Выделение внеклеточных везикул из биожидкостей на основе химического сродства для анализа протеомики и фосфопротеомики
Summary
Настоящий протокол содержит подробное описание эффективного выделения внеклеточных пузырьков мочи с использованием функционализированных магнитных шариков. Кроме того, он включает в себя последующие анализы, включая вестерн-блоттинг, протеомику и фосфопротеомику.
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) из биожидкостей в последнее время привлекли значительное внимание в области жидкостной биопсии. Высвобождаемые почти каждым типом клеток, они обеспечивают моментальный снимок клеток-хозяев в режиме реального времени и содержат множество молекулярной информации, включая белки, в частности, с посттрансляционными модификациями (PTM), такими как фосфорилирование, как основной игрок клеточных функций, а также возникновения и прогрессирования заболевания. Тем не менее, изоляция электромобилей от биожидкостей остается сложной задачей из-за низкого выхода и примесей от существующих методов изоляции электромобилей, что затрудняет последующий анализ грузов электромобилей, таких как фосфопротеины электромобилей. В этой статье мы опишем быстрый и эффективный метод выделения ВВ, основанный на функционализированных магнитных шариках для выделения ВВ из биожидкостей, таких как моча человека, а также анализ последующей протеомики и фосфопротеомики после выделения ВВ. Протокол обеспечил высокую рекуперацию ВВ в моче и чувствительные профили протеома и фосфопротеома ВВ. Кроме того, здесь рассматриваются универсальность этого протокола и соответствующие технические соображения.
Introduction
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные наночастицы, секретируемые всеми типами клеток и присутствующие в биожидкостях, таких как кровь, моча, слюна и т. д.1,2,3,4. ВВ несут груз разнообразных биологически активных молекул, которые отражают физиологическое и патологическое состояние клеток-хозяев и, следовательно, функционируют как решающие факторы в прогрессировании заболевания 4,5,6. Более того, обширные исследования установили, что маркеры заболевания, основанные на ВВ, могут быть идентифицированы до появления симптомов или физиологического обнаружения опухолей 5,6,7.
Фосфорилирование действует как ключевой механизм клеточной сигнализации и регуляции. Таким образом, фосфопротеины являются ценным источником для обнаружения биомаркеров, поскольку аберрантные события фосфорилирования связаны с нарушением регуляции клеточных сигнальных путей и развитием метастатических заболеваний, таких как рак 8,9,10. Несмотря на то, что профилирование динамики фосфорилирования позволяет идентифицировать специфичные для заболевания сигнатуры фосфопротеинов в качестве потенциальных биомаркеров, низкая распространенность и динамический характер фосфопротеинов создают серьезные проблемы при разработке фосфопротеинов в качестве биомаркеров11,12. Примечательно, что малораспространенные фосфопротеины, инкапсулированные в ВВ, защищены от внешнего ферментативного расщепления во внеклеточной среде8. Следовательно, ВВ и фосфопротеины, полученные из ВВ, являются идеальным источником для обнаружения биомаркеров при выявлении рака и других заболеваний на ранних стадиях.
Несмотря на то, что анализ фосфорилирования белков в ВВ является ценным ресурсом для понимания сигнализации рака и диагностики заболевания на ранних стадиях, отсутствие эффективных методов выделения ВВ представляет собой серьезное препятствие. Изоляция EV обычно достигается с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (DUC)13. Однако этот метод занимает много времени и не подходит для клинических исследований из-за низкой пропускной способности и плохой воспроизводимости13,14. Альтернативные подходы к выделению ВВ, такие как полимер-индуцированное осаждение15, ограничены низкой специфичностью из-за совместного осаждения белков, не относящихся к ВВ. Подходы, основанные на аффинити, включая аффинный захват на основе антител16 и аффинную фильтрацию17, обеспечивают повышенную специфичность, но ограничены относительно низкой скоростью восстановления из-за малого объема.
Для решения проблем, связанных с изучением динамики фосфопротеинов в ВВ, наша группа разработала метод полного восстановления и очистки внеклеточных везикул (EVtrap), основанный на химическом сродстве для захвата ВВ на функционализированных магнитных шариках18. Предыдущие результаты показали, что этот метод изоляции ВВ на основе магнитных шариков очень эффективен при выделении ВВ из широкого спектра образцов биожидкости и способен достичь гораздо более высокого выхода ВВ при минимизации загрязнения по сравнению с DUC и другими существующими методами изоляции18,19. Мы успешно использовали EVtrap и метод обогащения фосфопептидами на основе титана, разработанный нашей группой20, для профилирования фосфопротеома ВВ, полученных из различных биожидкостей, и для обнаружения потенциальных фосфопротеиновых биомаркеров для различных заболеваний 19,21,22.
Здесь мы представляем протокол на основе EVtrap для изоляции циркулирующих электромобилей. Протокол фокусируется на ВВ мочевыводящих путей. Мы также демонстрируем характеристику изолированных ВВ с помощью вестерн-блоттинга. Затем мы подробно описываем подготовку образцов и сбор данных с помощью масс-спектрометрии (МС) как для протеомики, так и для фосфопротеомного анализа. Этот протокол обеспечивает эффективный и воспроизводимый рабочий процесс для профилирования протеома и фосфопротеома ВВ мочи, что будет способствовать дальнейшим исследованиям ВВ и их клиническому применению23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективная изоляция ВВ является необходимой предпосылкой для обнаружения малораспространенных белков и фосфопротеинов в ВВ. Несмотря на разработку многочисленных методов для удовлетворения этой потребности, большинство из них по-прежнему страдают от ограничений, таких как плохое ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично профинансирована грантами NIH 3RF1AG064250 и R44CA239845.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
- Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
