Murine फुफ्फुसीय नसों में मायोकार्डियल आस्तीन के Microdissection और immunofluorescence धुंधला हो जाना
Summary
यह प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोपी-निर्देशित अलगाव और म्यूरिन फुफ्फुसीय नसों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला को प्रदर्शित करता है। हम बाएं एट्रियम, फुफ्फुसीय नसों और संबंधित फेफड़ों वाले ऊतक के नमूने तैयार करते हैं और उन्हें कार्डियक ट्रोपोनिन टी और कॉन्नेक्सिन 43 के लिए दाग देते हैं।
Abstract
पल्मोनरी नसें (पीवी) अलिंद अतालता में एक्टोपिक बीट्स का प्रमुख स्रोत हैं और एट्रियल फाइब्रिलेशन (एएफ) के विकास और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। पीवी में कार्डियोमायोसाइट्स से बना मायोकार्डियल स्लीव्स (एमएस) होता है। एमएस को वायुसेना की दीक्षा और रखरखाव में फंसाया जाता है, क्योंकि वे कार्डियक वर्किंग मायोकार्डियम के लिए समानताएं संरक्षित करते हैं, जिसमें एक्टोपिक विद्युत आवेग उत्पन्न करने की क्षमता भी शामिल है। कृन्तकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और फुफ्फुसीय शिरा मायोकार्डियम का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं क्योंकि कार्डियोमायोसाइट्स व्यापक रूप से पोत की दीवार पर मौजूद हैं। हालांकि, छोटे अंग के आकार और जटिल शरीर रचना विज्ञान के कारण सटीक माइक्रोडिसेक्शन और म्यूरिन पीवी की तैयारी चुनौतीपूर्ण है।
हम पीवी के साथ एक साथ murine छोड़ दिया आलिंद अलग करने के लिए एक माइक्रोस्कोपी-निर्देशित microdissection प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. कार्डियक ट्रोपोनिन-टी (cTNT) और connexin 43 (Cx43) एंटीबॉडी का उपयोग कर immunofluorescence धुंधला पूर्ण लंबाई में ला और पीवी कल्पना करने के लिए किया जाता है. 10x और 40x आवर्धन पर इमेजिंग पीवी संरचना के व्यापक दृष्टिकोण के साथ-साथ मायोकार्डियल आर्किटेक्चर में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, विशेष रूप से एमएस के भीतर connexin 43 की उपस्थिति को उजागर करती है।
Introduction
आलिंद फिब्रिलेशन (एएफ) सबसे आम निरंतर अतालता1 है। वायुसेना का प्रसार 2060 में यूरोप में ~ 17.9 मिलियन रोगियों की अपेक्षित संख्या के साथ और भी बढ़ रहाहै। वायुसेना चिकित्सकीय रूप से अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मायोकार्डियल रोधगलन, दिल की विफलता, या स्ट्रोक के विकास के लिए एक आवश्यक जोखिम कारक है, जिसके परिणामस्वरूप एक विशाल व्यक्तिगत, सामाजिक और सामाजिक आर्थिक बोझहोता है। भले ही वायुसेना दशकों से जानी जाती है, वायुसेना के पैथोफिज़ियोलॉजी को अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है2.
पहले से ही 1990 के दशक के उत्तरार्ध में, अध्ययनों ने वायुसेना को शुरू करने और बनाए रखने में फुफ्फुसीय नसों (पीवी) के महान प्रभाव का प्रदर्शन किया, क्योंकि वे एएफ-ट्रिगरिंग एक्टोपिक बीट्स3 का मुख्य स्रोत हैं। यह प्रदर्शित किया गया है कि पीवी संरचनात्मक रूप से अन्य रक्त वाहिकाओं से भिन्न होते हैं। जबकि विशिष्ट रक्त वाहिकाओं में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं होती हैं, पीवी के ट्यूनिका मीडिया में कार्डियोमायोसाइट्सभी होते हैं। कृन्तकों में, यह हृदय की मांसलता पूरे पीवी में सर्वव्यापी रूप से मौजूद है, जिसमें इंट्रा- और एक्स्ट्रापल्मोनरी पार्ट्स, साथ ही छिद्र क्षेत्र5 शामिल हैं। मनुष्यों में, पीवी में कार्डियोमायोसाइट्स भी होते हैं, जिन्हें बाएं आलिंद (एलए) मायोकार्डियम-तथाकथित मायोकार्डियल स्लीव्स (एमएस)6,7के विस्तार के भीतर देखा जा सकता है।
एमएस में एट्रियल मायोकार्डियम8 के लिए रूपात्मक समानताएं हैं। आलिंद और पीवी कार्डियोमायोसाइट्स का आकार और आकार एक दूसरे के बीच काफी भिन्न नहीं होता है और तुलनीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण दिखाता है8. पीवी के भीतर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग ने एमएस की विद्युत गतिविधि को साबित कर दिया है, और एंजियोग्राफिक इमेजिंग ने दिल की धड़कन 9,10 के साथ सिंक्रनाइज़ संकुचन का खुलासा किया है।
गैप जंक्शन छह connexin subunits, जो आयनों और छोटे अणुओं11 के पारित होने की अनुमति देते हैं से बना ताकना बनाने प्रोटीन परिसरों हैं. गैप जंक्शन सेल-टू-सेल अपोजिशन में मौजूद हैं, पड़ोसी कार्डियोमायोसाइट्स को आपस में जोड़ते हैं, और कार्डियोमायोसाइट्स 12,13के बीच एक अंतरकोशिकीय विद्युत युग्मन को सक्षम करते हैं। कई connexin isoforms connexin के साथ दिल में व्यक्त कर रहे हैं 43 (Cx43) सबसे आम isoform दिल14 के सभी क्षेत्रों में व्यक्त किया जा रहा है. पिछले अध्ययन पीवी15,16 के कार्डियोमायोसाइट्स में सीएक्स 43 की अभिव्यक्ति के लिए सबूत प्रदान करते हैं।
यह बरकरार पीवी के भीतर एमएस की जांच करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनी हुई है क्योंकि उनकी नाजुक संरचना, विशेष रूप से छोटे पशु मॉडल में। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि माइक्रोस्कोपी-निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करके चूहों में एलए और फेफड़ों के लोब के साथ पीवी को कैसे पहचानें और अलग करें। इसके अतिरिक्त, हम पीवी के भीतर कार्डियोमायोसाइट्स और उनके अंतर्संबंधों की कल्पना करने के लिए पीवी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला प्रदर्शित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के साथ, हम माउस दिल के पीवी को अलग करने और अलग करने और उन पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए एक विधि साझा करते हैं। अंग की फसल के बाद, हृदय और फेफड़ों को निष्फल सुक्रोज समाधान में निर्जल…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम कार्डियोवास्कुलर रिसर्च के लिए जर्मन केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था (DZHK; 81X3600221to एचवी, 81X2600255 एससी के लिए), चीन छात्रवृत्ति परिषद (CSC201808130158 आरएक्स के लिए), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG; संवहनी चिकित्सा में क्लिनिशियन साइंटिस्ट प्रोग्राम (PRIME), MA 2186/14-1 से P. T.), और कोरोना फाउंडेशन (S199/10079/2019 से S. C.)।
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
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