Mikrodissektion og immunofluorescensfarvning af myokardieærmer i murin lungevener
Summary
Denne protokol demonstrerer mikroskopi-guidet isolering og immunofluorescensfarvning af murin lungevener. Vi forbereder vævsprøver, der indeholder venstre atrium, lungevener og de tilsvarende lunger og pletter dem for hjerte-Troponin T og Connexin 43.
Abstract
Lungevener (PV’er) er den største kilde til ektopiske slag i atriale arytmier og spiller en afgørende rolle i udviklingen og progressionen af atrieflimren (AF). PV’er indeholder myokardieærmer (MS) sammensat af kardiomyocytter. MS er impliceret i initiering og vedligeholdelse af AF, da de bevarer ligheder med det hjertearbejdende myokardium, herunder evnen til at generere ektopiske elektriske impulser. Gnavere er meget udbredt og kan repræsentere fremragende dyremodeller til at studere lungevenens myokardium, da kardiomyocytter er bredt til stede over hele karvæggen. Imidlertid er præcis mikrodissektion og fremstilling af murin PV’er udfordrende på grund af den lille organstørrelse og indviklede anatomi.
Vi demonstrerer en mikroskopi-guidet mikrodissektionsprotokol til isolering af murin venstre atrium (LA) sammen med PV’erne. Immunofluorescensfarvning ved hjælp af hjerte-Troponin-T (cTNT) og connexin 43 (Cx43) antistoffer udføres for at visualisere LA og PV’er i fuld længde. Billeddannelse ved 10x og 40x forstørrelse giver et omfattende overblik over PV-strukturen samt detaljeret indsigt i myokardiearkitekturen, især fremhæver tilstedeværelsen af connexin 43 inden for MS.
Introduction
Atrieflimren (AF) er den mest almindelige vedvarende arytmi1. Forekomsten af AF stiger yderligere med et forventet antal ~ 17.9 millioner patienter i Europa i 20601. AF er klinisk meget vigtigt, da det er en væsentlig risikofaktor for udvikling af myokardieinfarkt, hjertesvigt eller slagtilfælde, hvilket resulterer i en enorm individuel, social og socioøkonomisk byrde1. Selvom AF har været kendt i årtier, er patofysiologien af AF stadig ikke fuldt ud forstået2.
Allerede i slutningen af 1990’erne viste undersøgelser den store virkning af lungevener (PV’er) i initiering og vedligeholdelse af AF, da de er den vigtigste kilde til AF-udløsende ektopiske slag3. Det er blevet påvist, at PV’er strukturelt adskiller sig fra andre blodkar. Mens typiske blodkar indeholder glatte muskelceller, indeholder tunikamediet af PV’er også kardiomyocytter4. Hos gnavere er denne hjertemuskulatur allestedsnærværende til stede i hele PV’erne, herunder intra- og ekstrapulmonale dele samt åbningsområdet5. Hos mennesker indeholder PV’er også kardiomyocytter, som kan observeres inden for forlængelser af venstre atriale (LA) myokardium-såkaldte myokardiehylstre (MS)6,7.
MS har morfologiske ligheder med atriel myokardium8. Formen og størrelsen af atriale og PV-kardiomyocytter varierer ikke signifikant mellem hinanden og viser sammenlignelige elektrofysiologiske egenskaber8. Elektrofysiologiske optagelser inden for PV har bevist den elektriske aktivitet af MS, og angiografisk billeddannelse har afsløret sammentrækninger synkroniseret med hjerteslag 9,10.
Gap junctions er poredannende proteinkomplekser sammensat af seks connexin underenheder, som tillader passage af ioner og små molekyler11. Gap-kryds findes i celle-til-celle-appositionerne, forbinder nabokardiomyocytter og muliggør en intercellulær elektrisk kobling mellem kardiomyocytter12,13. Flere connexin isoformer udtrykkes i hjertet med connexin 43 (Cx43) er den mest almindelige isoform udtrykt i alle regioner af hjertet14. Tidligere undersøgelser giver bevis for ekspression af Cx43 i kardiomyocytter af PV’erne15,16.
Det er fortsat udfordrende at undersøge MS inden for intakte solceller på grund af deres sarte struktur, især i små dyremodeller. Her demonstrerer vi, hvordan man identificerer og isolerer solceller sammen med LA og lungelapper i mus ved hjælp af mikroskopi-guidet mikrodissektion. Derudover demonstrerer vi immunofluorescens (IF) farvning af PV’er for at visualisere kardiomyocytter og deres sammenkoblinger inden for PV’erne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med denne protokol deler vi en metode til at skelne og isolere solcellerne i musehjertet og udføre immunfluorescensfarvning på dem. Efter organhøsten blev hjertet og lungerne dehydreret i steriliseret saccharoseopløsning, efterfulgt af adskillelse af ventriklerne fra atrium og lungelobes under mikroskopisk vejledning. Bagefter var hjertebasen parat til at visualisere PV’erne efterfulgt af at skære dem fra lungerne ved hilum. Den efterfølgende immunofluorescensfarvning blev udført ved hjælp af en kryoteknik ved at…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det tyske center for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X3600221til H.V., 81X2600255 til S.C.), China Scholarship Council (CSC201808130158 til R.X.), den tyske forskningsfond (DFG; Klinikerforskerprogram i vaskulær medicin (PRIME), MA 2186/14-1 til P. T.) og Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
