プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

Summary

本プロトコルは、機能化された磁気ビーズを利用して尿中細胞外小胞を効率的に隔離するための詳細な説明を提供します。さらに、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、リン酸化プロテオミクスなどのその後の分析も網羅しています。

Abstract

生体液由来の細胞外小胞(EV)は、近年、リキッドバイオプシーの分野で大きな注目を集めています。ほぼすべての種類の細胞から放出され、宿主細胞のリアルタイムスナップショットを提供し、細胞機能や疾患の発症および進行の主要なプレーヤーとして、タンパク質、特にリン酸化などの翻訳後修飾(PTM)を持つタンパク質を含む豊富な分子情報が含まれています。しかし、現在のEV単離法では収率や不純物が少ないため、生体液からのEVの単離は依然として困難であり、EVリン酸化タンパク質などのEV貨物の下流分析は困難です。ここでは、ヒト尿などの生体液からのEV単離のための官能基化磁気ビーズに基づく迅速で効果的なEV単離法と、EV単離後の下流プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析について説明します。このプロトコルにより、尿中EVの高い回収率と、EVプロテオームおよびリン酸化プロテオームの高感度プロファイルが可能になりました。さらに、このプロトコルの汎用性と関連する技術的考慮事項についてもここで説明します。

Introduction

細胞外小胞(EV)は、あらゆる種類の細胞から分泌される膜内包ナノ粒子であり、血液、尿、唾液などの体液中に存在します1,2,3,4。EVは、宿主細胞の生理学的および病理学的状態を反映する多様な生理活性分子の貨物を運んでいるため、疾患の進行における重要な要因として機能します^4,5,6。さらに、広範な研究により、症状の発症または腫瘍の生理学的検出の前に、EVベースの疾患マーカーを特定できることが確立されています^5,6,7。

リン酸化は、細胞のシグナル伝達と調節における重要なメカニズムとして作用します。したがって、リン酸化タンパク質は、異常なリン酸化イベントが細胞シグナル伝達経路の調節不全や癌などの転移性疾患の発症と関連しているため、バイオマーカー発見のための貴重な情報源を提供します^8,9,10。リン酸化動態のプロファイリングにより、疾患特異的なリン酸化タンパク質シグネチャーを潜在的なバイオマーカーとして同定することができますが、リン酸化タンパク質の存在量が少なく、動的な性質は、バイオマーカーとしてのリン酸化タンパク質の開発において大きな課題となっています^11,12。特に、EV内に内包された低存在量のリン酸化タンパク質は、細胞外環境での外部酵素消化から保護されています⁸。したがって、EVおよびEV由来のリン酸化タンパク質は、がんやその他の疾患の早期発見におけるバイオマーカー発見の理想的な情報源となります。

EVにおけるタンパク質のリン酸化の解析は、がんのシグナル伝達と早期疾患診断を理解するための貴重なリソースを提供しますが、効率的なEV分離法の欠如が大きな障壁となっています。EVの絶縁は、通常、差動超遠心分離(DUC)によって実現されます¹³。しかし、この方法は時間がかかり、スループットが低く再現性が低いため、臨床的な意味合いには適していません^13,14。ポリマー誘起沈殿¹⁵などの代替EV単離アプローチは、非EVタンパク質の共沈による特異性の低さによって制限される。抗体ベースのアフィニティー捕捉¹⁶ やアフィニティー濾過¹⁷ などのアフィニティーベースのアプローチは、特異性を高めますが、容量が少ないため、回収率が比較的低く制限されます。

EVのリン酸化蛋白質動態を探る上での課題を解決するため、当グループでは、EVを機能性磁気ビーズに捕捉する化学的親和性に基づく細胞外小胞全回収精製(EVtrap)技術を開発しました¹⁸。これまでの結果から、この磁気ビーズベースのEV分離法は、幅広い生体液サンプルからEVを分離するのに非常に効果的であり、DUCや他の既存の分離方法と比較して、汚染を最小限に抑えながらはるかに高いEV収率を達成できることが実証されています^18,19。私たちは、EVtrapと私たちのグループによって開発されたチタンベースのリン酸化ペプチド濃縮法を利用することに成功しました²⁰ 多様な生体液に由来するEVのリン酸化プロテオームをプロファイリングし、さまざまな疾患の潜在的なリン酸化タンパク質バイオマーカーを検出します19,21,22。

ここでは、流通するEVを分離するためのEVtrapに基づくプロトコルを紹介します。このプロトコルは、尿路EVに焦点を当てています。また、ウェスタンブロッティングを用いた絶縁型EVの特性評価についても実証しています。次に、プロテオミクス分析とリン酸化プロテオミクス分析の両方のためのサンプル調製と質量分析(MS)取得について詳しく説明します。このプロトコルは、尿中EVプロテオームとリン酸化プロテオームをプロファイリングするための効率的で再現性のあるワークフローを提供し、EVとその臨床応用に関するさらなる研究を促進します²³。

Protocol

すべての尿サンプルは、インフォームドコンセント後に健康な個人から収集されました。実験は、ヒトサンプルを含むすべての倫理基準に準拠しており、パデュー大学ヒト研究保護プログラムのガイドラインに準拠しています。 1. 検体採取 15 mLのコニカル遠心チューブで12 mLの尿サンプルを2,500 x g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞の破片や大きな…

Representative Results

このプロトコールは、EVの単離から下流のプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析までの包括的なワークフローを実証します(図1)。三重の尿サンプルはEV分離にかけられた。単離されたEVは、ウェスタンブロッティングによって特徴付けられ、その後、タンパク質抽出、酵素消化、ペプチドクリーンアップなどの質量分析ベースのプロテオミクスサンプル調製?…

Discussion

EVの効果的な単離は、EV中の低存在量のタンパク質やリン酸化タンパク質を検出するために不可欠な前提条件です。このニーズを満たすための多くの方法が開発されているにもかかわらず、大多数は依然として回収率の低下や再現性の低さなどの制限に悩まされており、大規模な研究や日常的な臨床現場での利用を妨げています。DUCは一般にEV分離の最も一般的な方法と見なされており、通常?…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007