في السقالاتالمعاد تشكيلها 20,26. أظهر التنظيم الهيكلي لمكونات ECM اختلافات وفقا لطريقة إزالة الخلايا على الرغم من الاختلافات الطفيفة في محتوى ECM. على الرغم من أن الصور التمثيلية أظهرت تشابها أكبر بين إزالة الخلايا القائمة على المنظفات لأنسجة الرئة وتلطيخ أنسجة الرئة الأصلية ، فقد نجح كلا البروتوكولين في الاحتفاظ ببروتينات ECM الأصلية بشكل عام (الشكل 2).
تلعب الخواص الميكانيكية لنماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد دورا حاسما في دراسات زراعة الخلايا نظرا لأن نمو الخلايا وسلوكها يتم تعليمهما بشكل كبير من خلال الخصائص الميكانيكية ل ECM27،28،29،30 الأصلي. تظهر طرق إزالة الخلايا المختلفة تأثيرات واضحة على عملية الهلام والصلابة النهائية والمرونة اللزوجة للهلاميات المائية dECM. وتبين هذه النتائج أن طريقة التجميد والذوبان تنتج هلاميات مائية أكثر قوة وصلابة من طريقة Triton-X-100. علاوة على ذلك ، في دراستنا السابقة ، أظهرنا أنه يمكن تعديل صلابة الهلاميات المائية dECM بالتجميد والذوبان عن طريق تعديل تركيز الرباط ويمكن خفضها لتتناسب مع صلابة الهلاميات المائية dECM المشتقة من Triton-X-10020. المرونة اللزوجة هي سمة من سمات مصفوفات الأنسجة الأصلية التي تشير إلى السلوك اللزج والمرن استجابة للتشوه الميكانيكي. كشفت الدراسات الحديثة عن دور مرونة اللزوجة ECM في تكاثر الخلايا ، والتشكل ، والتمايز29,30. تظهر هذه الدراسة الهلاميات المائية dECM في الرئة كمواد لتخفيف التوتر تشبه الفيبرين الأصلي أو الكولاجين أو الغشاء القاعدي المعاد تشكيله. علاوة على ذلك ، تشير النتائج إلى أن الهلاميات المائية dECM المشتقة من طريقة Triton-X-100 تتعافى بشكل أسرع من الهلاميات المائية المشتقة من ذوبان الجليد. لذلك ، فإن اختيار طريقة إزالة الخلايا يؤثر بشكل كبير على استجابة الزحف وحركية الاسترخاء للمواد الهلامية dECM الناتجة.
تستخدم طرق إزالة الخلايا الموصوفة هنا الرئة البقرية لإعادة تكوين الخصائص الكيميائية الحيوية والميكانيكية لأنسجة الرئة ECM. لقد ميزنا بدقة التركيب الكيميائي الحيوي والفيزيائي ل ECM بعد عملية إزالة الخلايا. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في طرق إزالة الخلايا في الاحتفاظ بتكوين ECM ، مما يؤثر بشكل مباشر على قدرة الهلاميات المائية dECM بين الدفعات. يعد استخدام أنسجة الرئة من نفس المتبرع معلمة مهمة للتغلب على التباين من دفعة إلى أخرى. على الرغم من استخدام الأنسجة المحلية السليمة ، إلا أن التباين بين المتبرعين أمر لا مفر منه. بشكل عام ، تظهر كل من طرق التجميد والذوبان و Triton-X-100 إمكانات واعدة لاستخدام الهلاميات المائية dECM الأصلية في نمذجة أمراض الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحث العلمي والتكنولوجي في تركيا (TÜBİTAK) (المنحة رقم 118C238). تقع المسؤولية الكاملة للمنشور / الورقة على عاتق مالك المنشور. لا يعني الدعم المالي الذي تم تلقيه من TÜBİTAK أن محتوى المنشور معتمد بالمعنى العلمي من قبل TÜBİTAK. يقر المؤلفون بامتنان باستخدام خدمات ومرافق مركز أبحاث جامعة كوتش للطب الانتقالي (KUTTAM). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 أ باستخدام Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ISOLAB | 64-17-5 | |
| Acetic acid | ISOLAB | 64-19-7 | |
| Alcian blue solution | Sigma-Aldrich | B8438 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Discovery HR-2 rheometer | TA Instruments | ||
| Entellan mounting medium | Merck | 107960 | |
| Eosin solution | Bright-slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-485 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich | 3002 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Mayer's haematoxylin staining solution | Merck | 2.BS01-103-1000 | |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biowest | L0018-100 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| Picric acid | Polysciences | 88-89-1 | |
| Sirius Red | Polysciences | 09400-25 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Triton-X-100 | Merck | 112298 |
References
- Zhu, X., et al. Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening. Mater Today Bio. 15, 100274 (2022).
- Ulldemolins, A., et al. Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair. Polymers. 14 (22), 4907 (2022).
- Biehl, A., et al. Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials. Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).
- Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix. Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
- Spang, M. T., Christman, K. L.
- Schwartz, A. D., et al. A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance. Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).
- Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).
- Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion. Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).
- Bual, R. P., Ijima, H. Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes. Regen Ther. 11, 258-268 (2019).
- Jhala, D., Vasita, R. A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche. Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).
- Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks. J Tissue Eng. 12, 2041731421997091 (2021).
- Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering. Materials. 13 (16), 3522 (2020).
- Won, J. Y., et al. A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).
- Lin, Z., et al. Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system. ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).
- Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression. Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity. Front Oncol. 8, 431 (2018).
- Takeda, M., et al. Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types. Sci Rep. 11 (1), 5654 (2021).
- Jensen, A. R. D., et al. Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis. Cancers (Basel). 13 (13), 3331 (2021).
- Kuşoğlu, A., et al. Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).
- Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Sci Rep. 9 (1), 14933 (2019).
- Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening. Cancers (Basel). 13 (16), 3930 (2021).
- Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization. Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).
- Roth, S. P., et al. Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study. BMC Biotechnol. 17 (1), 13 (2017).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Cox, T. R.
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
- Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
