生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

Summary

遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、感覚ニューロンシグナル伝達の堅牢な集団レベルの分析を可能にします。本研究では、ラット三叉神経節ニューロン活性の in vivo GECI可視化を可能にする新しいアプローチを開発しました。

Abstract

遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、標的細胞集団における細胞内カルシウムの変化をモニターするイメージング技術を可能にします。GECIはS/N比が大きいため、感覚ニューロンの刺激誘発活動を検出するための強力なツールとなります。GECIは、同時に研究できるニューロンの数で符号化されている刺激の集団レベルの分析を容易にします。この集団コード化は、 in vivoで最も適切に行われる。背根神経節(DRG)は、首の下の体細胞および内臓構造を神経支配する感覚ニューロンの体細胞を収容しており、これらの構造に比較的簡単にアクセスできるため、 in vivo イメージングに最も広く使用されています。最近では、この技術がマウスで使用され、口腔および頭蓋顔面構造を神経支配する三叉神経節(TG)の感覚ニューロンを研究しました。三叉神経痛などの感覚ニューロン活動の変化を反映していると思われる口腔および頭蓋顔面構造に特異的な疼痛症候群の長いリストを含む、DRGに加えてTGを研究する理由はたくさんあります。マウスは、遺伝的ツールが利用できるため、DRGおよびTGニューロンの研究で最も広く使用されています。しかし、サイズの違い、取り扱いの容易さ、および潜在的に重要な種の違いにより、マウスTGニューロンではなくラットを研究する理由があります。そこで、ラットTGニューロンを in vivoでイメージングする手法を開発しました。新生児児(p2)にGCaMP6をコードするAAVを腹腔内に注射したところ、TGニューロンとDRGニューロンの両方が>90%感染しました。TGは開頭術と皮質消毒後に成人で視覚化され、GCaMP6s蛍光の変化は、顔の下顎および上顎領域の刺激後のTGニューロンでモニターされました。蛍光の増加は末梢神経ブロックによる刺激誘発であることを確認した。このアプローチには多くの潜在的な用途がありますが、末梢神経損傷後に変化したTGニューロンの亜集団を特徴付けるために使用しています。

Introduction

身体感覚は、皮膚や筋肉、骨、内臓などの身体構造に影響を与える機械的、熱的、化学的刺激の神経コードであり、^{これらの構造を}神経支配する一次求心性ニューロンの活動から始まります1。単一ユニットベースの電気生理学的アプローチは、このプロセスに関与する求心性サブタイプと、それらの刺激応答特性が時間の経過とともにどのように変化するかについての豊富な情報を提供しています^1,2,3。しかし、特定の感覚モダリティがニューロンの特定のサブポピュレーションによって伝達されることを示唆する標識線理論を支持する強力な証拠が残っている一方で、ニューロンの多くのサブポピュレーションが同じタイプの機械的、熱的、および化学的刺激に応答する能力は、体性感覚刺激の大部分がニューロンの複数のサブポピュレーションによってコードされていることを示唆しています^4。5.したがって、体性感覚をよりよく理解するには、数百とは言わないまでも、数十のニューロンの活動を同時に研究する能力が必要です。

比較的最近の共焦点およびそれに続く多光子およびデジタルイメージング技術の出現による光学的アプローチの進歩により、ニューロン活動の比較的非侵襲的な集団レベルの分析を実行する能力が容易になりました^6,7。この技術の応用における最後のハードルの1つは、神経活動の光学的評価を可能にするツールの開発でした。活動電位の速度がミリ秒未満で開始および終了することを考えると、活動電位の速度で膜電位の変化に追従する能力を備えた電位感受性色素は、この目的に理想的なツールです。しかし、この分野では驚異的な進歩がありました^{が7、8、9、10}、これらの色素の多くは、単一細胞レベルで数百のニューロンの集団分析を可能にするには、まだ十分に高くありません。代替アプローチとして、研究者は細胞内^Ca2+濃度([^Ca2+]_i)の変化をモニタリングすることに目を向けました。この戦略の限界は当初から明らかであり、[Ca²⁺]_iの増加が神経活動の間接的な尺度であるという事実を含む¹¹。[^Ca2+]_iの増加は、電位依存性^Ca2+チャネル(VGCC)の活性化に関連する^Ca2+流入とは無関係に起こり得ること^12,13;^Ca2+トランジェントの大きさと持続時間は、VGCC活性とは無関係なプロセスによって制御され得ること11,12,14;そして、^Ca2+トランジェントの時間経過は、活動電位の時間経過^{をはるかに超えています15}。それにもかかわらず、神経活動の間接的な尺度としての^Ca2+の使用に関連する多くの重要な利点があります。これらのうち、ほとんどの^Ca2+指標に関連するS/N比は、細胞内^Ca2+の変化の大きさと、シグナルが細胞膜の2次元空間ではなく細胞質の3次元空間から生じているという事実の両方を反映しています。さらに、遺伝的にコードされたCa²⁺指標(GECI)の開発により、細胞の特定の亜集団におけるCa²⁺指標の発現を促進する遺伝的戦略を利用することが可能になり、インタクト調製物における集団レベルの分析が容易になります(例えば、¹⁶を参照のこと)。

現在マウスで利用可能な遺伝的ツールの数を考えると、GECIがこの種の中で最も広く使用されていることは驚くことではありません。感覚ニューロンの亜集団における構成的GECI発現を有するマウス系統が開発されている^7,16,17。特定の細胞型でリコンビナーゼを発現するマウス系統の開発により、GECI発現を制御するためにさらに高度な戦略を使用することが可能になった¹⁵。しかし、これらのツールはかつてないほど強力になっていますが、ラットなどの他の種が実験的な問題に適している理由はいくつかあります。これらには、サイズが大きいことが含まれ、小さなマウスでは不可能ではないにしても困難な多くの実験的操作を容易にします。比較的複雑な行動課題におけるラットの訓練の容易さ。そして、ラットの感覚ニューロンにおけるいくつかのイオンチャネルの生物物理学的特性および発現パターンは、ヒトと比較したマウスの同じチャネルよりもヒトの感覚ニューロンで観察されたものとより類似している可能性があるという少なくともいくつかの証拠¹⁸。

体性感覚刺激の伝達は一般に一次求心性神経の末梢末端で起こるが、末梢で開始された活動電位は、中枢神経系に到達する前に、後根(DRG)または三叉神経節(TG)神経節と呼ばれる一次求心性体細胞を収容する構造を通過しなければならない¹⁹。一次求心性軸索に沿って伝播するすべての活動電位が細胞体に侵入するわけではないという証拠があるが²⁰、一次求心性体細胞がT結合を介して主求心性軸索に結合しているという事実の結果として¹⁹、末梢で開始された活動電位の大部分は体細胞²¹に侵入するように見える.これは、GECIを使用して一次求心性における集団コーディングを評価する際に、3つの実験的利点をもたらします:軸索に対する細胞体のサイズが大きいため、[Ca²⁺]_iを求心性活動の間接的な尺度として使用する場合、信号対雑音比がさらに増加します。DRGは一般的に簡単にアクセスできます。また、求心性終末から空間的に離れた部位での活動を評価することで、求心性終末の刺激反応特性に対する神経節を露出させるために必要な手術の潜在的な影響を最小限に抑えることができます。ただし、TGは脳の下(またはパレットの上)にあるため、DRGよりもはるかにアクセスが困難です。さらに、DRGニューロンとTGニューロンの間には多くの類似点がありますが、相違点のリストも増えています。これには、TGにおけるニューロンのほぼ体性構成²²、神経支配されたユニークな構造、異なる中枢末端終末パターン^{23、24、25、26}、そして現在では遺伝子発現^27,28と機能的受容体発現の両方における相違点のリストが拡大している²⁹が含まれる.さらに、疼痛の末梢メカニズムの同定に関心があるため、三叉神経系に特有と思われる疼痛症候群(片頭痛、三叉神経痛、口内灼熱症候群など)が比較的多数あり、一次求心性に異常な活動性が関与しているように見える30,31,32は、TGを直接研究する必要があることを示唆しています。

このように、TGニューロンの刺激応答特性は、マウス¹⁶のGECIを用いて研究されてきたが、上記の理由により、ラットは様々な実験的問題に取り組むのにより適切な種である可能性が示唆されるため、本研究の目的は、ラットのTGニューロンを研究するためにGECIを使用するアプローチを開発することであった。これを達成するために、末梢神経系におけるGECI GCaMP6の発現を促進するウイルスアプローチを利用しました。次に、前脳を切除してTGにアクセスできるようにしました。最後に、機械的刺激と熱的刺激を顔面に当て、神経細胞の反応を蛍光顕微鏡で評価しました。これらのデータを総合すると、ラットを利用して多くの状態下でTGの変化を調査する役割が支持され、三叉神経系の感覚コーディングに関心のある研究者のためのツールキットが拡大されます。

Protocol

研究における動物の使用を含むすべての実験は、国立衛生研究所および国際疼痛学会によって定められた基準に従って実施され、ピッツバーグ大学の施設的動物ケアおよび使用委員会(プロトコル#22051100)によって承認されました。各実験の最後に、ラットは、米国獣医師会とピッツバーグ大学IACUCによって承認されたアプローチである氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の心臓灌流による発疹によ?…

Representative Results

我々は以前、ラットの感覚ニューロンの感染に対するAAV9血清型15で成功を収めていたため、この血清型をラットTGニューロンにおけるGCaMP6の発現に用いた。そこで我々はまず、AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40(AAV9-GCaMP)を仔ラット新生仔に投与した場合の感覚ニューロン感染効率を評価しようとした20。このウイルスは、高レベルの遺伝子発現を駆動および維持するCAGプ?…

Discussion

ここでは、TGをイメージングするためのGECIラットを迅速かつ非侵襲的に作製する方法を実証します。私たちは、高レベルの遺伝子発現を駆動し、維持するためにCAGプロモーターを選択しました。以前の研究では、他のAAV血清型がDRGニューロンの遺伝子発現を効率的に促進する可能性があることが示唆されています³⁹が、私たちの結果は、新生児へのAAVの腹腔内注射に関する?…

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500