Summary
Protokollen belyser to distinkte decellulariseringsmetoder anvendt på innfødte bovine lungevev, og gir en omfattende redegjørelse for deres respektive karakteriseringer.
Abstract
Bruken av ekstracellulære matriks (ECM) -avledede hydrogeler i vevsteknikk har blitt stadig mer populært, da de kan etterligne cellenes naturlige miljø in vitro. Imidlertid er det utfordrende å opprettholde det opprinnelige biokjemiske innholdet i ECM, oppnå mekanisk stabilitet og forstå virkningen av decellulariseringsprosessen på de mekaniske egenskapene til ECM-hydrogelene. Her ble det beskrevet en rørledning for decellularisering av bovint lungevev ved hjelp av to forskjellige protokoller, nedstrøms karakterisering av effektiviteten av decellularisering, fabrikasjon av rekonstituerte decellulariserte lunge-ECM-hydrogeler og vurdering av deres mekaniske og cytokompatibilitetsegenskaper. Decellularisering av storfelungen ble utført ved hjelp av en fysisk (fryse-tine-sykluser) eller kjemisk (vaskemiddelbasert) metode. Farging av hematoksylin og eosin ble utført for å validere decellularisering og retensjon av viktige ECM-komponenter. For evaluering av gjenværende kollagen og sulfatert glykosaminoglykan (sGAG) innhold i decellulariserte prøver, ble henholdsvis Sirius rød og Alcian blå fargeteknikker anvendt. Mekaniske egenskaper til de decellulariserte lunge-ECM-hydrogelene ble karakterisert ved oscillatorisk reologi. Resultatene tyder på at decellulariserte bovine lungehydrogeler kan gi et pålitelig organotypisk alternativ til kommersielle ECM-produkter ved å beholde de fleste innfødte ECM-komponenter. Videre viser disse funnene at den valgte decellulariseringsmetoden signifikant påvirker gelasjonskinetikken samt stivheten og viskoelastiske egenskapene til resulterende hydrogeler.
Introduction
Konvensjonelle monolagskulturforhold gir ikke en trofast representasjon av innfødte vevsmikromiljøer og mangler evnen til å gi et tredimensjonalt (3D) stillas med instruktive ligander som muliggjør cellematrise- og cellecelleinteraksjoner1. Ekstracellulær matrise (ECM) sammensetning og mekaniske egenskaper er svært vevsspesifikke, tidsavhengige og gjennomgår endringer i patologiske forhold. Derfor er det behov for biomimetiske 3D-vevsmodeller som tillater tunabilitet av slike egenskaper, modulering av cellulær oppførsel og oppnåelse av ønsket vevsfunksjonalitet. Native ECM-avledede biomaterialer trekker mye oppmerksomhet innen vevsteknikk med muligheten til direkte å bruke vevsspesifikk ECM 1,2,3,4,5. ECM-baserte bærere har blitt brukt i mange applikasjoner som spenner fra vevregenerering til utvikling av sykdomsmodeller. De brukes som injiserbare eller implanterbare biomaterialstillas 4,5, i legemiddelscreeningsapplikasjoner 6,7, i utviklingen av materialer som induserer cellevekst 8,9,10, som bioblekk 11,12,13, i mikrofluidikk 14 og i kreftvevsmodeller 15,16,17,18,19.
Decellularisering av vev og organer er en populær tilnærming for å generere stillaser som etterligner vevsspesifikk ECM. Rekonstitueringen av decellularisert vev og organer i hydrogeler tillater innebygging av celler i biomimetiske 3D-vevsmodeller20. Decellulariseringsteknikker fokuserer hovedsakelig på å eliminere cellulære komponenter samtidig som ECM-sammensetningen beholdes. Fysiske metoder som fryse-tine sykluser eller kjemiske prosesser som Triton-X-100 behandling brukes ofte til å decellularisere vev. Videre er DNase-behandling foretrukket for å fjerne gjenværende DNA for å minimere de immunologiske responsene ved celleinnebygging. Det er avgjørende å oppnå maksimal cellefjerning og minimal ECM-svekkelse for å optimalisere decellulariseringsprosedyrer21. I tillegg til disse aspektene er karakteriseringen av rekonstituerte stillas' biokjemiske og mekaniske egenskaper, inkludert viskoelastisitet og stivhet, avgjørende for å forbedre konstruerte 3D-vevsmodeller avledet fra innfødte matriser20.
Organspesifikk ECM i lungevevsteknikk gjør det mulig å etterligne det pulmonale mikromiljøet for å modellere utviklingsmessige, homeostatiske eller patologiske prosesser in vitro og teste terapeutika i en fysio-mimetisk setting 20,22,23. Tidligere studier har vist decellularisering av lungevev fra flere arter, som rotter, svin og mennesker, men disse metodene har ennå ikke blitt tilpasset mindre brukte arter som storfe. En bedre forståelse av parametrene i decellulariseringsprosessen og hvordan de påvirker de resulterende rekonstituerte ECM-stillasene med hensyn til biokjemisk sammensetning og mekaniske egenskaper, vil muliggjøre bedre justering av slike aspekter og bane vei for mer pålitelige vevsmodeller innen helse og sykdom. I denne studien er bovin lungedecellularisering med to forskjellige metoder, fryse-tine-sykluser og Triton-X-100-behandling, eksplisitt beskrevet og etterfulgt av biokjemiske og mekaniske analyser av decellulariserte lunge-ECM (dECM) hydrogeler. Funnene viser at begge metodene gir effektiv decellularisering og retensjon av ECM-ligander. Spesielt endrer valg av metode signifikant den resulterende stivheten og viskoelastisiteten til rekonstituerte hydrogeler. Hydrogeler avledet fra storfe dECM demonstrerer bemerkelsesverdige biokjemiske analogier med den ekstracellulære matrisen til den menneskelige lungen, og de utviser pålitelige termiske geleringsegenskaper20. Som tidligere beskrevet er begge metodene egnet for 3D-kulturen av lungekreftceller, friske bronkiale epitelceller og pasientavledede lungeorganoider20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ferske innfødte lunger fra unge (1-2 år) storfedonorer ble hentet fra et lokalt slakteri og transportert i en forseglet plastbeholder på is til laboratoriet. Dyreofring utføres for generelt kjøttforbruk (lunger kastet som avfall) og er ikke relatert til eller på grunn av studien. Vi bekrefter at slakteriet overholder nasjonale lover og forskrifter for dyreofring. Videre bekrefter vi at vi kun brukte avfallsmateriale og forskningsprosjektet hadde ingen effekt på antall ofrede dyr.
1. Høsting av organer og vevpreparasjon
- Oppbevar nyoppnådd bovint lungevev ved -80 °C inntil forsøket.
- På dagen for forsøket, vent på at frosne lungevev tiner ved romtemperatur.
- Dissekere vevet med sterile skalpeller og saks for å fjerne luftrør og brusk, og hakk videre i små biter (5 mm3).
- Vask grundig med ultrarent vann som inneholder 2% penicillin/streptomycin (P/S) minst 3x.
2. Decellularisering av vev
MERK: Innfødte bovine lungevev ble decellularisert ved hjelp av to forskjellige protokoller.
- Fryse-tine metode
- Forbered vevsprøver i henhold til trinn 1. Dypp hakket vev i 2% jodoppløsning i sterilt destillert vann (dH2O) i 1 min. Utfør to påfølgende vasker i steril dH2O.
- Overfør kjøttdeigbiter til et 50 ml rør opp til 15 ml og implementer fem manuelle fryse-tine-sykluser ved hjelp av en bærbar beholder for flytende nitrogen. Fyll rørene til toppen med steril dH2O og frys rørene i 2 minutter i flytende nitrogen. Etter 2 minutter overføres de umiddelbart til et vannbad på 37 °C i 10 minutter. Dette utgjør 1 syklus med fryse-tining.
- Inkuber prøvene med 30 ml DNase-oppløsning (10 U/ml) i 10 mM MgCl2-buffer (pH 7,5) i 1 time ved 37 °C under konstant risting ved 100 o / min.
- Fortsett med en omfattende vask med steril dH2O i 3 dager under konstant risting ved 100 o / min, med etterfylling av oppløsning hver 24.
- Utfør lyofilisering og kryomilling som følger20: Frys de våte dECM-prøvene ved -80 °C i 24 timer. Overfør frosne prøver til en lyofilisator og bruk i tørkemodus under vakuum i 3 til 4 dager til de er helt tørket. Etter ferdigstillelse av frysetørking, utfør fresing av prøvene til en fin pulverform ved hjelp av et slipeapparat og tørris.
MERK: Denne fine pulvertilstanden anses nødvendig på grunn av dens forbedrede løselighetsegenskaper i etterfølgende stadier av fordøyelsesprosessen.
- Triton-X-100 metode
- Forbered vevsprøver i henhold til trinn 1. Behandle lungevev med 1% Triton-X-100 i 3 dager under forsiktig rotasjon ved 4 ° C. Bytt løsning hver 24.
- Inkuber prøvene med DNase-oppløsning (10U/ml) i 10 mM MgCl2-buffer (pH 7,5) i 1 time ved 37 °C under konstant risting.
- Fortsett med en omfattende vask med steril dH2O i 3 dager under forsiktig rotasjon, med etterfylling av oppløsning hver 24.
- Utfør lyofilisering etterfulgt av kryofresing som beskrevet i trinn 2.1.
3. Pepsin fordøyelse
- Fordøy pulveriserte dECM-prøver i en konsentrasjon på 15 mg/ml (w/v) i pepsinoppløsning (1 mg/ml pepsin i 0,01 M HCl, pH 2). Utfør prøvefordøyelsesprosessen ved romtemperatur under konstant omrøring i 48 timer og oppretthold pH i løsningen ofte for effektiv fordøyelse.
- Overfør fordøyelsene til et rør og sentrifuge ved 5000 x g i 10 minutter.
- Samle supernatanten og nøytraliser og bufr dem til fysiologiske forhold (pH 7, 1x fosfatbuffersaltvann (PBS)) ved tilsetning av 5M NaOH og 10x PBS.
MERK: Det anbefales å bruke konsentrerte alkaliske løsninger for pH-justering av den sure fordøyelsen, da denne tilnærmingen unngår uønsket volumutvidelse som kan skade geleringen i de påfølgende trinnene. - Oppbevar pre-gel fordøyelser ved -20 ° C for videre studier.
4. Histologisk farging
- Fest en liten del (5 mm3) av decellularisert vevsprøve i 1 ml 3,7 % formaldehydoppløsning ved 4 °C over natten.
- Inkuber vev i rør inneholdende 1 ml 30 % sukroseoppløsning i PBS i 12 timer ved 4 °C på en jevn stein.
- For å legge vev i optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT), hell 1 ml OCT i en kryomold, plasser vev i midten av kryomolden, hell deretter 2 ml OCT på toppen av vevet.
- Plasser kryomolder som inneholder vev på tørris og snap-frys ved hjelp av flytende nitrogen. Prøvene er klare når OCT blir helt hvit, noe som vanligvis tar 3 min. Oppbevar OCT-embedded vev ved -20 °C inntil bruk.
- Oppnå 10 μm seksjoner i kryostat ved -25 ° C på en poly-L-lysinbelagt glassglass og overfør lysbildet til romtemperatur for å la vevsseksjonen smelte på lysbildet. Oppbevar lysbildene ved -20 °C til bruk.
- For å bekrefte fraværet av kjerner etter decellularisering, utfør en hematoksylin- og eosinfarging (H&E) som beskrevet nedenfor.
- Inkuber lysbilder ved romtemperatur i 10 minutter. Dypp lysbilder i PBS og flekk dem med klar til bruk 50 ml hematoksylinoppløsning i en fargekrukke i 3 minutter, etterfulgt av en 3 min vask med vann fra springen.
- Dypp lysbildene i 95% etanol og flekk med 50 ml 0,5% alkoholholdig Eosin-løsning i en fargekrukke i 45 s.
- Utfør Sirius rødfarging for å vise oppbevaring av kollageninnhold etter decellularisering.
- Hydrater lysbildene med PBS og senk dem i 50 ml 0,1% Siriusrød i mettet vandig oppløsning av pikrinsyre i en fargekrukke i 1 time.
- Skyll glidene i 0,5% eddiksyreoppløsning i 5 s og dehydrer alle lysbildene ved å bløtlegge dem i 70%, 95% og 100% etanol sekvensielt i 1 min hver.
- For å analysere sGAG-innhold i vevsprøver, utfør Alcian blå farging som beskrevet nedenfor.
- Dypp lysbildene i 50 ml 1% Alcian blå i 3% eddiksyreoppløsning (pH 2,5) i en fargekrukke i 30 minutter. Vask lysbildene med rennende vann fra springen i 2 min.
- Dehydrer alle lysbildene ved å bløtlegge dem i 70%, 95% og 100% etanol sekvensielt i 1 min hver.
- Legg 0,1 ml monteringsmedium på toppen av prøvene, og visualiser ved hjelp av lysmikroskopi ved hjelp av 10x forstørrelse.
5. Mekanisk karakterisering
- Implementere oscillatoriske reologimålinger ved hjelp av et reometer med parallell plategeometri.
- Hell 250 μL pre-gel oppløsning holdt på is på en forkjølt (4 ° C) nedre plate for å unngå rask gelering.
- Senk den 20 mm parallelle platen til pre-gel-løsningen danner en disk med en 1 mm gapbredde mellom de to platene.
- Start målingen umiddelbart. Mål lagrings- og tapsmoduler over tid med fast frekvens og belastning mens du varmer opp den nedre platen til 37 °C i 30 minutter for å observere geleringskinetikk. Bruk en fast frekvens på 0,5 Hz og 0,1 % belastning.
- Utfør en deformasjonsgjenopprettingstest etter at lagringsmodulverdien slutter å øke og når et platå.
- Påfør 1 Pa skjærspenning på hydrogelen i 15 minutter, mål belastningen, losse prøven fra spenningen og registrer endringen i tøyningsverdi i 15 minutter.
- Tegn en belastning versus tid graf for å vise stress-avslappende atferd. Gjenta målinger for tre forskjellige dECM-fordøyelser som replikater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularisering
Decellularisering av bovint lungevev for å produsere dECM-hydrogeler som ville rekapitulere det opprinnelige lungemikromiljøet, er oppnådd ved både fysiske (fryse-tine) og kjemiske (Triton-X-100) metoder. Etter disseksjon ble vevsbiter vasket i dH2O-holdige antibiotika for å fjerne patogener som senere kan påvirke steriliteten til dECM-hydrogelene. Totalt fem sykluser som vekslet mellom flytende nitrogen og 37 °C vannbad ble brukt for fryse-tine-metoden for å forstyrre cellulære strukturer. I den andre decellulariseringsmetoden ble innfødte lungevevsstykker behandlet med 1% Triton-X-100-løsning i 3 dager under konstant omrøring. I begge metodene er kutting av lungevevvet i små biter avgjørende for å tillate diffusjon av løsninger til kjerneområder, samt den fysiske forstyrrelsen av kjerneinnholdet. Som den første visuelle indikatoren for decellularisering ble den rosa fargen på vevet omgjort til en hvitaktig farge med gjentatte sykluser i begge metoder. Det er også avgjørende å fjerne gjenværende DNA, som ble oppnådd med DNase-behandling i denne protokollen. Videre, etter decellularisering med begge metodene, ble vev grundig vasket i 3 dager i dH2O supplert med antibiotika for å bevare vevets sterilitet. Et annet poeng å vurdere er at under nøytralisering og bufring av dECM-fordøyelser til fysiologiske forhold, ble alle løsninger filtersterilisert, igjen for sterilitetsformål, og holdt på is for å unngå for tidlig geldannelse. Dannelse av dECM-hydrogel i lungene ble deretter oppnådd med termisk gelering i siste trinn (figur 1).
Kryosnitt og histologiske farginger
Fiksering og kryosnitting av native og decellulariserte lungevev etterfulgt av indikerte histologiske farginger ble utført for å vurdere eliminering av kjerner og retensjon av ECM-molekyler etter decellularisering (figur 2A). H&E-farging viste en signifikant reduksjon i kjerneinnhold i decellulariserte prøver med både fryse-tining og Triton-X-100-metoder sammenlignet med naturlig vev, noe som antyder at decellularisering ble oppnådd ved både fysiske og kjemiske metoder (figur 2B). Sirius rødfarging viste at beholdt kollagen i decellularisert vev var sammenlignbart med naturlig vev, noe som indikerer at begge decellulariseringsmetodene hadde minimal innvirkning på kollageninnholdet (figur 2B). I tillegg viste Alcian blå farging at sGAG-innhold i decellulariserte vev ble effektivt bevart sammenlignet med innfødte vev (figur 2B).
Mekanisk karakterisering
Reologimålinger av decellulariserte lungehydrogeler ble utført med et 20 mm parallelt plateoppsett for å oppnå en hydrogelskive med 1 mm tykkelse (figur 3A). Frekvenssveip ble brukt for å optimalisere tøyningsverdiene som ble brukt i målingene. Den gjennomsnittlige lagringsmodulen (G') og tapsmodulen (G'') av hydrogeler oppnådd med fryse-tine-metoden var henholdsvis 204 Pa og 28,4 Pa, som var betydelig stivere enn hydrogeler oppnådd med Triton-X-100-metoden (figur 3B-C). Interessant nok viste kryp-utvinningstester at hydrogeler oppnådd med fryse-tine og Triton-X-100-metoder hadde forskjellige responser på stress, noe som impliserte at hydrogeler har forskjellige viskoelastiske egenskaper (figur 3D).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av decellulariseringsprosessen. Bovint lungevev ble dissekert i små biter og vasket grundig. Fjerning av celleinnhold ble oppnådd med to forskjellige metoder. Fysisk metode med repeterende fryse-tine-sykluser og kjemisk metode med Triton-X-100 behandling. DNase-behandling ble utført i begge metoder for å fjerne gjenværende DNA; Etter lyofilisering av det decellulariserte vevet ble kryomilling, pepsinfordøyelse, nøytralisering og geleringstrinn forfulgt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Kryosnitt og farging av stedegne og decellulariserte bovine lungevev. (A) Innfødte og decellulariserte bovine lungevevsstykker ble festet med 3,7% formaldehydløsning, nedsenket i 30% sukroseoppløsning i PBS, deretter innebygd i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse og snap-frosset. For hver prøve ble 10 μm seksjoner montert på glassglass for å fortsette med farging. (B) Representative bilder av innfødte og decellulariserte prøver ved fryse-tine eller Triton-X-100-metoder. Hematoksylin & Eosin (H &E) farging for kjerner, Sirius rødfarging for kollagen og Alcian blå farging for sGAGs ble utført. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av mekaniske egenskaper til decellulariserte ECM-hydrogeler i lungene. (A) Representativt bilde av en termisk tverrbundet decellularisert lungehydrogel etter mekanisk karakterisering. Oscillatorisk reologi ble utført med reometer med parallell plategeometri. Reologiske egenskaper av decellulariserte hydrogeler, (B) lagringsmodul (G'), (C) tapsmodul (G''), (D) kryp-utvinningstest for å vurdere stressavslappingsoppførsel av hydrogeler. Feilfelt representerer s.d. (*p < 0,05), n=3. Uparet t-test med Welchs korreksjon ble brukt til statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organavledede hydrogeler har blitt lovende modeller som rekapitulerer det opprinnelige vevet ECM og etterligner organotypisk cellulær funksjon. Selv om decellularisert lunge-ECM ofte har blitt brukt i vevsteknikk, vil en grundig karakterisering av biomaterialsammensetning og mekaniske egenskaper være til nytte for en bedre forståelse av hvordan celle-ECM-interaksjoner kan moduleres for modellering av biologiske prosesser under homeostase eller sykdom. Spesielt har vurdering og kontroll av mekaniske egenskaper til rekonstituerte hydrogeler, som stivhet og viskoelastisitet, stor betydning, da disse har vært underforstått i regulering av flere cellulære fenomener. Derfor er det avgjørende å sammenligne og evaluere ulike decellulariseringsmetoder for å produsere dECM-hydrogeler når det gjelder biokjemisk innhold og mekaniske aspekter20,23. Her ble decellularisering av bovin lunge demonstrert med to forskjellige tilnærminger: Fryse-tine-sykluser, som hovedsakelig var basert på mekanisk forstyrrelse og fjerning av DNA-innhold, samt kjemisk fjerning av nukleært innhold ved bruk av et vanlig vaskemiddel, Triton-X-100 (figur 1). For fryse-tine-metoden er det viktig å sikre at alle vevsprøver fryses og tines på riktig måte mellom flytende nitrogen og vannbad i en automatisert og repeterende vei24. For å oppnå dette kunne vevsprøver deles inn i flere rør og sank ned i nitrogenbeholderen for frysing og deretter et vannbad for tining. Endring av Triton-X-100-løsningen hver 24. time er kritisk for at den kjemiske metoden skal forstyrre celleinnholdet effektivt21. DNase-behandling ble brukt i begge metodene for ytterligere å forbedre nedbrytningen av gjenværende DNA, noe som kunne redusere levedyktigheten til innkapslede celler. Begge metodene eliminerte vellykket cellulært materiale under decellularisering, med spormengder av DNA igjen i begge tilfeller20. Spesielt har kommersielt tilgjengelige ekstracellulære matriksprodukter på samme måte blitt rapportert å inneholde små mengder gjenværende DNA uten negativ effekt på cytokompatibilitet eller immunrespons hos verter ved implantasjon for bruk i vevsteknikk og translasjonsstudier20,25.
ECM består av mange protein- og polysakkaridmakromolekyler, som kollagen, elastiner og proteoglykaner, som har kritiske regulatoriske roller i cellulær signalering26. Derfor bør innfødte ECM-avledede stillas demonstrere retensjon av slike celleinstruktive ECM-ligander. For dette formålet ble kollagen- og sGAG-farginger utført for å sammenligne ECM-sammensetningen av decellulariserte matriser med den for innfødte vev. Resultatene viser at kollagen og sGAG-innhold ble beholdt i decellularisert vev via fryse-tine og Triton-X-100 decellulariseringsmetoder, noe som tyder på at de tilbyr et innfødt-lignende ECM-mikromiljø i rekonstituerte stillaser20,26. Den strukturelle organiseringen av ECM-bestanddelene viste forskjeller i henhold til decellulariseringsmetoden til tross for små forskjeller i ECM-innholdet. Selv om representative bilder viste mer likhet mellom vaskemiddelbasert decellularisering av lungevev og innfødte lungevevsfarginger, beholdt begge protokollene innfødte ECM-proteiner generelt (figur 2).
Mekaniske egenskaper til 3D-vevsmodeller spiller en avgjørende rolle i cellekulturstudier, siden både veksten og oppførselen til celler er sterkt instruert av de mekaniske egenskapene til den opprinnelige ECM 27,28,29,30. Ulike decellulariseringsmetoder viser distinkte virkninger på geleringsprosessen og den endelige stivheten og viskoelastisiteten til dECM-hydrogeler. Disse funnene viser at fryse-tine-metoden produserer mer robuste og stivere hydrogeler enn Triton-X-100-metoden. Videre viste vi i vår tidligere studie at stivheten til fryse-tine dECM-hydrogeler kan justeres ved å modifisere ligandkonsentrasjonen og kan senkes for å matche stivheten til Triton-X-100-avledede dECM-hydrogeler20. Viskoelastisitet er en egenskap ved innfødte vevsmatriser som indikerer viskøs og elastisk oppførsel som respons på mekanisk deformasjon. Nylige studier avslørte rollen som ECM-viskoelastisitet i celleproliferasjon, morfologi og differensiering29,30. Denne studien viser lung dECM-hydrogeler som stressavslappende materialer som ligner på innfødt fibrin, kollagen eller rekonstituert kjellermembran. Videre indikerer funnene at Triton-X-100 metodeavledede dECM-hydrogeler gjenoppretter raskere enn fryse-tine-avledede hydrogeler. Derfor påvirker valget av decellulariseringsmetoden sterkt krypresponsen og avslapningskinetikken til de resulterende dECM-gelene.
Decellulariseringsmetoder beskrevet her benytter storfe lunge for å rekonstituere de biokjemiske og mekaniske egenskapene til lungevevvet ECM. Vi karakteriserte fint den biokjemiske og fysiske sammensetningen av ECM etter decellulariseringsprosessen. En stor utfordring i decellulariseringsmetoder er retensjon av ECM-sammensetning, noe som direkte påvirker geleringsevnen til dECM-hydrogeler mellom batcher. Utnyttelse av lungevev fra samme donor er en viktig parameter for å overvinne batch-til-batch-variabilitet. Selv om sunt innfødt vev ble brukt, er variasjon mellom givere uunngåelig. Samlet sett viser både fryse-tining og Triton-X-100-metoder lovende potensial for bruk av native dECM-hydrogeler i sykdomsmodellering av lungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Scientific and Technological Research Council of Turkey (TÜBİTAK) (Grant No. 118C238). Publikasjonens/artikkelens hele ansvar ligger hos eieren av publikasjonen. Den økonomiske støtten mottatt fra TÜBİTAK betyr ikke at innholdet i publikasjonen er godkjent i vitenskapelig forstand av TÜBİTAK. Forfatterne anerkjenner takknemlig bruken av tjenester og fasiliteter fra Koç University Research Center for Translational Medicine (KUTTAM). Figur 1 og figur 2a ble laget ved hjelp av Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ISOLAB | 64-17-5 | |
| Acetic acid | ISOLAB | 64-19-7 | |
| Alcian blue solution | Sigma-Aldrich | B8438 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Discovery HR-2 rheometer | TA Instruments | ||
| Entellan mounting medium | Merck | 107960 | |
| Eosin solution | Bright-slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-485 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich | 3002 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Mayer's haematoxylin staining solution | Merck | 2.BS01-103-1000 | |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biowest | L0018-100 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| Picric acid | Polysciences | 88-89-1 | |
| Sirius Red | Polysciences | 09400-25 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Triton-X-100 | Merck | 112298 |
References
- Zhu, X., et al. Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening. Mater Today Bio. 15, 100274 (2022).
- Ulldemolins, A., et al. Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair. Polymers. 14 (22), 4907 (2022).
- Biehl, A., et al. Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials. Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).
- Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix. Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
- Spang, M. T., Christman, K. L.
- Schwartz, A. D., et al. A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance. Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).
- Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).
- Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion. Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).
- Bual, R. P., Ijima, H. Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes. Regen Ther. 11, 258-268 (2019).
- Jhala, D., Vasita, R. A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche. Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).
- Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks. J Tissue Eng. 12, 2041731421997091 (2021).
- Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering. Materials. 13 (16), 3522 (2020).
- Won, J. Y., et al. A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).
- Lin, Z., et al. Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system. ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).
- Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression. Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity. Front Oncol. 8, 431 (2018).
- Takeda, M., et al. Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types. Sci Rep. 11 (1), 5654 (2021).
- Jensen, A. R. D., et al. Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis. Cancers (Basel). 13 (13), 3331 (2021).
- Kuşoğlu, A., et al. Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).
- Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Sci Rep. 9 (1), 14933 (2019).
- Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening. Cancers (Basel). 13 (16), 3930 (2021).
- Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization. Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).
- Roth, S. P., et al. Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study. BMC Biotechnol. 17 (1), 13 (2017).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Cox, T. R.
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
- Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
