该方案展示了小鼠肺静脉的显微镜引导分离和免疫荧光染色。我们制备包含左心房、肺静脉和相应肺的组织样本,并对它们进行心脏肌钙蛋白 T 和连接蛋白 43 染色。
肺静脉 (PV) 是房性心律失常中异位搏动的主要来源,在心房颤动 (AF) 的发生和进展中起着至关重要的作用。PV 包含由心肌细胞组成的心肌套管 (MS)。多发性硬化症与心房颤动的发生和维持有关,因为它们保留了与心脏工作心肌的相似性,包括产生异位电脉冲的能力。啮齿动物被广泛使用,并且可能代表研究肺静脉心肌的优秀动物模型,因为心肌细胞广泛存在于血管壁上。然而,由于器官体积小且解剖结构复杂,小鼠 PV 的精确显微解剖和制备具有挑战性。
我们展示了一种显微镜引导的显微解剖方案,用于将小鼠左心房 (LA) 与 PV 一起分离。 使用心脏肌钙蛋白-T (cTNT) 和连接蛋白 43 (Cx43) 抗体进行免疫荧光染色以全长观察 LA 和 PV。10 倍和 40 倍放大倍率的成像提供了 PV 结构的全面视图以及对心肌结构的详细见解,特别是突出了 MS 中连接蛋白 43 的存在。
心房颤动 (AF) 是最常见的持续性心律失常1。心房颤动的患病率进一步增加,预计 2060 年欧洲将有 ~1790 万患者1。心房颤动在临床上非常重要,因为它是发生心肌梗死、心力衰竭或卒中的重要危险因素,可导致巨大的个人、社会和社会经济负担1。尽管 AF 已为人所知数十年,但 AF 的病理生理学仍未完全了解2。
早在 1990 年代后期,研究表明肺静脉 (PV) 在启动和维持 AF 方面具有巨大影响,因为它们是触发 AF 的异位搏动的主要来源3。已经证明PV在结构上与其他血管不同。虽然典型的血管含有平滑肌细胞,但 PV 的被膜介质也含有心肌细胞4。在啮齿动物中,这种心脏肌肉组织普遍存在于整个 PV 中,包括肺内和肺外部分,以及孔口区域5。在人类中,PV 还含有心肌细胞,可以在左心房 (LA) 心肌的延伸部分(所谓的心肌套管 (MS)6,7 内观察到。
MS 与心房心肌8 具有形态相似性。心房和 PV 心肌细胞的形状和大小彼此之间没有显着差异,并显示出可比的电生理特性8。PV 内的电生理记录证实了 MS 的电活动,血管造影成像显示收缩与心跳同步 9,10。
间隙连接是由六个连接蛋白亚基组成的成孔蛋白复合物,它们允许离子和小分子通过11。间隙连接存在于细胞间对置中,使相邻的心肌细胞互连,并使心肌细胞之间的细胞间电偶联成为可能 12,13。几种连接蛋白亚型在心脏中表达,连接蛋白 43 (Cx43) 是在心脏14 的所有区域表达的最常见的亚型。先前的研究为 Cx43 在 PV 的心肌细胞中的表达提供了证据15,16。
由于其脆弱的结构,在完整的 PV 中研究 MS 仍然具有挑战性,尤其是在小动物模型中。在这里,我们演示了如何使用显微镜引导的显微切割来识别和分离小鼠的 PV 以及 LA 和肺叶。此外,我们还演示了 PV 的免疫荧光 (IF) 染色,以可视化 PV 内的心肌细胞及其相互连接。
通过该协议,我们分享了一种区分和分离小鼠心脏PV并对其进行免疫荧光染色的方法。摘取器官后,将心肺在灭菌蔗糖溶液中脱水,然后在显微镜引导下将心室与心房和肺叶分离。之后,准备心脏底座可视化 PV,然后将它们从肺门处的肺部切下。随后使用冷冻技术进行免疫荧光染色,将组织包埋在 O.C.T. 化合物中,用冷冻组切割,然后对 cTNT 和 Cx43 进行免疫荧光染色。
分离 PV …
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了德国心血管研究中心(DZHK;81X3600221到H.V.,81X2600255到S.C.),中国国家留学基金委员会(CSC201808130158到R.X.),德国研究基金会(DFG;血管医学临床科学家计划 (PRIME),MA 2186/14-1 至 PT)和科罗纳基金会(S199/10079/2019 至 SC)。
Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
Agarose | Biozym LE | 840104 | |
Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
DFC365FX camera | Leica | ||
DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
Dry ice | |||
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
Microwave | |||
Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |