Herstellung einer Einzelzellsuspension aus den Halsschlagadern der Maus für die Einzelzellsequenzierung
Summary
Hier beschreiben wir ein zweistufiges Zellverdauungsprotokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension von Maus-Halsschlagadern.
Abstract
Carotis-Arterien sind wichtige Blutgefäße im Hals, die das Gehirn mit Blut und Sauerstoff versorgen, aber eine Carotisstenose tritt auf, wenn die Halsschlagadern durch Plaque verstopft sind. Die Aufdeckung der zellulären Zusammensetzung der Halsschlagader auf Einzelzellebene ist für die Behandlung der Arteriosklerose der Halsschlagader unerlässlich. Es gibt jedoch kein gebrauchsfertiges Protokoll für die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Halsschlagadern. Um ein geeignetes Protokoll für die Dissoziation normaler Halsschlagadern auf Einzelzellebene mit weniger Zellschädigung zu erhalten, haben wir eine zweistufige Verdauungsmethode entwickelt, indem wir den Verdauungsprozess von Kollagenase/DNase und Trypsin integrieren. Die duale Fluoreszenzzählung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen zu bestimmen, und es wurde festgestellt, dass die Einzelzellsuspension die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration. Nach der Einzelzell-Datenverarbeitung wurde in jeder Halsschlagaderzelle ein Median von ~2500 Transkripten pro Zelle detektiert. Bemerkenswert ist, dass eine Vielzahl von Zelltypen der normalen Halsschlagader, einschließlich vaskulärer glatter Muskelzellen (VSMCs), Fibroblasten, Endothelzellen (ECs) sowie Makrophagen und dendritische Zellen (Mφ/DCs), gleichzeitig nachweisbar waren. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um eine einzellige Suspension von Blutgefäßen aus anderen Geweben mit entsprechenden Modifikationen herzustellen.
Introduction
Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die mit Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Hyperlipidämie und Hämodynamik einhergeht1. Die Verzweigungen der Halsschlagader sind anfällig für hämodynamische Veränderungen und führen zur Bildung von Halsschlagadern. Das klinische Erscheinungsbild der Carotis-Atherosklerose kann akut wie Schlaganfall und vorübergehende zerebrale Ischämie oder chronisch wie rezidivierende transiente zerebrale Ischämie und vaskuläre Demenzsein 2. Mechanisch gesehen ist die Halsschlagader das Ergebnis der Interaktion zwischen verschiedenen Gefäßwandzellen und verschiedenen Blutzellen unter pathologischen Bedingungen. Daher ist die Freilegung des einzelligen Atlas der Halsschlagader unter physiologischen und pathologischen Bedingungen besonders wichtig für die Vorbeugung und Behandlung der Entwicklung von Halsschlagadern.
Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist aufgrund ihrer ultrahohen Auflösung und des Nachweises der Zellheterogenität desselben Zelltyps von Organismen eine der leistungsfähigsten Technologien der biologischen Forschung 3,4. Forscher haben die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet, um Forschung in vielen Bereichen durchzuführen, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen5 und Krebs6. Die schnelle und genaue Trennung von Geweben in einzelne Zellen ist jedoch immer noch eine der größten Herausforderungen. Die enzymatische Dissoziation ist eine häufig verwendete Methode, die hauptsächlich Kollagenase, Papain, Trypsin, DNase und Hyaluronidase umfasst. Insbesondere Kollagenasen sind die wichtigsten Enzymspezies für die Einzelzellverdauung, die hauptsächlich Kollagenkomponenten im Bindegewebe hydrolysiert. Verschiedene Kollagenasetypen sind für die Dissoziation verschiedener Gewebe geeignet, wie z. B. der Brustdrüse7, des Glomerulus8, des Iridokornealwinkels9, des Kniegelenks10, der Aorta 11 und der Lunge12. Aufgrund der einzigartigen physiologischen Eigenschaften verschiedener Gewebe kann die Dissoziation mit der gleichen Methode viele Probleme bei der Erfassung einzelner Zellen verursachen, wie z. B. eine geringe Zelllebensfähigkeit, eine geringe Zellzahl und große Zelltrümmer. Daher ist die Erfindung von Aufschlussmethoden für verschiedene Gewebe für die Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen unerlässlich.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine zweistufige Zellverdauungsmethode zu entwickeln, um eine Einzelzellsuspension der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen herzustellen. Entsprechend den Eigenschaften der Halsschlagader kombinierten wir Kollagenase/DNase mit Trypsin, um eine hochwertige Einzelzellsuspension der Halsschlagader der Maus zu erhalten, da Kollagenase Kollagen des Halsschlagaders hydrolysieren kann, das durch Trypsin zu einer Einzelzellsuspension weiter verdaut wurde. Die duale Fluoreszenzzählung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen zu bestimmen, und es wurde festgestellt, dass die Einzelzellsuspension die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration. Nach der Verarbeitung von Einzelzelldaten wurden vier Zelltypen, darunter vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs), Fibroblasten, Endothelzellen (ECs) sowie Makrophagen und dendritische Zellen (Mφ/DCs), in normalen Halsschlagadern der Maus nach der Verdauung identifiziert. Die Vorteile dieses Protokolls sind: 1) mehrere Zelltypen in der Halsschlagader identifiziert werden können, 2) die Zelllebensfähigkeit gut erhalten bleibt und 3) es ohne spezielle Ausrüstung leicht wiederholt werden kann. Dieses Protokoll eignet sich für Forscher, die daran interessiert sind, Einzelzell-Multiomics der Halsschlagadern der Maus zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auch bei der Dissoziation anderer Blutgefäße mit entsprechenden Modifikationen hilfreich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen zur Verfügung, in dem eine zweistufige Verdauungsmethode entwickelt wurde, die den Verdauungsprozess von Kollagenase/DNase und Trypsin integriert. Nach der Qualitätsprüfung der Einzelzellsuspension stellten wir fest, dass sie die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Natural Science Foundation of China (82070450 an C.T. und 82170466 an L.Z.) und das Stipendium der China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 an F.L.) unterstützt.
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
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