אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo
Summary
בקטריופאג’ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.
Abstract
בקטריופאג’ים (פאג’ים) הם וירוסים שמדביקים חיידקים ברמת המינים והזנים, והם הישויות הביולוגיות הנפוצות ביותר בכל המערכות האקולוגיות הידועות. בתוך קהילות חיידקים, כמו אלה שנמצאות במיקרוביוטה של המעיים, פאגים מעורבים בוויסות הדינמיקה של אוכלוסיית המיקרוביוטה ובהנעת אבולוציה חיידקית. בעשור האחרון התעורר עניין מחודש במחקר פאגים, בין השאר הודות ליכולות ההרג הספציפיות לפונדקאי של פאגים ליטיים, המציעים כלי מבטיח נגד האיום הגובר של חיידקים עמידים מיקרוביאלית. יתר על כן, מחקרים אחרונים המוכיחים כי פאגים נצמדים לליחה במעי מצביעים על כך שייתכן שיש להם תפקיד מגן במניעת פלישת חיידקים לאפיתל הבסיסי. חשוב לציין, שבדומה למיקרוביום חיידקי, פגיאומים משובשים נקשרו להחמרה בתוצאות במחלות כמו מחלות מעי דלקתיות. מחקרים קודמים הראו כי פאגים יכולים לווסת את המיקרוביום של בעלי חיים ובני אדם באמצעות השתלות תסנין צואה, מה שיועיל לבריאות הפונדקאי. עם גל המחקר האחרון מגיע הצורך לבסס ולתקנן פרוטוקולים לחקר פאגים בהקשר של מיקרוביום המעי. פרוטוקול זה מספק סדרה של נהלים לחקר פאגים מבודדים מסוג T4 והפונדקאי החיידקי שלהם, Escherichia coli, בהקשר של מערכת העיכול של מורין. השיטות המתוארות כאן מתארות כיצד להתחיל מליזט פאגים, לתת אותו לעכברים ולהעריך את ההשפעות על רמות החיידקים המארח והפאגים. פרוטוקול זה יכול להשתנות ולהיות מיושם על זוגות פאג’ים-חיידקים אחרים, והוא מספק נקודת מוצא לחקר הדינמיקה של פונדקאי-פאג’ים in vivo.
Introduction
בקטריופאג’ים, או פאגים, הם וירוסים שמדביקים והורגים חיידקים עם מינים וספציפיות ברמת הזן1. פאגים ממלאים תפקידים חשובים בקהילות חיידקים מורכבות כמו מיקרוביוטת המעיים, שם הם היו מעורבים בוויסות דינמיקת האוכלוסייה ובהנעת כושר חיידקי2. במהלך העשור האחרון, התעורר עניין מחודש במחקר פאגים עקב עלייתם של פתוגנים עמידים אנטי-מיקרוביאליים3, והפוטנציאל לטיפול בפאגים כאסטרטגיית טיפול אלטרנטיבית. בשנים האחרונות נעשה שימוש בקוקטיילים של פאגים ליטיים דרך הווריד בהצלחה מסוימת בזיהומים ספטיים חיידקיים חמורים ועמידים לאנטיביוטיקה בבני אדם 3,4. טיפול בפאגים דרך הפה הוצע גם כחלופה פוטנציאלית לאנטיביוטיקה לטיפול בדלקות מעיים ודלקות. יתר על כן, פאגים היו מעורבים בהצלחה של השתלות תסנין צואה (FFT), שהם תכשירי מיקרוביוטה צואתיים שסוננו לסילוק חיידקים, בטיפול בזיהום חוזר של Clostridioides difficile (rCDI)5,6, הפרעות מעי דלקתיות (IBD)7,8 ודלקת מעיים נמקית בפגים9. בהתחשב בתוצאות אלה, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציות הן בין פאגים ומיקרוביוטת המעיים, והן בין פאגים לבין פונדקאי היונקים, שכן להוספת פאגים חדשים לקהילה קיימת עשויות להיות השפעות עקיפות על הקהילה כולה, ולא רק על חיידקי המטרה שלה 2,10.
המחקר של אינטראקציות פאגים עם חיידקי המטרה שלהם במבחנה הוכח כיעיל להבנת המנגנונים וההשפעות של אינטראקציות פאגים וחיידקים במעיים. במסגרת זו, הוכח כי פאגים T4 ספציפיים ל- Escherichia coli מסדר Caudovirales דורשים תחומים דמויי אימונוגלובולין (Ig) הממוקמים בתוך חלבוני קפסיד חיצוני אנטיגני מאוד (Hoc) על פני השטח של הנגיפים כדי להיצמד לליחה במעי11. בנוסף, מבחני טרנסוול הראו כי פאגים מסוג T4 מסוגלים לקיים אינטראקציה עם תרביות תאי אפיתל ולבצע טרנסלוקציה דרך שכבות התא על ידי מקרופינוציטוזה12,13. תוצאות אלה תומכות בהשערה שפאגים יכולים לתקשר עם הפונדקאי המטזואני שלהם, אף על פי שהם אינם מסוגלים להדביק תאים איקריוטים. מודלים אלה, למרות שהם שימושיים, חסרים את כל טווח האינטראקציות המורכבות המתרחשות במערכת האקולוגית של המעיים הדרושות לחקירה מקיפה של האינטראקציה המשולשת בין פאגים, חיידקים והפונדקאי המטזואני.
מודלים של עכברים הם כלי חשוב לחקר פאגים בסביבות מורכבות. יישום רצוי של מתן פאגים הוא כאסטרטגיה חלופית לטיפול בזיהומים עמידים מיקרוביאליים או פתוביונטים הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות, כולל IBD. עם זאת, ספרות חדשה מציעה כי התנהגות פאגים במבחנה אינה מייצגת באופן מלא פונקציות in vivo. Buttimer et al.14 הראו כי קוקטייל פאגים היה מסוגל לרוקן את חיידקי המטרה בקונסורציום מיקרוביוטה אנושית פשוטה במבחנה, אך לא ניתן היה לשכפל אותו in vivo בעכברים גנוטוביוטיים שהתיישבו באותו קונסורציום חיידקים-פאגים. יתר על כן, במיקרוביום עכבר קונבנציונלי, פאג T7 הוביל לדלדול סלקטיבי של חיידקי המעיים שלו, אם כי נצפתה התאוששות הדרגתית לאורך זמן, המעידה על עמידות מפותחת15. מחקרים אחרים הוכיחו דו-קיום של פאגים הניתנים דרך הפה וזני חיידקי המטרה שלהם in vivo 2,16. ואכן, מעבר לדו-קיום של פאגים/חיידקים, מתן פאגים הוביל לשינויים נרחבים בהרכב ובתפקוד הכולל של קהילת המיקרוביוטה 2,16. זה רלוונטי במצבי מחלה, שכן מספר מחקרים מצאו קשרים בין שפע יחסי מוגבר של Caudovirales ו- IBD 7,8,17 שהיו בלתי תלויים בשינויים בשפע חיידקים7. עדיין לא ידוע אם זהו מניע או תוצאה של פתוגנזה של המחלה.
המוקד ההיסטורי של חקר הפאגים היה סביב הקשר בין פאג לבין חיידק המטרה שלו. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון אינטראקציות אפשריות בין פאגים לבין הרירית, האפיתל ומערכת החיסון של הפונדקאי המטזואני. כל האינטראקציות האלה ממלאות תפקיד חשוב בתגובה הכוללת לזיהום פאגים במעי. כדי להדגים זאת, פאגים נחקרו באמצעות עכברים נטולי חיידקים (GF) כדי להבהיר את השפעתם על מערכת החיסון ללא הפרעה של המיקרוביוטה8. במערכת זו, חומצות גרעין פאגים זוהו על ידי קולטנים דמויי טול (TLR) הממוקמים בתוך אנדוזומים של תאי חיסון פגוציטיים (מקרופאגים ותאים דנדריטיים). זה הפעיל איתות במורד הזרם ועורר ייצור תלוי תאי T של אינטרפרון (IFN)-γ8 או סוג I IFNs18. יתר על כן, Fluckiger et al.19 עירבו תאי זיכרון CD8+ T בזיהוי אנטיגנים מקודדי פאגים (פרופאג’ים), מה שהביא לתגובתיות צולבת של תאי T עם אנטיגנים סרטניים, וכתוצאה מכך נטל הגידול מופחת. לבסוף, ייצור נוגדנים ספציפיים לפאגים תועד במחקרי עכברים שבהם פאגים הועברו למודלים של בעלי חיים באופן מתמשך באמצעות מי שתייה 8,20, או על ידי גאגים פומיים חוזרים ונשנים במשך מספר חודשים20, מה שמדגים את יכולתם של חלבוני פאגים לקדם תגובות חיסוניות הומורליות. אף על פי ששיטות אלה של חיסון פאגים מאפשרות הכנה אופטימלית ומתמשכת של מערכת החיסון, ייתכן שהן אינן מייצגות את האינטראקציות הטבעיות בין פאגים לסביבת המעי, וגם לא את הקינטיקה של טיפול בפאגים המיושמים דרך הפה. עד כה, מספר מצומצם של מחקרים בחנו את יחסי הגומלין של פאגים עם מין חיידק יחיד במודלים של עכברים חד-מושבתיים21. עם זאת, עכברים חד-מושבתיים הוכיחו את עצמם כקריטיים בפענוח השפעות ספציפיות של חיידקים של מינים בודדים על מערכת העיכול (GI) ועל התפתחות מערכת החיסון 22,23,24, והם עדיין עשויים להיות שימושיים בהבנת אינטראקציות משולשות בין פאגים, חיידקי המטרה שלהם והפונדקאי המטזואני.
באופן מלהיב, יש עדיין הרבה מה ללמוד על יחסי הגומלין בין פאגים במעיים לבין חיידקי מעיים, כמו גם על יחסי הגומלין המתרחשים בין המאכסן המטזואני לבין הפאגים השוכנים בתוכו. פרוטוקול זה מספק סדרה של הליכים לחקר פאג T4 מבודד ומקבילו החיידקי, E. coli (K-12, BW25113), באמצעות מודל עכבר גנוטוביוטי. נהלים סטנדרטיים אלה מספקים גם בסיס לאופטימיזציה של דיאדות פאגים/חיידקים אחרות על ידי התאמת פרמטרי הגידול לזוגות המעניינים. השיטות המתוארות כאן מתארות: (1) הכנת פאגים מסוג T4 וליזאטים של כלי רכב לגידול אוראלי של עכברים; (2) מתן פומי של פאג T4 לעכברים גנוטוביוטיים חד-מושבתיים מסוג E. coli ; (3) ניטור רמות הפאגים מסוג T4 בצואת עכברים וברקמות לאורך זמן.
עבור התוצאות המייצגות שהוצגו כאן, ליזטים מטוהרים של פאגים מסוג T4 הופצו ממניות בנק פאגים שהוחזקו על ידי מעבדת רוהוור. שיטת פאג-און-ברז להפצת פאג T4 הותאמה25, כפי שמוזכר בפרוטוקול זה. השיטה מניבה מלאי פאגים גבוה ואנדוטוקסין נמוך תוך שלושה ימים. באמצעות גישה זו, 10 מ”ל של ≥ 1010 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/מ”ל של פאג T4 עם < 0.5 יחידות אנדוטוקסין (EU)/מ"ל נאספו באופן שגרתי. רמות האנדוטוקסין המומלצות למתן פומי או תוך ורידי בעכברים הן ≤ 20 EU/מ"ל ו-≤ 5 EU/kg/h (או 0.1 EU מנוהל מעל שעה אחת עבור עכבר במשקל 20 גרם), בהתאמה, מה שהופך זאת לשיטה מתאימה להכנת פאגים לחיסון in vivo . כל מלאי הפאגים אוחסן בטמפרטורה של 4°C במאגר פאגים של מגנזיום מלוחים (SM) (מתכון סופק בשלב 1.1.5.1). E. coli טופח במדיה LB. עבור זוגות שונים של חיידקי פאג’ים, ניתן להתאים מצעי תרבית ותנאי גדילה מגוונים מפרוטוקול זה. פאגים יכולים גם להיות מופקים מהסביבה, כגון שפכים, מים ימיים, קרקע ותכולת מעיים, וניתן לבודד ולטהר אותם לפי סמברוק וראסל26 לפני ההכנה תוך שימוש בתנאי הגידול והריבוי המתאימים לכל זוג פאגים-פונדקאים25 . לחלופין, ניתן לקבל פאגים ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) או מבנקי פאגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חקר הפאגים במיקרוביום מהווה אתגר משמעותי בהשוואה למקביליהם החיידקיים. באופן ספציפי, פאגים אינם מכילים סמן פילוגנטי שמור המשותף לכל הפאגים בדומה לתת-היחידות הריבוזומליות 16S ו-18S המאפשרות את הקלות בריצוף ובזיהוי של מינים פרוקריוטים ואיקריוטים, בהתאמה42. עם זאת, עם ההתקדמות בגיש…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בכך שהאדמה שעליה ביצעו את המחקר הזה היא הטריטוריה המסורתית, הקדומה והבלתי מוגבלת של אומת המוסקאם (xwməθkwəy̓əm). הארץ עליה היא ממוקמת תמיד הייתה מקום למידה עבור אנשי מוסקאם, שבמשך אלפי שנים העבירו הלאה את תרבותם, ההיסטוריה והמסורות שלהם מדור לדור באתר זה. אנו מעודדים אחרים ללמוד עוד על אדמות הילידים שבהן הם חיים ועובדים https://native-land.ca. המחברים מודים על תמיכת המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) מלגות לתואר שני – תואר שני (N.P.), פרס מייקל סמית ‘מחקר בריאות BC Trainee Award (RT-2023-3174, ל- MH), מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית מענקי גילוי (RGPIN-2019-04591 ל- C.T., RGPIN-2016-04282 ל- LCO), המכון הקנדי למחקר מתקדם / בני אדם והמיקרוביום (FL-001253 Appt 3362, ל-C.T.), פרס Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, ל-C.T.), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (PJT-159458 ל-LCO) והקרן הקנדית לחדשנות (34673 ל-LCO ו-38277 ל-CT). אנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית ממרכז UBC למידול מחלות ו-ubcFLOW, הנתמך על ידי יוזמת החוסן הביולוגי UBC GREx, ולחברי מעבדות אוסבורן וטרופיני על דיונים קריטיים והערכה של כתב היד. איור 1A ואיור 2A נוצרו באמצעות Biorender.com.
Materials
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
| Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
| Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
| Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
| Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
References
- Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
- Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
- Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
- Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
- Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
- Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
- Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
- Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
- Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
- Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
- Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
- Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
- Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
- Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
- Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
- Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
- Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
- Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
- Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
- Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
- Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2001).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
- Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Louten, J. Chapter 7 – Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
- Richter, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
- . Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices Available from: https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit (2018)
- Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
- Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
- Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
- Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
- McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
- Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
- Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
- Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
- Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
- Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
- Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
- Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
- Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
- Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem’s influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
- Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth’s Most Diverse Inhabitants. Wholon. , (2014).
- Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
- Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
- Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
- Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Kutter, E., Sulakvelidze, A. . Bacteriophages: Biology and Applications. , (2004).
- Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).
