Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’artères carotides de souris pour le séquençage unicellulaire

Résumé

Nous décrivons ici un protocole de digestion cellulaire en deux étapes pour la préparation d’une suspension unicellulaire des artères carotides de souris.

Résumé

Les artères carotides sont les principaux vaisseaux sanguins du cou qui fournissent du sang et de l’oxygène au cerveau, mais la sténose carotidienne se produit lorsque les artères carotides sont obstruées par la plaque. La mise en évidence de la composition cellulaire de l’artère carotide au niveau unicellulaire est essentielle pour traiter l’athérosclérose carotidienne. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour la préparation de suspensions unicellulaires à partir des artères carotides. Afin d’obtenir un protocole approprié pour la dissociation des artères carotides normales au niveau unicellulaire avec moins de dommages aux cellules, nous avons conçu une méthode de digestion en deux étapes en intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine. Le comptage par double fluorescence orange acridine/iodure de propidium (AO/PI) a été utilisé pour détecter la viabilité et la concentration cellulaires, et il a été constaté que la suspension unicellulaire répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85 % et une concentration cellulaire élevée. Après le traitement des données sur une seule cellule, une médiane de ~2500 transcrits par cellule a été détectée dans chaque cellule de l’artère carotide. Notamment, une variété de types de cellules de l’artère carotide normale, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les fibroblastes, les cellules endothéliales (CE) et les macrophages et les cellules dendritiques (Mφ / DC), étaient détectables simultanément. Ce protocole peut être appliqué pour préparer une suspension unicellulaire de vaisseaux sanguins provenant d’autres tissus avec les modifications appropriées.

Introduction

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique associée à des facteurs de risque tels que l’hypertension artérielle, l’hyperlipidémie et l’hémodynamique¹. Les bifurcations de l’artère carotide sont sujettes à des changements hémodynamiques et entraînent la formation de plaques carotidiennes. La présentation clinique de l’athérosclérose carotidienne peut être aiguë comme un accident vasculaire cérébral et une ischémie cérébrale transitoire, ou chronique comme une ischémie cérébrale transitoire récurrente et une démence vasculaire². Mécaniquement, la plaque carotidienne est le résultat de l’interaction entre diff....

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Soochow.

1. Préparation des réactifs et des matériaux

1. Utilisez 1x PBS sans calcium ni magnésium et 2,5 U/mL de sel d’héparine sodique pour préparer la solution de perfusion. Conserver à 4 °C et prérefroidir sur glace lorsqu’il est utilisé.
2. Préparer le réactif de dissociation A qui contient 125 CDU/mL de collagénase II et 60 U/mL de DNase I en diluant 1250 CDU/mL de collagénase II et 3000 U/mL de DNase I avec HBSS. Conserver à 4 °C jusqu’à uti....

Résultats

Ce protocole décrit une méthode de digestion cellulaire en deux étapes pour la préparation d’une suspension unicellulaire des artères carotides de souris (Figure 1). Cette méthode de digestion cellulaire en deux étapes combine la collagénase/DNase avec la trypsine pour dissocier efficacement la paroi vasculaire carotidienne de la souris afin d’obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité pour le séquençage unicellulaire. Après dissociation, la concentration cellulaire et la viabil.......

Discussion

Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité à partir de l’artère carotide de souris de type sauvage, dans lequel une méthode de digestion en deux étapes intégrant le processus de digestion de la collagénase/DNase et de la trypsine a été construite. Après le contrôle de la qualité de la suspension unicellulaire, nous avons constaté qu’elle répondait aux exigences du séquençage unicellulaire, avec une viabilité des cellules supérieure à 85% et une concentra.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Trypsine sans EDTA à 0,25 %	Beyotime	C0205	Diluez 1 mL de trypsine sans EDTA à 0,25 % dans 1 mL de 1x PBS.
Solution saline de NaCl à 0,9 %	Beyotime	ST341	Diluer la solution d’héparine sodique en une concentration finale de 10 mg/mL
seringues de 1 mL	. SKJYLEAN	sk-r009	Pour effectuer une perfusion cardiaque
Tubes à centrifuger de 1,5 mL	KIRGEN	KG2211W	Pour centrifuger le morceau de tissu et la suspension cellulaire
Seringues de 20 mL	SKJYLEAN	sk-r013	Pour effectuer une perfusion cardiaque
40 µ ; Filtre à cellules m	JETBIOFIL	css010040	Pour filtrer les fragments de tissus non digérés
Kit AO/PI	Hengrui	Biological RE010212	Pour identifier si la cellule est vivante ou morte
Compteur de cellules automatisé	Countstar	Mira FL	Pour analyser la morphologie cellulaire et la viabilité cellulaire des cellules vasculaires carotidiennes digérées
Logiciel Cell Ranger	10× ; Génomique	3.0.2	Pour traiter la sortie de séquençage de l’ARN unicellulaire de chrome et effectuer des analyses de clustering et d’expression génique
Kits de réactifs 3 cellules uniques de chrome v3	10& fois ; Génomique	1000075	Pour préparer des banques de séquençage d’ARN unicellulaire de suspension unicellulaire
Collénase II	Sigma-Aldrich	C6885	Diluer avec HBSS jusqu’à une concentration finale de 125 CDU/mL
Déoxyribonucléase I	Worthington	LS002140	Diluer avec HBSS jusqu’à une concentration finale de 60 U/mL
Sérum fœtal bovin  ;	HyClone	SH30088.03	Terminaison de la réaction de digestion
Solution saline équilibrée de Hank  ;	Gibco	14175095	Stocker à température ambiante
Héparine sel sodique	Solarbio Life Science	H8060	Diluer avec 0,9 % de NaCl jusqu’à une concentration finale de 10 mg/mL
Microcentrifugeuse	Thermo Fisher Scientific	75002560	Appliqué pour la rotation des tissus et des granules cellulaires
NovaSeq 6000  ;	Séquenceur	Illumina	N/A
Solution saline tamponnée au phosphate	Solarbio Life Science	P1000	Utilisé pour la perfusion cardiaque et la remise en suspension de cellules
Seurat package- R	Satija Lab	3.1.2	Pour effectuer la réduction de la dimensionnalité, la visualisation et l’analyse des données de séquençage de l’ARNsc
Plaques de culture cellulaire à six puits	NEST	703002	Placer le tissu vasculaire
Bain-marie	Jinghong	DK-S22	Maintenir la température de digestion à 37 ° ; L