Valorización del alga roja Gracilaria gracilis a través de un enfoque de biorrefinería
Summary
Aquí, describimos varios protocolos que apuntan a una valorización integrada de Gracilaria gracilis: recolección de especies silvestres, crecimiento interno y extracción de ingredientes bioactivos. Se evalúan los efectos antioxidantes, antimicrobianos y citotóxicos de los extractos, junto con la evaluación nutricional y de estabilidad de los alimentos enriquecidos con biomasa y pigmentos de algas marinas enteras.
Abstract
El interés por las algas marinas como materia prima abundante para obtener ingredientes bioactivos valiosos y multiobjetivo está en continuo crecimiento. En este trabajo, exploramos el potencial de Gracilaria gracilis, un alga roja comestible cultivada en todo el mundo por su interés comercial como fuente de agar y otros ingredientes para aplicaciones cosméticas, farmacológicas, alimentarias y de piensos.
Las condiciones de crecimiento de G. gracilis se optimizaron a través de la propagación vegetativa y la esporulación, mientras se manipulaban las condiciones fisicoquímicas para lograr un gran stock de biomasa. Se realizaron metodologías de extracción verde con etanol y agua sobre la biomasa de algas. El potencial bioactivo de los extractos se evaluó a través de un conjunto de ensayos in vitro sobre sus propiedades citotóxicas, antioxidantes y antimicrobianas. Además, se incorporó biomasa seca de algas marinas en las formulaciones de pasta para aumentar el valor nutricional de los alimentos. Los pigmentos extraídos de G. gracilis también se han incorporado al yogur como colorante natural, y se evaluó su estabilidad. Ambos productos fueron sometidos a la apreciación de un panel sensorial semi-entrenado con el objetivo de lograr la mejor formulación final antes de llegar al mercado.
Los resultados respaldan la versatilidad de G. gracilis ya sea que se aplique como biomasa completa, extractos y/o pigmentos. A través de la implementación de varios protocolos optimizados, este trabajo permite el desarrollo de productos con potencial para beneficiar a los mercados de alimentos, cosméticos y acuicultura, promoviendo la sostenibilidad ambiental y una economía circular azul.
Además, y en línea con un enfoque de biorrefinería, la biomasa residual de algas marinas se utilizará como bioestimulante para el crecimiento de las plantas o se convertirá en materiales de carbono que se utilizarán en la purificación del agua de los sistemas acuícolas internos del MARE-Polytechnic de Leiria, Portugal.
Introduction
Las algas marinas pueden considerarse como una materia prima natural interesante para ser aprovechada por los sectores farmacéutico, alimentario, de piensos y medioambiental. Biosintetizan una panoplia de moléculas, muchas de las cuales no se encuentran en los organismos terrestres, con propiedades biológicas relevantes 1,2. Sin embargo, es necesario implementar protocolos de cultivo optimizados para algas marinas para garantizar un gran stock de biomasa.
Los métodos de cultivo siempre deben tener en cuenta la naturaleza de las algas marinas, los talos y la morfología general. Gracilaria gracilis es un taxón clonal, lo que significa que el órgano de unión produce múltiples ejes vegetativos. De este modo, se consigue la propagación por fragmentación (reproducción vegetativa), ya que cada uno de estos ejes es plenamente capaz de adoptar una vida independiente del talo principal3. Los taxones clonales pueden integrarse con éxito con metodologías de cultivo sencillas y rápidas de un solo paso, ya que se obtienen grandes cantidades de biomasa dividiendo el talo en pequeños fragmentos que se regeneran rápidamente y crecen en nuevos individuos genéticamente idénticos. En este proceso se pueden utilizar tanto talos haplónicos como diplónicos. Aunque el género exhibe un ciclo de vida trifásico isomorfo haplo-diplónico complejo, la esporulación rara vez es necesaria, excepto cuando se requiere la renovación genética de las cepas para lograr cultivos mejorados. En este caso, tanto las tetrasporas (esporas haplónicas formadas por meiosis) como las carposporas (esporas diplónicas formadas por mitosis) dan lugar a talos macroscópicos que luego pueden crecer y propagarse por reproducción vegetativa4. Los ciclos de crecimiento están dictados por las condiciones ambientales y el estado fisiológico de los individuos, entre otros factores biológicos como la aparición de epífitas y la adhesión de otros organismos. Por lo tanto, optimizar las condiciones de cultivo es crucial para garantizar una alta productividad y producir biomasa de buena calidad5.
La extracción de compuestos bioactivos de algas marinas, incluyendo G. gracilis, puede lograrse a través de varios métodos 6,7. La elección del método de extracción depende de los compuestos específicos de interés, la aplicación objetivo y las características de las algas marinas. En este estudio, nos centramos en la extracción con disolventes, que implica el uso de disolventes verdes, como el agua o el etanol, para disolver y extraer compuestos bioactivos de la biomasa de algas. La extracción se puede realizar mediante maceración de forma versátil y eficaz y se puede utilizar para una amplia gama de compuestos. Es un método simple y ampliamente utilizado que consiste en remojar la biomasa en un solvente durante un período prolongado, generalmente a temperatura ambiente o ligeramente elevada. El disolvente se agita para mejorar el proceso de extracción. Después del tiempo de extracción deseado, el solvente se separa del material sólido por filtración o centrifugación.
El agua es un disolvente de uso común en aplicaciones alimentarias debido a su seguridad, disponibilidad y compatibilidad con una amplia gama de productos alimenticios. La extracción de agua es adecuada para compuestos polares como polisacáridos, péptidos y ciertos fenólicos. Sin embargo, es posible que no extraiga eficazmente compuestos no polares. El etanol también es un disolvente ampliamente utilizado en aplicaciones alimentarias y puede ser eficaz para extraer una variedad de moléculas bioactivas, incluidos compuestos fenólicos, flavonoides y ciertos pigmentos. El etanol es generalmente reconocido como seguro para su uso en alimentos y puede evaporarse fácilmente, dejando atrás los compuestos extraídos. Vale la pena señalar que la elección del método de extracción debe considerar factores como la eficiencia, la selectividad, la rentabilidad y el impacto ambiental. La optimización de los parámetros de extracción, como la concentración de disolventes, el tiempo de extracción, la temperatura y la presión, es crucial para lograr rendimientos óptimos de compuestos bioactivos de G. gracilis u otras algas marinas.
Se ha descubierto que las algas marinas exhiben actividad antimicrobiana contra una amplia gama de microorganismos, incluidas bacterias, hongos y virus8. Esta actividad se atribuye a componentes bioactivos, incluidos fenólicos, polisacáridos, péptidos y ácidos grasos. Diversos estudios han demostrado su eficacia frente a patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. y Pseudomonas aeruginosa, entre otros9. La actividad antimicrobiana de las algas marinas se atribuye a la presencia de compuestos bioactivos que pueden interferir con las paredes celulares microbianas, las membranas, las enzimas y las vías de señalización10. Estos compuestos pueden interrumpir el crecimiento microbiano, inhibir la formación de biopelículas y modular las respuestas inmunitarias.
Las algas rojas, también conocidas como rodófitas, son un grupo de algas que pueden exhibir actividad antimicrobiana contra una variedad de microorganismos. Dentro de este grupo, G. gracilis contiene varios compuestos bioactivos que pueden contribuir a su actividad antimicrobiana reportada. Si bien las moléculas específicas pueden variar, las clases comunes que se han reportado en G. gracilis y que pueden poseer propiedades antimicrobianas son los polisacáridos, los fenólicos, los terpenoides y los pigmentos11. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la presencia y las cantidades de estos componentes pueden variar dependiendo de factores como la ubicación de la recolección de algas, la estacionalidad, la condición fisiológica de los talos y las condiciones ambientales. Por lo tanto, la clase específica y la concentración de compuestos antimicrobianos en G. gracilis pueden variar en consecuencia.
También se ha descubierto que G. gracilis tiene propiedades antioxidantes, ya que contiene varios compuestos fenólicos, que se ha demostrado que eliminan los radicales libres y reducenel estrés oxidativo.Los antioxidantes ayudan a proteger las células del daño causado por las especies reactivas de oxígeno y tienen beneficios potenciales para la salud. La capacidad antioxidante puede ser evaluada directamente a través de diferentes métodos, incluyendo la actividad de eliminación de radicales libres de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) e, indirectamente, a través de la cuantificación del contenido polifenólico total (TPC)13.
A pesar de que se informa que un ingrediente tiene una bioactividad prominente, su evaluación de citotoxicidad es indispensable para evaluar sustancias naturales y sintéticas que se utilizarán en contacto con células o tejidos vivos. Existen varios métodos para medir la citotoxicidad, cada uno con ventajas y limitaciones. En general, ofrecen una gama de opciones para evaluar los efectos nocivos de muchas sustancias en las células y, al mismo tiempo, para investigar los mecanismos de daño y muerte celular14.
En este trabajo se utiliza el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), método colorimétrico introducido por Mosmann (1983)15. Este método mide la reducción de las sales de tetrazolio a un producto de formazano púrpura por parte de células metabólicamente activas. Cuanto mayor es la cantidad de cristales de formazano, mayor es el número de células viables, proporcionando así una medida indirecta de citotoxicidad14. Dado que en este trabajo, los extractos de agua y etanol de G. gracilis están destinados a ser incorporados en formulaciones dermocosméticas, la evaluación de citotoxicidad in vitro se realiza en una línea celular de queratinocitos (HaCaT).
En cuanto a la aplicación alimentaria, las algas marinas son generalmente bajas en calorías y nutricionalmente ricas en fibras dietéticas, elementos esenciales y aminoácidos, polisacáridos, ácidos grasos poliinsaturados, polifenoles y vitaminas 2,16. G. gracilis no es una excepción, ya que tiene un valor nutricional interesante. Freitas et al. (2021)4 encontraron que G. gracilis cultivada tenía niveles más altos de proteína y vitamina C y mantenía el nivel de lípidos totales en comparación con las algas silvestres. Esto puede representar una ventaja económica y ambiental, ya que nutricionalmente hablando, la producción es preferible a la explotación de recursos silvestres. Además, los consumidores están cada vez más preocupados por el tipo de alimentos que consumen, por lo que es importante introducir nuevos ingredientes para el enriquecimiento de los alimentos y utilizar nuevos recursos para obtener extractos que puedan agregar valor a un producto y reclamar una “etiqueta limpia”. Además, el mercado actual es muy competitivo, lo que requiere el desarrollo de nuevos productos y estrategias innovadoras para diferenciar a los fabricantes de sus competidores17.
El enriquecimiento de productos con escaso valor nutricional, como la pasta, con recursos marinos, incluidas las algas marinas, es una estrategia para introducir este recurso como un nuevo alimento y una estrategia de diferenciación en el mercado a través de un producto con un valor nutricional diferenciado. Por otro lado, G. gracilis es una fuente de pigmentos rojos naturales como las ficobiliproteínas18, con un alto potencial de aplicaciones en la industria alimentaria. Esta alga ha mostrado un gran interés en varias zonas, y su aplicación se puede realizar utilizando las algas enteras, extractos y/o la biomasa restante. En este trabajo, mostramos algunos ejemplos de tales aplicaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las pruebas de actividad antimicrobiana en un medio líquido se utilizan para evaluar la eficacia de las sustancias antimicrobianas contra los microorganismos suspendidos en un medio líquido y generalmente se realizan para determinar la capacidad de una sustancia para inhibir el crecimiento o matar microorganismos35,36,37,38. Se utilizan para evaluar la sensibilidad de los microorganismos a lo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT) a través de los Proyectos Estratégicos concedidos al MARE-Centro de Ciencias Marinas y Ambientales (UIDP/04292/2020 y UIDB/04292/2020), y al Laboratorio Asociado ARNET (LA/P/0069/2020). La FCT también financió las becas individuales de doctorado otorgadas a Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) y Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Este trabajo también contó con el apoyo financiero del proyecto HP4A – PASTA SALUDABLE PARA TODOS (copromoción nº 039952), cofinanciado por el FEDER – Fondo Europeo de Desarrollo Regional, en el marco del Programa Portugal 2020, a través del Programa Operativo COMPETE 2020 – Competitividad e Internacionalización.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
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