小鼠肺静脉心肌套的显微解剖和免疫荧光染色
1University Hospital Munich, Department of Medicine I,Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex),LMU Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU),LMU Munich
Summary
该方案展示了小鼠肺静脉的显微镜引导分离和免疫荧光染色。我们制备包含左心房、肺静脉和相应肺的组织样本，并对它们进行心脏肌钙蛋白 T 和连接蛋白 43 染色。
Abstract
肺静脉 （PV） 是房性心律失常中异位搏动的主要来源，在心房颤动 （AF） 的发生和进展中起着至关重要的作用。PV 包含由心肌细胞组成的心肌套管 （MS）。多发性硬化症与心房颤动的发生和维持有关，因为它们保留了与心脏工作心肌的相似性，包括产生异位电脉冲的能力。啮齿动物被广泛使用，并且可能代表研究肺静脉心肌的优秀动物模型，因为心肌细胞广泛存在于血管壁上。然而，由于器官体积小且解剖结构复杂，小鼠 PV 的精确显微解剖和制备具有挑战性。
我们展示了一种显微镜引导的显微解剖方案，用于将小鼠左心房 （LA） 与 PV 一起分离。 使用心脏肌钙蛋白-T （cTNT） 和连接蛋白 43 （Cx43） 抗体进行免疫荧光染色以全长观察 LA 和 PV。10 倍和 40 倍放大倍率的成像提供了 PV 结构的全面视图以及对心肌结构的详细见解，特别是突出了 MS 中连接蛋白 43 的存在。
Introduction
心房颤动 （AF） 是最常见的持续性心律失常1。心房颤动的患病率进一步增加，预计 2060 年欧洲将有 ~1790 万患者1。心房颤动在临床上非常重要，因为它是发生心肌梗死、心力衰竭或卒中的重要危险因素，可导致巨大的个人、社会和社会经济负担1。尽管 AF 已为人所知数十年，但 AF 的病理生理学仍未完全了解2。
早在 1990 年代后期，研究表明肺静脉 （PV） 在启动和维持 AF 方面具有巨大影响，因为它们是触发 AF 的异位搏动的主要来源3。已经证明PV在结构上与其他血管不同。虽然典型的血管含有平滑肌细胞，但 PV 的被膜介质也含有心肌细胞4。在啮齿动物中，这种心脏肌肉组织普遍存在于整个 PV 中，包括肺内和肺外部分，以及孔口区域5。在人类中，PV 还含有心肌细胞，可以在左心房 （LA） 心肌的延伸部分（所谓的心肌套管 （MS）6,7 内观察到。
MS 与心房心肌8 具有形态相似性。心房和 PV 心肌细胞的形状和大小彼此之间没有显着差异，并显示出可比的电生理特性8。PV 内的电生理记录证实了 MS 的电活动，血管造影成像显示收缩与心跳同步 9,10。
间隙连接是由六个连接蛋白亚基组成的成孔蛋白复合物，它们允许离子和小分子通过11。间隙连接存在于细胞间对置中，使相邻的心肌细胞互连，并使心肌细胞之间的细胞间电偶联成为可能 12,13。几种连接蛋白亚型在心脏中表达，连接蛋白 43 （Cx43） 是在心脏14 的所有区域表达的最常见的亚型。先前的研究为 Cx43 在 PV 的心肌细胞中的表达提供了证据15,16。
由于其脆弱的结构，在完整的 PV 中研究 MS 仍然具有挑战性，尤其是在小动物模型中。在这里，我们演示了如何使用显微镜引导的显微切割来识别和分离小鼠的 PV 以及 LA 和肺叶。此外，我们还演示了 PV 的免疫荧光 （IF） 染色，以可视化 PV 内的心肌细胞及其相互连接。
Protocol
动物护理和所有实验程序均按照慕尼黑路德维希-马克西米利安大学动物护理和伦理委员会的指南进行，所有使用小鼠的程序均获得 Regierung von Oberbayern （ROB 55.2-2532） 的批准。Vet_02-20-215，ROB 55.2-2532。Vet_02-18-46，ROB 55.2-2532。Vet_02-19-86，ROB 55.2-2532。Vet_02-21-178，ROB 55.2-2532。Vet_02-22-170）。C57BL6/N小鼠是商业化获得的。 1. 准备工作 通过在 500 mL 锥形瓶中混合 3 mg …
Representative Results
我们对 10 只 12-16 周龄的小鼠进行了 PV 的显微解剖、染色和成像。按照该方案，我们成功地在所有实验小鼠中将PV与LA一起显微解剖，并获得了8只小鼠PV的全面视图。以 10 倍放大倍率拍摄概览图像，以识别 LA-PV 交界处的 PV 孔口 （PVO） 区域、肺外 PV （PVex）（肺门和 LA-PV 交界处之间的 PV）和肺内 PV （PVin）（被肺组织包围的 PV）（图 2）。上述区域的放大图?…
Discussion
通过该协议，我们分享了一种区分和分离小鼠心脏PV并对其进行免疫荧光染色的方法。摘取器官后，将心肺在灭菌蔗糖溶液中脱水，然后在显微镜引导下将心室与心房和肺叶分离。之后，准备心脏底座可视化 PV，然后将它们从肺门处的肺部切下。随后使用冷冻技术进行免疫荧光染色，将组织包埋在 O.C.T. 化合物中，用冷冻组切割，然后对 cTNT 和 Cx43 进行免疫荧光染色。
分离 PV …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了德国心血管研究中心（DZHK;81X3600221到H.V.，81X2600255到S.C.），中国国家留学基金委员会（CSC201808130158到R.X.），德国研究基金会（DFG;血管医学临床科学家计划 （PRIME），MA 2186/14-1 至 PT）和科罗纳基金会（S199/10079/2019 至 SC）。
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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Citer Cet Article
Villgrater, H. E., Xia, R., Sharma Chivukula, A., Tomsits, P., Clauss, S. Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins. J. Vis. Exp. (201), e65836, doi:10.3791/65836 (2023).