Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Культивирование органоидов глиомы ex vivo, полученных от пациентов, с помощью измельчителя тканей

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65952
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 3, 4, 1, 2, 2
1Section Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University Hospital Würzburg, 2Department of Neurosurgery, University Hospital Würzburg, 3Department of Hematology, University Hospital Würzburg, 4Department of Neuropathology, Institute of Pathology, University Hospital Würzburg

Summary

В этом исследовании представлен автоматизированный метод генерации 3-мерных органоидов глиобластомы, полученных от пациентов, с использованием измельчителя тканей. Метод обеспечивает подходящий и эффективный подход к получению таких органоидов для терапевтического тестирования.

Abstract

Глиобластома ИДГ-дикого типа, ЦНС 4 степени тяжести (ГБМ) является первичной опухолью головного мозга, связанной с низкой выживаемостью пациентов, несмотря на агрессивное лечение. Разработка реалистичных моделей ex vivo остается сложной задачей. Модели 3-мерных органоидов (PDO), полученные от пациентов, предлагают инновационные платформы, которые фиксируют фенотипическую и молекулярную гетерогенность GBM, сохраняя при этом ключевые характеристики исходных опухолей. Тем не менее, ручное препарирование для создания PDO отнимает много времени, стоит дорого и может привести к появлению ряда PDO неправильной формы и неравномерного размера. В данном исследовании представлен инновационный метод производства PDO с использованием автоматизированного измельчителя тканей. Образцы опухолей у четырех пациентов с ГБМ и одной астроцитомой, IDH-мутантной, ЦНС 2 степени 2-й степени ВОЗ обрабатывали вручную, а также с помощью измельчителя тканей. При ручном подходе опухолевый материал рассекался с помощью скальпеля под микроскопическим контролем, в то время как измельчитель тканей использовался под тремя разными углами. После культивирования на орбитальном шейкере при 37 °C морфологические изменения оценивали с помощью яркопольной микроскопии, а пролиферацию (Ki67) и апоптоз (CC3) оценивали с помощью иммунофлуоресценции через 6 недель. Метод измельчения тканей сократил почти 70% времени производства и привел к значительно более высокому среднему количеству PDO по сравнению с обработанной вручную тканью, начиная со второй недели (неделя 2: 801 против 601, P = 0,018; неделя 3: 1105 против 771, P = 0,032; и неделя 4:1195 против 784, P < 0,01). Оценка качества показала схожие показатели апоптоза и пролиферации опухолевых клеток для обоих методов производства. Таким образом, метод автоматизированного измельчителя тканей предлагает более эффективный подход с точки зрения времени и выхода PDO. Этот метод является перспективным для медикаментозного или иммунотерапевтического скрининга пациентов с ГБМ.

Introduction

Низкодифференцированные глиомы (LGG) представляют собой группу относительно редких опухолей головного мозга, которые, как правило, проявляются как медленно растущие и менее агрессивные по сравнению с глиомами высокой степени злокачественности, такими как глиобластома. Они могут возникать как у взрослых, так и у детей, с несколько большей распространенностью у взрослых. Точная распространенность варьируется в зависимости от региона и популяции, но на долю LGG приходится примерно 15–20% всех первичных опухолей головного мозга1. Стратегии лечения LGG часто включают комбинацию хирургического вмешательства, лучевой терапии и химиотерапии, направленные на максимизацию резекции опухоли при сохранении неврологической функции. Лечение ЛГГ может быть сложным, и выбор терапии может зависеть от таких факторов, как локализация опухоли и молекулярные характеристики2. Прогресс в понимании генетических и молекулярных основ LGG привел к более целенаправленной терапии, и текущие исследования продолжают совершенствовать подходы к лечению.

С другой стороны, глиобластома, ИДГ-дикий тип, ЦНС 4-й степени (ГБМ) является наиболее распространенной первичной опухолью головного мозга, встречающейся у взрослых, с частотой заболеваемости 3,19-4,17 случая на 100 000 человеко-лет. GBM вызывает такие симптомы, как головные боли, судороги, очаговый неврологический дефицит, изменения личности и повышение внутричерепного давления. Стандартное лечение ГБМ включает уменьшение объема опухоли, если это возможно, с последующей лучевой терапией в сочетании с темозоломидом4. Кроме того, комбинация темозоломида и ломустина может повысить медиану общей выживаемости у пациентов с метилированием промотора O 6-метилгуанин-метилтрансферазы (MGMT)5. Однако, несмотря на эти недавние терапевтические подходы, ГБМ остается неизлечимым заболеванием с плохим прогнозом, характеризующимся средней общей выживаемостью пациентов от 16 до 20,9 месяцев при добавлении полей для лечения опухолей (TTFields) 3,6. Несколько иммунотерапевтических подходов были исследованы в GBM, но продемонстрировали ограниченную эффективность in vivo. Кроме того, клинические и доклинические ограничения препятствуют терапевтическим прорывам7. Создание подходящей и реалистичной модели ex vivo было сложной задачей из-за интер-8 и внутриопухолевой гетерогенности 9 GBM.

Обычные 2-мерные (2D) клеточные линии пациента представляют собой однородные клеточные популяции и подходят для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов. Тем не менее, полученные от пациентов и иммортализированные клеточные линии не могут адекватно имитировать GBM из-за различий в условиях роста и отклонений в генотипических и фенотипических признаках после многократных пассажей 10,11,12.

С другой стороны, в последнее время в качестве перспективных систем появились 3D-модели органоидов, воспроизводящие фенотипическую и молекулярную гетерогенность органов и различных типов рака 13,14,15,16,17,18. В контексте ГБМ церебральные органоиды были генетически модифицированы для имитации опухолеподобных характеристик16,17 или культивированы совместно с ГСК или сфероидами для индуцирования инфильтрации опухолевых клеток18,19. В то время как полученные от пациентов органоиды GBM, культивируемые с помощью Matrigel и EGF/bFGF, демонстрируют такие признаки GBM, как гетерогенность стволовых клеток и гипоксия20, остается неясным, в какой степени эта модель может представлять ключевые молекулярные свойства новообразований пациентов.

Органоиды GBM, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающими моделями, которые могут сохранять преобладающие черты своих аналогичных родительских опухолей, включая гистологические характеристики, клеточное разнообразие, экспрессию генов и мутационные профили. Кроме того, они быстро внедряются при имплантации в мозг взрослых грызунов, обеспечивая реалистичную модель для тестирования лекарств иперсонализированной терапии. Тем не менее, ручное препарирование опухолевой ткани для создания PDO является трудоемким и дорогостоящим процессом. Таким образом, существует острая потребность в быстром методе, который может производить большое количество ЗОП, что позволяет проводить всестороннюю оценку различных терапевтических подходов, перспективных для индивидуализированного тестирования лекарственных средств. В этом исследовании описывается новый метод изготовления ЗОП непосредственно из свежерассеченной опухолевой ткани с использованием автоматического измельчителя тканей. Кроме того, PDO, полученные с помощью этого метода, сравнивали с препарированными вручную PDO у тех же пациентов с точки зрения количества PDO, морфологических особенностей, апоптоза и пролиферации опухолевых клеток.

Protocol

Все пациенты проходили лечение в отделении нейрохирургии университетской клиники Вюрцбурга, Германия, после предоставления письменного информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобренным Институциональным наблюдательным советом Вюрцбургского университета (#22/20-me). Опухолевый тканевой материал от четырех пациентов с ГБМ и одного пациента с астроцитомой, IDH-мутантной, ЦНС 2 степени (глиома низкой степени злокачественности, LGG) (табл. 1) был получен в результате операции и обработан по следующему протоколу. Автоматизированный процесс генерации PDO с использованием измельчителя тканей называется измельчителем (C), а процесс ручного разрезания ткани двумя скальпелями под микроскопическим контролем — ручным (M). Из образца опухоли были выделены шесть одинаковых по размеру (1-2см3), затем каждый из них был разрезан пополам и обработан однородно с использованием двух методов. Из-за вышеупомянутой внутриопухолевой гетерогенности от каждого пациента была сгенерирована одна 6-луночная пластина для каждого подхода, при этом каждая лунка представляла ЗОП из разных участков в исходной опухоли. Обе процедуры проходили под ламинарным шкафом с воздушным потоком, и все используемые инструменты были стерилизованы перед использованием. Обзор подхода проиллюстрирован на рисунке 1.

1. Подготовка агарозных блоков (только для С-подхода, опционально)

  1. Налейте 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в стакан, добавьте одну таблетку агарозы (см. Таблицу материалов) и хорошо перемешайте до получения суспензии.
  2. Нагревайте смесь в микроволновке в течение 30-40 с, избегая при этом кипения. Затем охладите смесь до 47 °C.
  3. Вылейте агарозную смесь в герметичную форму для литья в форме цилиндра и не допускайте образования пузырьков. Немедленно охладите гипс, используя замороженный (-20 °C) зажим или поместив его на сухой лед на 30 минут.

2. Обработка опухолевого материала

  1. Подготовьте коробку со льдом, чтобы охладить опухолевый материал по пути из операционной в лабораторию.
  2. Перенесите опухолевую ткань (4-5 см³) в стерильную пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл Hibernate A (см. Таблицу материалов), покрывающую опухоль, и поместите пробирку в ледяной ящик.
  3. Под ламинарным шкафом с воздушным потоком переместите опухолевый материал вместе с Hibernate A в стерилизованную стеклянную чашку Петри.
  4. Удалите некротизированную ткань и осторожно рассеките кровеносные сосуды с помощью скальпеля и тканевых щипцов под микроскопическим контролем. Определите некротизированную ткань по геморрагическим участкам, демонстрирующим коричневатый оттенок в результате кровотечения, или ткани, демонстрирующей более бледный или белый вид по сравнению с соседней жизнеспособной тканью. Следите за тем, чтобы ткани не сдавливались и не нарушались.
  5. Разрежьте опухолевый материал на шесть частей размером примерно 1-2см3. Распределите кусочки по пластиковым чашкам Петри (n = 6), предварительно заполненным 3 мл среды H-GPSA (таблица 2), по22 мл каждая. Поставьте чашки Петри на лед.

3. Настройка измельчителя тканей

  1. Расположите лезвие, как описано в руководстве производителя23.
  2. Отрегулируйте толщину ломтика до 0,45-0,50 мм. Установите усилие лезвия на среднее. Зафиксируйте ручку разблокировки стола в режиме «пуск».

4. Обработка кусочков опухолевой ткани

  1. Обработка опухолевой ткани измельчителем (метод С)
    1. Разрежьте блоки агарозы на цилиндры длиной 2 см и приклейте один из этих цилиндров к круглой пластиковой посуде измельчителя с помощью гистоакрилового клея (см. Таблицу материалов).
    2. Создайте углубление в агарозном цилиндре с помощью скальпеля, а затем поместите опухолевую ткань из первой лунки (шаг 2.5) в эту ямку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С опухолевым материалом следует обращаться осторожно, не сдавливая и не проталкивая его в щель. Зазор должен быть достаточно большим, чтобы легко поместиться в опухоль, но достаточно маленьким, чтобы опухолевый материал оставался стабильным в процессе разрезания. Шаги 4.1.1. и 4.1.2. не являются обязательными.
    3. Установите пластиковый диск на монтажный диск режущего стола (см. Таблицу материалов).
    4. Включите измельчитель и нажмите кнопку сброса. Теперь измельчитель начинает резку (первый раунд). Машина автоматически останавливается после того, как стол доходит до конца и агароза и опухолевая ткань нарезаются до нужного диаметра.
    5. Поверните монтажный диск на 90°, а затем установите ручку разблокировки стола в начальный режим.
    6. Нажмите кнопку сброса и позвольте машине снова разрезать ткань, создав ткань прямоугольной формы (второй раунд).
    7. Извлеките пластиковый диск с обработанным материалом и осторожно поверните только опухолевую ткань на 90° с помощью тканевого шпателя.
    8. Поместите пластиковый диск на стол для резки, затем установите ручку разблокировки стола в начальный режим и нажмите кнопку сброса для окончательного раунда резки (третьего раунда).
    9. Выключите измельчитель и извлеките пластиковый диск. Очистите измельчитель и лезвия.
    10. С помощью одноканальной пипетки объемом 5 мл аспирируйте обработанный материал вместе со средой в пипетку и смывайте суспензию обратно в чашку.
    11. Повторите предыдущий шаг 2-3 раза, чтобы правильно отделить ткань.
    12. Поместите чашку Петри обратно на лед и повторите шаги (4.1.1-4.1.12.) с другими 5 чашками каждой опухоли.
  2. Обработка опухолевой ткани вручную (метод М)
    1. Перенесите опухолевую ткань из первой пластиковой чашки Петри (шаг 2,5) вместе с 3 мл среды H-GPSA (табл. 2) в стеклянную чашку Петри. Рассеките отрезок вручную под микроскопом на срезы по 0,5 мм с помощью двух скальпелей.
    2. Перенесите рассеченную ткань обратно в пластиковую чашку Петри с помощью пипетки объемом 2 мл.
    3. Повторите шаги (4.2.1.-4.2.3.) для срезов опухоли в остальных пяти чашках Петри (шаг 2.5).

5. Промывание опухолевой ткани

  1. Наклоните каждую чашку Петри вверх до 45° и подождите 30 с, пока кусочки опухоли не опустятся на дно чашки.
  2. Осторожно отсасывайте 2,5 мл среды H-GPSA (Таблица 2) с помощью пипетки объемом 1 мл и следите за тем, чтобы не попасть в опухолевую ткань.
  3. Добавьте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. таблицу материалов) к каждому образцу. Обработанные кусочки опухоли должны быть полностью покрыты лизисным буфером.
  4. Поместите 6 тарелок на лабораторную орбитальную встряхивающую машину на низкой скорости на 10 минут.
  5. Осторожно аспирируйте 2 мл лизисного буфера, чтобы не попасть в опухолевую ткань.
  6. Повторите предыдущие этапы промывки (шаг 5.1-5.5) дважды, каждый раз используя 2 мл среды H-GPSA (Таблица 2) вместо буфера лизиса.

6. Культивирование опухолевой ткани

  1. Аспирируйте среду H-GPSA (Таблица 2) из каждой чашки и замените ее 4 мл среды PDO (Таблица 2).
  2. Переложите кусочки ткани каждой чашки в одну соответствующую лунку 6-луночной пластины со сверхнизкой насадкой (см. Таблицу материалов).
  3. Поместите планшет на орбитальный шейкер внутри инкубатора и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 и 150 об/мин в течение 2-4 недель.
  4. Каждые два дня выполняйте замену половины среды, отсасывая 2 мл среды из каждой лунки и заменяя ее 2 мл свежей среды PDO (таблица 2), предварительно подогретой до 37 °C.
  5. Осмотрите ткань под микроскопом (морфология, рост, средняя окраска) и вырежьте растущие PDO (>0,7 мм) или адгезивную ткань для предотвращения гипоксии тканей.
    1. Для этого перенесите PDO из лунки со сверхнизким креплением в стерилизованную стеклянную чашку Петри и используйте скальпель для резки. Кроме того, адгезивные PDO можно устранить, аспирировав их с помощью пипетки объемом 1 мл. Будьте осторожны, не сжимайте PDO и обращайтесь с ними осторожно.
  6. Оцените образование PDO, подсчитывая PDO каждые два дня, и тщательно проверьте желаемую круглую морфологию (рис. 2).

7. Фиксация и встраивание PDO

  1. Зафиксируйте два ЗОП из каждой лунки каждого пациента 4% формалином в течение 24 ч после 6 недель посева.
  2. Погрузите фиксированные PDO в нейтрально буферизованный (фосфат натрия) формалин до внедрения.
  3. Поместите каждый PDO в кассету (см. Таблицу материалов) для дальнейшей обработки.
  4. Запустите процесс обезвоживания, погрузив кассету в следующие растворы, как указано в ПРИМЕЧАНИИ ниже:
    ПРИМЕЧАНИЕ: 50% этанол в течение 20 мин, 70% этанол в течение 20 мин, 80% этанол в течение 20 мин, 96% этанол в течение 20 мин, 100% этанол в течение 20 мин, 100% этанол в течение 30 мин, 100% этанол + хлороформ (соотношение 1:1) в течение 30 мин, 100% этанол + хлороформ (соотношение 1:1) в течение 30 минут, Абсолютный хлороформ в течение 30 мин, Абсолютный хлороформ в течение 30 мин, Парафин в течение 30 мин, парафин в течение 30 мин с использованием STP 120.
  5. Обезвоженные PDO помещают в парафин при температуре 58-60 °C.
  6. Нарежьте встроенные PDO толщиной 2,5 мкм и закрепите их на предметных стеклах для окрашивания.

8. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Устанавливают PDO через 6 недель культивирования.
  2. Затем проводят двойное окрашивание глиального фибриллярного кислого белка (GFAP, разведение: 1:100) и маркера пролиферации Ki67 (разведение: 1:1000) (см. таблицу материалов), как сообщалось ранее22.
  3. Аналогичным образом, оценивают апоптоз путем двойного окрашивания PDO против GFAP и антикаспазы-3 (CC3, разведение: 1:400) (см. таблицу материалов).
  4. Получение изображений PDO с помощью флуоресцентного микроскопа с 40-кратным увеличением.
  5. Проанализируйте изображения на наличие GFAP-, Ki67- и CC3-положительных клеток, а также GFAP/Ki67 и GFAP/CC3-положительных клеток.
  6. Используйте программу с открытым исходным кодом Fiji (ImageJ-win 32) для анализа изображений.

9. Оценка и анализ данных

  1. Делайте ежедневные микроскопические снимки яркого поля в течение первой недели культивирования при стандартных настройках и 5-кратном увеличении.
  2. Наблюдайте за морфологическими изменениями и отслеживайте процесс созревания как при ручной, так и при автоматизированной обработке.
  3. Проводите морфологический анализ с помощью микроскопа в стандартных настройках режима светлого поля.
  4. Оцените количество и морфологию ЗОП в течение первых 4 недель бактериологического исследования у всех пяти пациентов.
  5. Получите три показания каждого количества PDO от каждого пациента, чтобы рассчитать среднее значение и стандартную ошибку среднего значения (SEM).
  6. Исследуйте пролиферацию и апоптоз при ЗОП у трех пациентов.
  7. Проанализируйте данные с помощью коммерчески доступного статистического программного пакета (см. Таблицу материалов).
  8. Примените U-тесты Students-T и Mann-Whitney U, чтобы определить различия между ручной и автоматической генерацией PDO с точки зрения количества PDO, пролиферации и апоптоза.

Representative Results

Четыре пациента с ГБМ и один с ЛГГ были включены в исследование после патологического подтверждения опытным невропатологом (ШМ). У большинства пациентов был выявлен неметилированный промотор MGMT, и все пациенты с ГБМ относились к дикому типу IDH1 и IDH2 (табл. 1). В среднем производственный процесс длился 88,8 мин (+/- 6,3 мин) при подходе С и 322 мин (+/- 17,2 мин) при подходе М. Общий показатель успеха составил 87% при ручном и 93% при измельчителе после 4 недель культивирования (n = 5). Более того, PDO, полученные из группы C, достигали желаемой округлой формы в течение 1 недели и были достаточно зрелыми, чтобы их можно было использовать в экспериментах in vitro , в то время как PDO группы M в основном оставались резко очерченными и неопределенными (рис. 2). Опухолевая ткань, обработанная с помощью С-подхода, привела к возникновению 281 ЗОП (в среднем на пациента = 56 +/- 43) после первой недели культивирования, в то время как 250 ЗОП (в среднем на пациента = 50 +/- 41) развились при М-подходе. В течение второй недели культивирования ткани всех пяти пациентов давали более высокие показатели PDO, когда они были получены с помощью С-подхода (801; Среднее значение на пациента = 130 +/- 38) по сравнению с М-подходом (601; Среднее значение на пациента = 76 +/- 44; Р = 0,018). В течение третьей недели культивирования в рамках С-подхода было накоплено в общей сложности 1105 ЗОП от всех пациентов (среднее значение на пациента = 221 +/- 32) по сравнению с 771 ЗОП (среднее на пациента = 155 +/- 34) при М-подходе (P = 0,032). Кроме того, в общей сложности 1195 PDO (среднее значение на пациента = 239 +/- 50) сформировалось после четырех недель культивирования при использовании подхода C по сравнению с 784 (среднее значение на пациента = 157 +/- 36) с использованием подхода M (P < 0,01). Таким образом, метод С показал значительно более высокое количество PDO, начиная со второй недели (рис. 3). Кроме того, относительные колебания количества PDO были оценены для изучения динамических тенденций между последовательными неделями. Анализ выявил впечатляющий всплеск количества PDO во время первоначального перехода от первой к второй неделе подхода C (265%), что свидетельствует о быстром прогрессе. Впоследствии в течение третьей недели наблюдался более низкий рост числа (75%), что отражает временную корректировку. В отличие от этого, М-подход продемонстрировал последовательное и устойчивое увеличение количества ЗОП (92% на второй неделе, соответственно 67% на третьей неделе), что способствовало заметной стабильности подсчетов в течение четвертой недели. Эта устойчивая тенденция к увеличению количества PDO подчеркивает надежность и устойчивость подхода C на протяжении всего периода наблюдения.

Два пациента с ГБМ и один пациент с ЛГГ были включены для анализа числа астроцитов (GFAP) в PDO, пролиферации клеток PDO (Ki67) и апоптоза (CC3). Определенное количество астроцитов не выявило существенных различий между двумя методами обработки, в среднем 43% при подходе С и 45% при подходе М (Рисунок 4 и Рисунок 5, Дополнительный рисунок 1 и Дополнительный рисунок 2). Аналогичным образом, темпы распространения в ЗОП были сопоставимы между подходами С (3%) и М (1%). Только PDO, полученные с помощью С-подхода от пациента 5, показали скорость пролиферации 26% по сравнению с 1% при М-подходе (P = 0,001; Рисунок 4В). В целом низкие показатели апоптоза были выявлены в ЗОП, обработанных с помощью подхода С (3%) по сравнению с 2% при подходе М для всех пациентов, которые существенно не отличались (рис. 5С). Кроме того, не было существенной разницы между этими двумя методами в отношении количества астроцитов, подвергающихся апоптозу (рис. 5D).

Figure 1
Рисунок 1: Графический обзор процесса производства органоидов, полученных от пациента (PDO), с использованием автоматизированного измельчителя в сравнении с ручным подходом. На рисунке показаны различные этапы, включая (A) сбор образцов, (B) вскрытие опухолевого материала, (C) промывку и (D) инкубацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Морфология PDO в течение первой недели культивирования. Сравнение образования ЗОП после вскрытия как автоматическим измельчителем, так и ручным методом. Масштабные линейки = 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Количество PDO в течение первых четырех недель культивирования. На оси X отображается время в неделях (W), а на оси Y — количество PDO подхода C (синий) и M (красный) (n = 5). Каждая точка данных представляет среднее значение, а столбцы погрешности указывают стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Скорость пролиферации клеток в PDO. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения (n = 3) GFAP-положительных клеток (зеленый), Ki67-положительных клеток (красный) и DAPI (синий) в PDO у пациентов 3, 4 и 5 (Таблица 1). Все PDO обрабатывались с использованием измельчителя (С) и ручного (М) методов. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Сравнение двух методов относительно относительного числа GFAP-положительных клеток, (C) Ki67-положительных клеток и (D) Ki67/GFAP-двойных положительных клеток. Незначимые результаты обозначаются знаком "ns". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Скорость апоптоза в ЗОП. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения (n = 3) GFAP-положительных клеток (зеленый), CC3-положительных клеток (красный) и DAPI (синий) в ЗОП у пациентов 3, 4 и 5 (Таблица 1). Все PDO обрабатывались с использованием измельчителя (С) и ручного (М) методов. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Сравнение двух методов относительно относительного числа GFAP-положительных клеток, (C) CC3-положительных клеток и (D) CC3/GFAP-двойных положительных клеток. Незначимые результаты обозначаются знаком "ns". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Характеристика пациентов и клинические показатели. GBM = глиобластома, ИДГ-дикий тип, ЦНС 4 степени по классификации ВОЗ; LGG = глиома низкой степени злокачественности; KPS = оценка производительности Карновского; MGMT = O 6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза; IDH1 = изоцитратдегидрогеназа 1, IDH2 = изоцитратдегидрогеназа 2, ATRX = α-талассемия/умственная отсталость, Х-сцепленный ген; M = морфология; CC = количество ячеек; p = пролиферация; А = апоптоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Средние составы. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax pencillin стрептомицин амфотерицин B. PDO = органоиды, полученные от пациентов DMEM: модифицированная среда Дульбекко. NEAA: заменимые аминокислоты. Стрептококк ручки: Пенициллин / Стрептомицин Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Обзор используемых методов для создания моделей клеточных культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Отдельные каналы пролиферационного окрашивания PDO. (A) DAPI (синий), (B) GFAP-положительные клетки (зеленый), (C) Ki67-положительные клетки (красный) и (D) оверлейный канал в PDO у пациентов 3, 4 и 5. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Отдельные каналы апоптозного окрашивания ЗОП. (A) DAPI (синий), (B) GFAP-положительные клетки (зеленый), (C) CC3-положительные клетки (красный) и (D) оверлейный канал в PDO у пациентов 3, 4 и 5. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В этом исследовании представлен быстрый и эффективный метод создания PDO. GBM остается сложной для лечения опухолью, часто характеризующейся рецидивом и высоким бременем заболевания 3,6. Срочно необходимы инновационные терапевтические подходы, поскольку многообещающие результаты, наблюдаемые in vitro, часто не демонстрируют эффективность in vivo во время испытаний I фазы. Одной из причин этого расхождения может быть ограниченная способность иммортализированных клеточных линий, выращенных в монослойных культурах, отражать сложные межклеточные взаимодействия и генетические свойства родительской опухоли. Учитывая высокую меж- и внутриопухолевую гетерогенность GBM 8,9, персонализированная таргетная терапия является предпочтительной и может иметь перспективы для будущего применения. В отличие от 2D-адгезивных клеточных линий, органоиды обладают способностью сохранять свойства родительскойткани, однако сложные межклеточные взаимодействия между опухолью и нормальным мозгом имеют первостепенное значение и потенциально могут быть упущены из виду этой моделью. Тем не менее, ручная генерация PDO является трудоемким процессом, а повреждение тканей, вызванное сдавливанием скальпелем во время резки, может препятствовать успешному росту PDO. Поэтому был оптимизирован автоматизированный метод с использованием измельчителя тканей для создания большего количества PDO с меньшими затратами времени и усилий. Кроме того, мы продемонстрировали, что общая скорость пролиферации и апоптоза не различалась между двумя подходами.

Подход C прост, прост в реализации и позволяет генерировать большее количество PDO (рис. 3). Ротация ткани между вторым и третьим раундами измельчения была определена как критический шаг в протоколе. На этом этапе ткань уже потеряла целостность и может легко развалиться, в результате чего получаются более крупные куски, требующие дополнительного разрезания или ручного препарирования под микроскопом. В то время как автоматизированный подход с помощью измельчителя позволяет задавать размер резки с большей точностью, при ручном подходе отсутствует точность определения размера PDO, что приводит к неравномерной форме и размеру PDO, что является недостатком для сравнительного скрининга лекарственных средств (Рисунок 2). Тем не менее, с помощью предлагаемого метода стандартизация количества клеток для каждого PDO не достигается, что потенциально может стать недостатком для стандартизированных протоколов скрининга лекарственных средств. Преимущества и недостатки различных методов генерации органоидов 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 и их применение сведены в таблицу 3.

Ткань GBM может варьироваться по консистенции, от жесткой (зона инфильтрации) до мягкой (некротическое ядро), что может создать проблемы для автоматизированного подхода с помощью измельчителя. Если ткань слишком жесткая, измельчитель может сдавить и повредить ее, в то время как слишком мягкие ткани могут быть раздавлены. Выбранная ткань демонстрировала отличительные признаки, в том числе промежуточный уровень упругости, спорадически отличаясь розовато-сероватой окраской, а не коричневым или желтым обесцвечиванием. Ткань, обладающая губчатой и легко рассыпающейся текстурой, продемонстрировала превосходную сохранность в агарозных блоках, в то время как чрезвычайно нежная и разжиженная опухолевая ткань была исключена из процедуры забора. Тем не менее, метод измельчения позволил успешно создать большее количество PDO по сравнению с ручным подходом, даже при неоптимальной консистенции ткани. Ключевым решением является поддержание тесного взаимодействия с хирургом, выполняющим резекцию опухоли, для обработки тканей из разных областей опухоли. В случаях неоптимальной консистенции ткани полезно было вручную доработать ткань под микроскопом после измельчения. Чтобы учесть гетерогенность, опухолевую ткань первоначально разделили на шесть сегментов, каждый из которых впоследствии был разделен пополам для подхода С или М. В пределах этих шести отдельных разделов ожидается существенная степень гетерогенности. Более того, даже в пределах ЗОП из одного и того же участка или скважины наличие различных субпопуляций вполне вероятно.

В качестве доказательства концепции, данные о пролиферации и апоптозе были получены от двух пациентов с GBM и одного пациента с LGG, которые не показывают существенных различий между двумя методами. Генерация PDO не ограничивается высокозлокачественными опухолями головного мозга, но также может применяться к LGG. В этом исследовании подчеркивается, что LGG редко демонстрируют рост в 2D-культуре, что делает разработку точной модели для их исследования очень ценной. Этот протокол призван продемонстрировать универсальность этого подхода в быстром и эффективном генерировании PDO из GBM, а также LGG.

В целом, PDO могут быть использованы в будущем для ориентированного на пациента дотерапевтического тестирования таргетной терапии при злокачественных опухолях головного мозга. Предоставление быстрого и эффективного метода индивидуального скрининга лекарственных препаратов имеет решающее значение, поскольку прогрессирование опухоли происходит быстро, и отчаянно необходимы варианты лечения. В качестве следующего шага модель PDO может быть оценена с помощью различных иммунотерапевтических подходов, чтобы лучше имитировать реальные ответы на лечение. В будущем PDO могут быть использованы для получения сложных выводов о необходимости дальнейшего изучения и оценки методов лечения в клинических условиях.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследование финансировалось Междисциплинарным центром клинических исследований (IZKF, B-450) в Вюрцбурге, Баварским центром исследования рака (BZKF) и изданием при поддержке Издательского фонда открытого доступа Вюрцбургского университета. Благодарим за техническую поддержку Дагмар Хеммерих и Зиглинду Кюнель, отделение экспериментальной нейрохирургии отделения нейрохирургии Университетской клиники Вюрцбурга. Рисунок 1 был создан с помощью www.biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol (1000x) Gibco 21985023
30% formaldehyde methanol-free Carl Roth 4235.1 Used in 4% concentration
70% ethanol solution For sterilisation 
Agarose tablets 0.5 g Carl Roth HP67.7
Amphotericin B 250 µg/mL Gibco 15290018
Anatomical forceps  Hartstein  N/A
Anatomical spatula  Hartstein  N/A
B-27 Supplement without vitamin A (50x) Gibco 12587010
Biopsy cassette with cover Resolab 37001-b
Blades for McIlwain Tissue Chopper Campden instruments Model TC752-1
CC3 antibody (Asp 175) Cells signaling technology 9661
Disposable scalpel  Feather  0200130015
Distilled water Gibco 15230089 To dilute the formaldehyd
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) Gibco 11330032 Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma Life Sciences D8537-500ML Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 433357
Falcon tube 50 ml Cellstar Greiner Bio-One 227261
GFAP antibody Santa Cruz Biotechnology sc33673
Glass beaker  N/A  N/A
Glass petri dish N/A N/A
GlutaMAX (100x) Gibco 35050061
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo scientific 51032875
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet Thermo scientific 5016643
Hibernate-A Gibco A1247501
Histoacryl glue B. Braun surgical 1050052
Human Insulin, Solution Santa Cruz Biotechnology sc-360248
Ice box  N/A  N/A
Ki67 antibody Abcam ab16667
McIlwain Tissue Chopper Cavey Laboratory Engineering 51350V
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B Leica DMI6000B For brightfield and immunofluorescence pictures
Microscope stereozoom S9D Leica W841832 For manual cutting and to organoids monitoring
Microwave Bosch N/A To heat the agarose solution
Mounting plastic discs Cavey Laboratory Engineering 51354
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) Gibco 11140050
Neurobasal (1x) Gibco 21103049
Orbital shaking machine Rotamax120 Heidolph 10304491
Penicilin Streptomycin Gibco 15140122
Plastic petri dishes Cellstar greiner bio-one 628160 n = 12
Single channel pipette 1000 µm Eppendorf 4924000010
Single channel pipette 5000 µm Eppendorf EP3123000276
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 IBM
Surgipath Paraplast Leica 39601006 Embedding medium
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate Thermo Scientific 174932

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gatto, L., et al. IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment. Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).
  2. Buckner, J. C., et al. Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma. N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).
  3. Grochans, S., et al. Epidemiology of glioblastoma multiforme-literature review. Cancers (Basel). 14 (10), 2412 (2022).
  4. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma). N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  5. Herrlinger, U., et al. Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).
  6. Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial. Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).
  7. Desbaillets, N., Hottinger, A. F. Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective. Cancers (Basel). 13 (15), 3721 (2021).
  8. Gularyan, S. K., et al. Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS). Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).
  9. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  10. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  11. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
  12. Timerman, D., Yeung, C. M. Identity confusion of glioma cell lines. Gene. 536 (1), 221-222 (2014).
  13. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  14. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  15. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  16. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  17. Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).
  19. da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
  20. Hubert, C. G., et al. A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).
  21. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  22. Nickl, V., et al. Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields). Cancers (Basel). 14 (21), 5177 (2022).
  23. Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: http://lafayetteinstrument.com (2023).
  24. Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy. Front Oncol. 10, 604121 (2020).
  25. Golebiewska, A., et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology. Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).
  26. Bougnaud, S., et al. Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma. Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).
  27. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).
  28. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
  29. Kato, H., Ogawa, T. A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments. J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).
  30. Teyler, T. J. Brain slice preparation: hippocampus. Brain Res Bull. 5 (4), 391-403 (1980).
  31. Schulz, E., et al. Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).
  32. Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors. STAR Protoc. 1 (3), 100192 (2020).
  33. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  34. Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  35. Li, X., et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).
  36. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
  37. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94 (2022).
  38. Toh, Y. C., et al. A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).
  39. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  40. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  41. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  42. Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L. Bioprinting of organoids. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 271-282 (2015).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 203
Культивирование органоидов глиомы ex vivo, полученных от пациентов, с помощью измельчителя тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alsalkini, M., Cibulková, V.,… More

Alsalkini, M., Cibulková, V., Breun, M., Kessler, A. F., Schulz, T., Cattaneo, A., Wipplinger, C., Hübner, J., Ernestus, R. I., Nerreter, T., Monoranu, C. M., Hagemann, C., Löhr, M., Nickl, V. Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper. J. Vis. Exp. (203), e65952, doi:10.3791/65952 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter