تثمين الأعشاب البحرية الحمراء Gracilaria gracilis من خلال نهج التكرير الحيوي
Summary
هنا ، نصف العديد من البروتوكولات التي تهدف إلى تثمين متكامل ل Gracilaria gracilis: حصاد الأنواع البرية ، والنمو الداخلي ، واستخراج المكونات النشطة بيولوجيا. يتم تقييم التأثيرات المضادة للأكسدة ومضادات الميكروبات والسامة للخلايا للمستخلصات ، جنبا إلى جنب مع التقييم الغذائي والاستقرار للأغذية المخصبة بالكتلة الحيوية والأصباغ الكاملة للأعشاب البحرية.
Abstract
يتزايد باستمرار الاهتمام بالأعشاب البحرية كمادة وسيطة وفيرة للحصول على مكونات نشطة بيولوجيا قيمة ومتعددة الأهداف. في هذا العمل ، نستكشف إمكانات Gracilaria gracilis ، وهي أعشاب بحرية حمراء صالحة للأكل تزرع في جميع أنحاء العالم لمصلحتها التجارية كمصدر للأجار والمكونات الأخرى لتطبيقات مستحضرات التجميل والأدوية والغذاء والأعلاف.
تم تحسين ظروف نمو G. gracilis من خلال التكاثر الخضري والأبواغ أثناء التلاعب بالظروف الفيزيائية والكيميائية لتحقيق مخزون كبير من الكتلة الحيوية. تم تنفيذ منهجيات الاستخراج الأخضر باستخدام الإيثانول والماء على الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية. تم تقييم الإمكانات النشطة بيولوجيا للمستخلصات من خلال مجموعة من المقايسات في المختبر فيما يتعلق بسميتها الخلوية ومضادات الأكسدة وخصائص مضادات الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية المجففة في تركيبات المعكرونة لزيادة القيمة الغذائية للأغذية. كما تم دمج الأصباغ المستخرجة من G. gracilis في الزبادي كملون طبيعي ، وتم تقييم ثباتها. تم تقديم كلا المنتجين لتقدير لوحة حسية شبه مدربة تهدف إلى تحقيق أفضل صياغة نهائية قبل الوصول إلى السوق.
تدعم النتائج تعدد استخدامات G. gracilis سواء تم تطبيقه ككتلة حيوية كاملة و / أو مستخلصات و / أو أصباغ. من خلال تنفيذ العديد من البروتوكولات المحسنة ، يسمح هذا العمل بتطوير منتجات ذات إمكانية ربح أسواق الأغذية ومستحضرات التجميل وتربية الأحياء المائية ، وتعزيز الاستدامة البيئية والاقتصاد الدائري الأزرق.
وعلاوة على ذلك، وتمشيا مع نهج التكرير الحيوي، سيتم استخدام الكتلة الحيوية المتبقية من الأعشاب البحرية كمنشط حيوي لنمو النبات أو تحويلها إلى مواد كربونية لاستخدامها في تنقية المياه لأنظمة الاستزراع المائي الداخلية لماري بوليتكنيك في ليريا، البرتغال.
Introduction
يمكن اعتبار الأعشاب البحرية مادة خام طبيعية مثيرة للاهتمام تستفيد منها قطاعات الأدوية والأغذية والأعلاف والبيئة. إنها تقوم بالتخليق الحيوي لمجموعة من الجزيئات ، والعديد منها غير موجود في الكائنات الحية الأرضية ، مع الخصائص البيولوجية ذات الصلة 1,2. ومع ذلك ، يجب تنفيذ بروتوكولات الزراعة المحسنة للأعشاب البحرية لضمان وجود مخزون كبير من الكتلة الحيوية.
يجب أن تأخذ طرق الزراعة دائما في الاعتبار طبيعة ثالي الأعشاب البحرية والتشكل العام. Gracilaria gracilis هو تصنيف نسيلي ، مما يعني أن العضو المرتبط ينتج محاور نباتية متعددة. وبالتالي يتم تحقيق التكاثر عن طريق التجزئة (التكاثر الخضري) ، حيث أن كل محور من هذه المحاور قادر تماما على تبني حياة مستقلة عن الثاليوس3 الرئيسي. يمكن دمج الأصناف المستنسخة بنجاح مع منهجيات زراعة بسيطة وسريعة من خطوة واحدة ، حيث يتم الحصول على كميات كبيرة من الكتلة الحيوية عن طريق تقسيم الثاليوس إلى شظايا صغيرة تتجدد بسرعة وتنمو لتصبح أفرادا جدد متطابقين وراثيا. يمكن استخدام كل من الثالي الهابلونتيك والديبلوني في هذه العملية. على الرغم من أن الجنس يظهر دورة حياة ثلاثية الشكل متماثلة الشكل معقدة ، إلا أن التبويض نادرا ما يكون ضروريا إلا عندما يكون التجديد الوراثي للأرصدة مطلوبا لتحقيق محاصيل محسنة. في هذه الحالة ، يؤدي كل من tetraspores (الجراثيم الهابلونية التي تشكلها الانقسام الاختزالي) والأبواغ الكاربوسية (الجراثيم الثنائية التي تشكلها الانقسام) إلى ظهور ثالي عياني يمكن بعد ذلك زراعته ونشره عن طريق التكاثر الخضري4. تملي دورات النمو الظروف البيئية والحالة الفسيولوجية للأفراد ، من بين عوامل بيولوجية أخرى مثل ظهور النباتات الهوائية والتصاق الكائنات الحية الأخرى. لذلك ، يعد تحسين ظروف النمو أمرا بالغ الأهمية لضمان إنتاجية عالية وإنتاج كتلة حيوية عالية الجودة5.
يمكن تحقيق استخراج المركبات النشطة بيولوجيا من الأعشاب البحرية ، بما في ذلك G. gracilis ، من خلال طرق مختلفة 6,7. يعتمد اختيار طريقة الاستخراج على المركبات المحددة ذات الأهمية والتطبيق المستهدف وخصائص الأعشاب البحرية. في هذه الدراسة ، ركزنا على استخراج المذيبات ، والذي يتضمن استخدام المذيبات الخضراء ، مثل الماء أو الإيثانول ، لإذابة واستخراج المركبات النشطة بيولوجيا من الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية. يمكن إجراء الاستخراج من خلال النقع بطريقة متعددة الاستخدامات وفعالة ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من المركبات. إنها طريقة بسيطة ومستخدمة على نطاق واسع تتضمن نقع الكتلة الحيوية في مذيب لفترة طويلة ، عادة في الغرفة أو درجات حرارة مرتفعة قليلا. يتم تقليب المذيب لتعزيز عملية الاستخراج. بعد وقت الاستخراج المطلوب ، يتم فصل المذيب عن المادة الصلبة عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي.
الماء مذيب شائع الاستخدام في التطبيقات الغذائية نظرا لسلامته وتوافره وتوافقه مع مجموعة واسعة من المنتجات الغذائية. استخراج المياه مناسب للمركبات القطبية مثل السكريات والببتيدات وبعض الفينول. ومع ذلك ، قد لا يستخرج المركبات غير القطبية بشكل فعال. الإيثانول هو أيضا مذيب يستخدم على نطاق واسع في التطبيقات الغذائية ويمكن أن يكون فعالا في استخراج مجموعة متنوعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المركبات الفينولية والفلافونويد وبعض الأصباغ. يعرف الإيثانول عموما بأنه آمن للاستخدام في الطعام ويمكن تبخيره بسهولة ، تاركا وراءه المركبات المستخرجة. تجدر الإشارة إلى أن اختيار طريقة الاستخراج يجب أن يأخذ في الاعتبار عوامل مثل الكفاءة والانتقائية والفعالية من حيث التكلفة والتأثير البيئي. يعد تحسين معلمات الاستخراج ، مثل تركيز المذيبات ووقت الاستخراج ودرجة الحرارة والضغط أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الغلة المثلى للمركبات النشطة بيولوجيا من G. gracilis أو الأعشاب البحرية الأخرى.
تم العثور على الأعشاب البحرية لإظهار نشاط مضاد للميكروبات ضد مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات8. يعزى هذا النشاط إلى المكونات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك الفينولات والسكريات والببتيدات والأحماض الدهنية. أثبتت العديد من الدراسات فعاليتها ضد مسببات الأمراض مثل الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية والسالمونيلا sp. والزائفة الزنجارية وغيرها. 9. يعزى النشاط المضاد للميكروبات للأعشاب البحرية إلى وجود مركبات نشطة بيولوجيا يمكن أن تتداخل مع جدران الخلايا الميكروبية والأغشية والإنزيمات ومسارات الإشارات10. قد تعطل هذه المركبات نمو الميكروبات ، وتمنع تكوين الأغشية الحيوية ، وتعدل الاستجابات المناعية.
الأعشاب البحرية الحمراء ، والمعروفة أيضا باسم نباتات رودوفيت ، هي مجموعة من الطحالب التي يمكن أن تظهر نشاطا مضادا للميكروبات ضد مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة. ضمن هذه المجموعة ، يحتوي G. gracilis على العديد من المركبات النشطة بيولوجيا التي قد تساهم في نشاطه المضاد للميكروبات المبلغ عنه. في حين أن الجزيئات المحددة يمكن أن تختلف ، فإن الفئات الشائعة التي تم الإبلاغ عنها في G. gracilis والتي قد تمتلك خصائص مضادة للميكروبات هي السكريات والفينولات والتيربينويدات والأصباغ11. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن وجود وكميات هذه المكونات يمكن أن تختلف اعتمادا على عوامل مثل موقع جمع الأعشاب البحرية ، والموسمية ، والحالة الفسيولوجية للتالي ، والظروف البيئية. لذلك ، قد تختلف الفئة المحددة وتركيز المركبات المضادة للميكروبات في G. gracilis وفقا لذلك.
كما وجد أن G. gracilis يحمل خصائص مضادة للأكسدة ، تحتوي على مركبات فينولية مختلفة ، والتي ثبت أنها تزيل الجذور الحرة وتقلل من الإجهاد التأكسدي12.تساعد مضادات الأكسدة على حماية الخلايا من التلف الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية ولها فوائد صحية محتملة. يمكن تقييم قدرة مضادات الأكسدة مباشرة من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك نشاط كسح الجذور الحرة 2،2-ثنائي فينيل -1-بيكريل هيدرازيل (DPPH) ، وبشكل غير مباشر ، من خلال القياس الكمي لمحتوى البوليفينول الكلي (TPC) 13.
على الرغم من الإبلاغ عن أن أحد المكونات له نشاط حيوي بارز ، إلا أن تقييم السمية الخلوية لا غنى عنه في تقييم المواد الطبيعية والاصطناعية لاستخدامها في اتصال مع الخلايا أو الأنسجة الحية. هناك عدة طرق لقياس السمية الخلوية ، ولكل منها مزايا وقيود. بشكل عام ، يقدمون مجموعة من الخيارات لتقييم الآثار الضارة للعديد من المواد على الخلايا ، وفي الوقت نفسه ، للتحقيق في آليات تلف الخلايا وموتها14.
في هذا العمل ، نستخدم مقايسة بروميد 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) ، وهي طريقة قياس لوني قدمها Mosmann (1983) 15. تقيس هذه الطريقة اختزال أملاح التترازوليوم إلى منتج فورمازان أرجواني بواسطة الخلايا النشطة الأيضية. كلما زادت كمية بلورات الفورمازان ، زاد عدد الخلايا القابلة للحياة ، مما يوفر مقياسا غير مباشر للسمية الخلوية14. نظرا لأنه في هذا العمل ، يقصد من مستخلصات G. gracilis المائية والإيثانول دمجها في تركيبات مستحضرات التجميل الجلدية ، يتم إجراء تقييم السمية الخلوية في المختبر في خط خلايا الخلايا الكيراتينية (HaCaT).
فيما يتعلق بتطبيق الغذاء ، فإن الأعشاب البحرية منخفضة السعرات الحرارية بشكل عام وغنية من الناحية التغذوية بالألياف الغذائية والعناصر الأساسية والأحماض الأمينية والسكريات والأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة والبوليفينول والفيتامينات 2,16. G. gracilis ليست استثناء ، ولها قيمة غذائية مثيرة للاهتمام. وجد Freitas et al. (2021) 4 أن G. gracilis المزروعة تحتوي على مستويات أعلى من البروتين وفيتامين C وحافظت على مستوى الدهون الكلية مقارنة بالأعشاب البحرية البرية. وقد يمثل ذلك ميزة اقتصادية وبيئية، لأن الإنتاج أفضل من استغلال الموارد البرية من الناحية التغذوية. بالإضافة إلى ذلك ، يشعر المستهلكون بقلق متزايد بشأن نوع الطعام الذي يتناولونه ، لذلك من المهم إدخال مكونات جديدة لإثراء الغذاء واستخدام موارد جديدة للحصول على مقتطفات يمكن أن تضيف قيمة إلى المنتج والمطالبة ب “ملصق نظيف”. إلى جانب ذلك ، فإن السوق الحالي تنافسي للغاية ، ويتطلب تطوير منتجات جديدة واستراتيجيات مبتكرة لتمييز الشركات المصنعة عن منافسيها17.
إن إثراء المنتجات ذات القيمة الغذائية الرديئة ، مثل المعكرونة ، بالموارد البحرية ، بما في ذلك الأعشاب البحرية ، هو استراتيجية لإدخال هذا المورد كغذاء جديد واستراتيجية تمايز السوق من خلال منتج ذي قيمة غذائية متميزة. من ناحية أخرى ، G. gracilis هو مصدر للأصباغ الحمراء الطبيعية مثل phycobiliproteins18 ، لديها إمكانات عالية للتطبيقات في صناعة المواد الغذائية. أظهرت هذه الأعشاب البحرية اهتماما كبيرا في العديد من المجالات ، ويمكن تطبيقها باستخدام الأعشاب البحرية بأكملها والمستخلصات و / أو الكتلة الحيوية المتبقية. في هذا العمل ، نعرض بعض الأمثلة على هذه التطبيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستخدم اختبارات النشاط المضاد للميكروبات في وسط سائل لتقييم فعالية المواد المضادة للميكروبات ضد الكائنات الحية الدقيقة المعلقة في وسط سائل وعادة ما يتم إجراؤها لتحديد قدرة المادة على تثبيط النمو أو قتل الكائنات الحية الدقيقة35،36،37،<sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (FCT) من خلال المشاريع الاستراتيجية الممنوحة لمركز MARE-Marine Sciences and Environmental (UIDP / 04292/2020 و UIDB / 04292/2020) ، والمختبر المعاون ARNET (LA / P / 0069/2020). مولت FCT أيضا منح الدكتوراه الفردية الممنوحة لمارتا ف. فريتاس (UI / BD / 150957 / 2021) وتاتيانا بيريرا (2021. 07791. دينار بحريني). تم دعم هذا العمل أيضا ماليا من قبل مشروع HP4A – المعكرونة الصحية للجميع (الترويج المشترك رقم 039952) ، بتمويل مشترك من ERDF – الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية ، في إطار برنامج البرتغال 2020 ، من خلال COMPETE 2020 – البرنامج التشغيلي للتنافسية والتدويل.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
