JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

Abstract

נשאי מומסים (SLC) הם מובילי ממברנות המייבאים ומייצאים מגוון מצעים אנדוגניים ואקסוגניים, כולל יונים, חומרים מזינים, מטבוליטים, מוליכים עצביים ותרופות. למרות שהתגלו כמטרות טיפוליות אטרקטיביות וסמנים של מחלות, קבוצה זו של חלבונים עדיין מסוממת יחסית על ידי התרופות הנוכחיות. פרויקטים של גילוי תרופות עבור טרנספורטרים אלה מעוכבים על ידי ידע מבני, פונקציונלי ופיזיולוגי מוגבל, בסופו של דבר בשל הקשיים בביטוי וטיהור של סוג זה של חלבונים משובצים בקרום. כאן, אנו מדגימים שיטות להשגת כמויות מיליגרם טהורות במיוחד של חלבוני טרנספורטר SLC אנושיים באמצעות רצפי גנים ממוטבים לקודון. בשילוב עם חקירה שיטתית של תכנון מבנים וביטוי תפוקה גבוהה, פרוטוקולים אלה מבטיחים את שימור השלמות המבנית והפעילות הביוכימית של חלבוני המטרה. אנו גם מדגישים שלבים קריטיים בביטוי תאים אאוקריוטיים, טיהור זיקה וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל של חלבונים אלה. בסופו של דבר, תהליך עבודה זה מניב תכשירי חלבון טהורים, פעילים פונקציונלית ויציבים המתאימים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה, מחקרי הובלה, מבחני מעורבות מולקולות קטנות וסינון במבחנה בתפוקה גבוהה.

Introduction

חלבוני ממברנה הם כבר זמן רב מטרות לחוקרים ולתעשיות התרופות כאחד. מתוכם, נשאי המומסים (SLCs) הם משפחה של למעלה מ-400 גנים טרנספורטרים משניים המקודדים בתוך הגנום האנושי1. מובילים אלה מעורבים ביבוא וייצוא של מולקולות רבות, כולל יונים2, מוליכים עצביים3, שומנים 4,5,6,7, חומצות אמינו 8, חומרים מזינים 9,10,11, ותרופות 12. עם רוחב כזה של מצעים, חלבונים אלה מעורבים גם במגוון של פתופיזיולוגיות באמצעות הובלת רעלים13, הובלה ועיכוב על ידי סמים של התעללות 14,15, או מוטציות מזיקות16. הומולוגים חיידקיים שימשו כאבות-טיפוס למנגנון ההובלה הבסיסי של מספר משפחות SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. בניגוד לחלבונים אנושיים, אורתולוגים פרוקריוטים לרוב באים לידי ביטוי טוב יותר במערכת הביטוי Escherichia coli 26,27 המובנת היטב והם יציבים יותר בדטרגנטים הקטנים יותר המניבים גבישים מסודרים היטב לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן 28. עם זאת, רצף והבדלים פונקציונליים מסבכים את השימוש בחלבונים מרוחקים אלה לגילוי תרופות29,30. כתוצאה מכך, מחקר ישיר של החלבון האנושי נדרש לעתים קרובות כדי לפענח את מנגנון הפעולה של תרופות המכוונות SLCs 31,32,33,34,35. בעוד שההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (Cryo-EM) אפשרה אפיון מבני של SLCs בתנאים דומים יותר לילידים36,37, קושי לבטא ולטהר חלבונים אלה נותר אתגר לפיתוח טיפולים ואבחון ממוקדים.

כדי להקל על אתגר זה, קונסורציום RESOLUTE (re-solute.eu) פיתח משאבים ופרוטוקולים לביטוי וטיהור בקנה מידה גדול של חלבונים אנושיים ממשפחת SLC38. החל מגנים המותאמים לקודון, פיתחנו שיטות לשיבוט וסינון בעלי תפוקה גבוהה של מבני SLC. שיטות אלה יושמו באופן שיטתי על כל משפחת SLCs, הגנים שובטו למערכת הביטוי הנגיפי BacMam, וביטוי החלבונים נבדק בקווי תאים אנושיים39 בהתבסס על שיטות שתוארו קודם לכן לשיבוט בתפוקה גבוהה ובדיקת ביטוי40. לסיכום, הגן SLC משובט מפלסמיד pDONR221 לווקטור pHTBV1.1. מבנה זה משמש לאחר מכן לטרנספורמציה של הגן המעניין לווקטור bacmid להעברת תאי חרקים, הכולל מקדם ציטומגלווירוס ואלמנטים משפרים לביטוי בתאי יונקים. הבקולווירוס המתקבל יכול לשמש להתמרה של תאי יונקים לביטוי של חלבון SLC המטרה.

בהמשך פיתחנו שיטות סטנדרטיות לביטוי בקנה מידה גדול וטיהור יציב של SLCs נבחרים (איור 1). פרוטוקול זה כולל נקודות ביקורת מרובות כדי להקל על פתרון בעיות יעיל ולמזער את השונות בין ניסויים. יש לציין כי ניטור שגרתי של ביטוי ולוקליזציה של חלבונים, כמו גם אופטימיזציה בקנה מידה קטן של תנאי טיהור עבור מטרות בודדות, נעזרו בתגי Strep וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)41,42.

בסופו של דבר, דגימות חלבון טהורות כימית והומוגניות מבחינה מבנית אלה יכולות לשמש לקביעה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron (Cryo-EM), בדיקות ביוכימיות של מעורבות מטרות, חיסון ליצירת קלסרים, ומחקרים פונקציונליים ללא תאים באמצעות בנייה מחדש לליפוזומים מוגדרים כימית.

Protocol

הערה: כל הגנים RESOLUTE SLC הממוטבים לקודון הופקדו ב- AddGene43, שהקישורים אליהם זמינים ברשימת הריאגנטים הציבוריים של RESOLUTE44. גנים אלה שובטו לתוך פלסמיד pDONR221 ומאפשרים שיבוט ישיר של הגנים לווקטור היעד באמצעות שיבוט רקומבינציה45. כדי למקסם את המקביליות, תאים חייד?…

Representative Results

ניתן לשכפל גנים SLC מפלסמידים pDONR נחושים לווקטורים BacMam לביטוי יונקיםהפרוטוקולים המתוארים לשיבוט, ביטוי וטיהור הוכיחו את עצמם כמוצלחים עבור מובילי SLC רבים על פני קפלי חלבון מרובים. עם זאת, הנהלים כוללים מספר נקודות ביקורת לניטור ההתקדמות, המאפשרים אופטימיזציה כדי להסביר הבדלים ב…

Discussion

הפיתוח של טיפולים ממוקדי SLC נותר מעוכב בשל היעדר אפיון שיטתי של תפקוד הטרנספורטר. זה הוביל לפחות תרופות באופן לא פרופורציונלי המכוונות לקבוצת חלבונים זו ביחס ל- GPCRs ותעלות יונים63, למרות תפקידיהן הרבים בתהליכים נורמליים ופתופיזיולוגיים. RESOLUTE הוא קונסורציום בינלאומי שמטרתו לפ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו בוצעה במסגרת פרויקט RESOLUTE. RESOLUTE קיבלה מימון מההתחייבות המשותפת Innovative Medicines Initiative 2 במסגרת הסכם מענק מספר 777372. התחייבות משותפת זו מקבלת תמיכה מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי ומ- EFPIA. מאמר זה משקף רק את עמדות המחברים ולא תעש ולא האיחוד האירופי ו-EFPIA אחראים לכל שימוש שעשוי להיעשות במידע הכלול בו. פלסמיד pHTBV סופק באדיבות על ידי פרופ’ פרדריק בויס (הרווארד).

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -. N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl–dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. . Resolute Public Reagents Available from: https://re-solute.eu/resources/reagents (2023)
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -. N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochimie. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -. P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Keywords: Solute CarriersSLCsMembrane TransportersDrug DiscoveryHigh-throughput ExpressionProtein PurificationStructural StudiesBiochemical StudiesReSOLUTEBacMam Expression SystemCryo-EM
check_url/fr/65878?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image