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Bio-ingénierie

इंजीनियरिंग टेंडन असेंबलॉइड रोग और मरम्मत में सेलुलर क्रॉसस्टॉक की जांच करने के लिए

Published: March 22, 2024
doi:
10.3791/65987
, ,
1Department of Orthopedics,Balgrist, University Hospital Zurich, University of Zurich, 2Department of Health Sciences and Technology, Institute for Biomechanics,ETH Zurich

Summary

यहां, हम लोड-असर कण्डरा कोर ऊतक और बीमारी और चोट से सक्रिय सेल आबादी वाले एक बाहरी डिब्बे के बीच कण्डरा सेलुलर क्रॉसस्टॉक की नकल करने के लिए एक संयोजन मॉडल प्रणाली प्रस्तुत करते हैं। एक महत्वपूर्ण उपयोग के मामले के रूप में, हम प्रदर्शित करते हैं कि बाहरी एंडोथेलियल कोशिकाओं के रोग-प्रासंगिक सक्रियण की जांच के लिए सिस्टम को कैसे तैनात किया जा सकता है।

Abstract

टेंडन मांसपेशियों की ताकतों को हड्डियों में स्थानांतरित करके हरकत को सक्षम करते हैं। वे एक कठिन कण्डरा कोर पर भरोसा करते हैं जिसमें कोलेजन फाइबर और स्ट्रोमल सेल आबादी शामिल होती है। यह लोड-असर कोर एक श्लेष जैसी ऊतक परत द्वारा शामिल, पोषित और मरम्मत की जाती है जिसमें बाहरी कण्डरा डिब्बे शामिल होते हैं। इस परिष्कृत डिजाइन के बावजूद, कण्डरा की चोटें आम हैं, और नैदानिक उपचार अभी भी फिजियोथेरेपी और सर्जरी पर निर्भर करता है। उपलब्ध प्रयोगात्मक मॉडल प्रणालियों की सीमाओं ने उपन्यास रोग-संशोधित उपचार और रिलैप्स-रोकथाम नैदानिक शासनों के विकास को धीमा कर दिया है।

विवो में , मानव अध्ययन मरम्मत सर्जरी के दौरान नमूना किए गए अंत-चरण रोगग्रस्त या टूटे हुए ऊतकों के लिए स्वस्थ tendons की तुलना करने के लिए सीमित हैं और अंतर्निहित कण्डरा रोग के अनुदैर्ध्य अध्ययन की अनुमति नहीं देते हैं। विवो में पशु मॉडल भी अपारदर्शी शारीरिक जटिलता, जानवरों पर नैतिक बोझ और उनके उपयोग से जुड़ी बड़ी आर्थिक लागतों के बारे में महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, विवो पशु मॉडल में दवाओं और बहुकोशिकीय, बहु-ऊतक बातचीत मार्गों की व्यवस्थित जांच के लिए खराब अनुकूल हैं। इन विट्रो मॉडल सिस्टम में सरल भी कम हो गया है। एक प्रमुख कारण कण्डरा कोशिकाओं और उनके कार्य का सार्थक अध्ययन करने के लिए आवश्यक त्रि-आयामी यांत्रिक लोडिंग को पर्याप्त रूप से दोहराने में विफलता है।

यहां प्रस्तुत नई 3 डी मॉडल प्रणाली म्यूरिन टेल टेंडन कोर एक्सप्लांट्स का शोषण करके इनमें से कुछ मुद्दों को कम करती है। महत्वपूर्ण रूप से, ये एक्सप्लांट एक माउस से बड़ी संख्या में आसानी से सुलभ हैं, सेलुलर स्तर पर सीटू लोडिंग पैटर्न में 3 डी बनाए रखते हैं, और विवो जैसे बाह्य मैट्रिक्स में सुविधा देते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मांसपेशियों से व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं, कण्डरा-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स, और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के साथ कोलेजन हाइड्रोगेल के साथ कण्डरा कोर एक्सप्लांट्स को बढ़ाने के तरीके पर चरण-दर-चरण निर्देश दिए जाते हैं ताकि रोग को प्रतिस्थापित किया जा सके- और चोट-सक्रिय सेल आबादी बाहरी कण्डरा डिब्बे के भीतर। यह प्रदर्शित किया जाता है कि बीमारी और चोट के दौरान उभरते बहुकोशिकीय क्रॉसस्टॉक की जांच के लिए परिणामी कण्डरा असेंब्लोइड को यंत्रवत् या परिभाषित माइक्रोएन्वायरमेंटल उत्तेजनाओं के माध्यम से कैसे चुनौती दी जा सकती है।

Introduction

आंदोलन को सक्षम करने के लिए हड्डियों को मांसपेशियों की ताकतों को स्थानांतरित करने के अपने समारोह में, tendons मानव शरीर 1,2,3 में होने वाली सबसे चरम यांत्रिक तनाव में से कुछ का सामना. उम्र बढ़ने समाजों के कारण, मोटापे का प्रचलन बढ़ रहा है, और यंत्रवत् मांग खेल गतिविधियों की बढ़ती लोकप्रियता, कण्डरा रोगों और चोटों की व्यापकताविकसित देशों 4,5,6 में चढ़ाई करने का अनुमान है. इस वृद्धि का मुकाबला करने के लिए उपन्यास साक्ष्य आधारित और रोग संशोधित उपचार regimens के विकास वर्तमान में उपलब्ध मॉडल सिस्टम 1,7,8 की सीमाओं से बाधा उत्पन्न हुई है.

आदर्श रूप से, रोग और चोट की मरम्मत मॉडल यह अध्ययन करने की अनुमति देगा कि लक्ष्य अंग इनपुट मापदंडों के एक परिभाषित सेट (रोग ट्रिगर, तालिका 1 की नकल) को मापने योग्य आउटपुट मापदंडों (रोग हॉलमार्क का प्रतिनिधित्व, तालिका 2 का प्रतिनिधित्व) में कैसे संसाधित करता है, जबकि भ्रमित कारकों के लिए नियंत्रित करता है। इस तरह के मॉडल सिस्टम का उपयोग करने वाले अध्ययन तब बीमारी और चोट की मरम्मत के अंतर्निहित (पैथो-) शारीरिक प्रक्रियाओं की पहचान करने और ज्ञान प्राप्त करने में सक्षम होंगे जिनका उपयोग क्लीनिकों में बीमारी और चोट के निशान को रोकने या कम करने के लिए किया जा सकता है। टेंडन के लिए इस सिद्धांत को लागू करते हुए, एक उपयोगी मॉडल प्रणाली को बीमारी और चोट के लिए विवो कण्डरा प्रतिक्रिया के मध्य भागों को पुन: व्यवस्थित करना चाहिए, जिसमें निम्नलिखित हॉलमार्क शामिल हैं: माइक्रोडैमेज, सूजन, नवसंवहनीकरण, हाइपरसेल्युलरता, त्वरित मैट्रिक्स टर्नओवर, और डिकंपार्टमेंटलाइजेशन 9,10,11,12,13,14,15 . आधार के रूप में इन हॉलमार्क का उपयोग करके, एक सफल कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत मॉडल प्रणाली के लिए निम्नलिखित आवश्यकताओं का अनुमान लगाया जा सकता है।

यांत्रिक अधिभार कण्डरा चोट और रोग रोगजनन में एक केंद्रीय कारक होने की परिकल्पना की है और इस प्रकार माइक्रोडैमेज16 बनाने के लिए एक आम तौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है. इसलिए, नियंत्रणीय यांत्रिक भार क्षमता कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत मॉडल के लिए एक प्रमुख शर्त है। आदर्श रूप से, मॉडल सिस्टम तीन मुख्य मोड को सक्षम बनाता है: सिंगल स्ट्रेच-टू-डैमेज लोडिंग, थकान लोडिंग औरअनलोडिंग 8,17,18। यांत्रिक विरूपण पर, ऊतक निवासी कोशिकाओं तनाव बलों, कतरनी बलों (कोशिकाओं के आसपास कोलेजन फाइबर के फिसलने के कारण), और उतराई के दौरान या enthesis19,20 के पास होने वाली संपीड़न बलों का एक जटिल संयोजन अनुभव. मॉडल सिस्टम को इन जटिल लोडिंग पैटर्न को यथासंभव बारीकी से फिर से बनाना चाहिए।

मैट्रिक्स माइक्रोडैमेज को पेश करने का एक वैकल्पिक तरीका जैव रासायनिक तनावों का लाभ उठाना है जो कण्डरा रोग और चोट के लिए प्रणालीगत पूर्वाग्रहों की नकल करते हैं, जैसे (प्रो-) भड़काऊ साइटोकिन्स, ऑक्सीडेटिव तनाव, या उच्च ग्लूकोज सांद्रता 21,22,23। नतीजतन, एक नियंत्रणीय आला माइक्रोएन्वायरमेंट एक कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत मॉडल प्रणाली के लिए फायदेमंद है।

सूजन, नवसंवहनीकरण, और hypercellularity पुनरावृत्ति करने में सक्षम होने के लिए मॉडल सिस्टम के लिए एक आम शर्त सेल आबादी है कि इन प्रक्रियाओं24 ड्राइव की चयनात्मक उपस्थिति है. भड़काऊ प्रक्रियाओं के लिए, इन आबादी में न्यूट्रोफिल, टी-कोशिकाएं और मैक्रोफेज शामिल हैं, जबकि एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स को नवसंवहनीकरण 25,26,27,28,29का अध्ययन करने की आवश्यकता होगी। कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट न केवल कण्डरा की मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं, बल्कि प्रोलिफेरेटिव और माइग्रेटिंग कोशिकाओं के रूप में, कण्डरा रोग30,31,32,33,34,35,36में देखे गए स्थानीय हाइपरसेल्युलरिटी के लिए भी आंशिक रूप से जिम्मेदार हैं।

निवासी सेल आबादी में परिवर्तन के अलावा, कण्डरा मैट्रिक्स संरचना कण्डरा रोग और चोट के रूप में अच्छी तरह से 7,37,38,39,40 में बदल जाती है। सही रोग-प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंटल संकेतों को प्रस्तुत करने के लिए, मॉडल सिस्टम को लक्षित बीमारी या चोट चरण से मेल खाने वाली एक बाह्य मैट्रिक्स संरचना को एकीकृत करने में सक्षम होना चाहिए, उदाहरण के लिए, कोलेजन -1, कोलेजन -3 और सेलुलर फाइब्रोनेक्टिन41 के प्रासंगिक आनुपातिक संयोजनों को सक्षम करके।

कण्डरा कोर और बाह्य डिब्बों (यानी, एंडोटेनन, एपिटेनन और पैरेनॉन) में स्वस्थ टेंडन का कम्पार्टमेंटलाइजेशन उनके कार्य के लिए केंद्रीय है और अक्सर रोगग्रस्त या घायल टेंडन 1,42,43,44,45,46,47 में परेशान होता है . कण्डरा मॉडल सिस्टम में 3 डी कण्डरा compartmentalization को शामिल इसलिए न केवल अंतर्निहित de- और फिर से compartmentalization अधिक बारीकी से प्रक्रियाओं अनुकरण करने के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी साइटोकिन्स और पोषक तत्वों48,49 के सही spatiotemporal ढाल स्थापित करने में मदद करता है.

अंत में, प्रतिरूपकता मॉडल सिस्टम का एक और केंद्रीय संपत्ति है, शोधकर्ताओं की जांच प्रक्रियाओं 8,17 के दौरान पहले वर्णित तनाव के बीच के सही रिश्तेदार योगदान और परस्पर क्रिया गठबंधन करने के लिए अनुमति देता है.

इष्टतम इनपुट तौर-तरीकों का चयन करने के अलावा, एक महत्वपूर्ण कदम परिणामी आउटपुट में परिवर्तनों को मापने, निरीक्षण करने और ट्रैक करने में सक्षम है। मॉडल प्रणाली के यांत्रिक गुण (यानी, पैर की अंगुली क्षेत्र की लंबाई, रैखिक लोचदार मापांक, अधिकतम तन्यता तनाव, अधिकतम तन्यता तनाव, थकान शक्ति, और तनाव विश्राम) यहां केंद्रीय हैं, क्योंकि वे कण्डरा के मुख्य कार्य50,51,52की विशेषता रखते हैं। ऊतक-स्तर परिवर्तनों के लिए इन कार्यात्मक परिवर्तनों को जोड़ने के लिए, यह (कोलेजन) संरचनात्मक मैट्रिक्स क्षति का पता लगाने और ट्रैकिंग प्रसार और रोग की भर्ती पर नज़र रखने के तरीकों को सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है- और मरम्मत-प्रासंगिक सेल आबादी 30,53,54,55,56,57,58,59,60.

उभरते सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए, किसी को मात्रा का ठहराव (यानी, एलिसा, प्रोटिओमिक्स, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, फ्लो साइटोमेट्री)14,21,61,62के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन को अलग या चिह्नित करने में सक्षम होना चाहिए। जनसंख्या- या कम से कम डिब्बे-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण भी संभव होना चाहिए (यानी, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई [एफएसीएस], एकल-सेल/थोक आरएनए-अनुक्रमण, और वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर))21,24,27,63. मॉडल प्रणाली को एक ही नमूने पर और कई नमूनों पर उच्च-थ्रूपुट अध्ययनों को अनलॉक करने के लिए पर्याप्त तेजी से उपरोक्त आउटपुट मापदंडों को मापने की अनुमति देनी चाहिए।

मानव कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध मॉडल प्रणालियों में, मानव शरीर ही, निश्चित रूप से, सबसे अधिक प्रतिनिधि है। यह प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के साथ भी कम से कम संगत है। जबकि तीव्र कण्डरा चोटों के साथ रोगियों नैदानिक अध्ययन के लिए प्रचुर मात्रा में उपलब्ध हैं, प्रारंभिक tendinopathy के साथ रोगियों (सबसे आम कण्डरा रोग) काफी हद तक लक्षण मुक्त हैं और अक्सर नैदानिक रूप से पता लगाया जाना जब तक अधिक गंभीर परिवर्तन 14,64,65प्रकट होते हैं. यह महत्वपूर्ण क्षण जब कण्डरा homeostasis पटरी से उतर और इस पटरी से उतरने 16,66,67,68,69 के पीछे तंत्र को इंगित करने के लिए मुश्किल बनाता है. इसके अलावा, स्वस्थ tendons से बायोप्सी निकालने नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि इससे लगातार नुकसान हो सकता है। पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट पुनर्निर्माण सर्जरी से हैमस्ट्रिंग कण्डरा अवशेष अक्सर स्वस्थ नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, लेकिन यकीनन रोटेटर कफ, अकिलीज़ और पेटेलर टेंडन की तुलना में समारोह, यांत्रिक गुणों, सेल आबादी और मैट्रिक्स संरचना में भिन्न होते हैं जो आमतौर पर कण्डरा रोग और चोट70,71,72,73से प्रभावित होते हैं।

विवो में पशु मॉडल अधिक सुलभ और ट्रैक्टेबल हैं, लेकिन उनका उपयोग जानवरों पर एक महत्वपूर्ण नैतिक बोझ और शोधकर्ताओं पर आर्थिक लागत लगाता है। इसके अलावा, अधिकांश लोकप्रिय मॉडल जानवर या तो अनायास टेंडिनोपैथिक घावों (यानी, चूहों, चूहों, खरगोशों) को विकसित नहीं करते हैं या इसमें शामिल बहुकोशिकीय संचार मार्गों (यानी, घोड़े, खरगोश) को ट्रैक करने के लिए आवश्यक प्राइमरों और आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की कमी होती है।

इन विट्रो मॉडल सिस्टम में सरल 2 डी जटिलता/ट्रैक्टेबिलिटी स्पेक्ट्रम के दूसरी तरफ हैं और ट्रिगर्स 8,74 के अधिक नियंत्रणीय सेट के जवाब में विशिष्ट अंतरकोशिकीय संचार मार्गों के नियंत्रित, समय-कुशल अध्ययन की बेहतर अनुमति देते हैं। हालांकि, ये सरलीकृत प्रणालियां आमतौर पर बहु-आयामी यांत्रिक लोडिंग (यानी, तनाव, संपीड़न और कतरनी) को पुन: व्यवस्थित करने में विफल रहती हैं जो कण्डरा कार्यक्षमता के लिए केंद्रीय है। इसके अलावा, (बहुत) टिशू कल्चर प्लास्टिक की उच्च कठोरता ब्याज75,76 की रोग राज्य की नकल करने के उद्देश्य से कोटिंग्स द्वारा प्रदान की गई किसी भी मैट्रिक्स संकेतों ओवरराइड करते हैं.

इस खामी को दूर करने के लिए, तेजी से परिष्कृत ऊतक-इंजीनियर 3 डी मॉडल सिस्टम को एक लोड करने योग्य मैट्रिक्स प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है जिसकी संरचना कम से कम आंशिक रूप से वांछित रोगराज्य 77,78,79से मेल खा सकती है। फिर भी, इन प्रणालियों को न केवल विवो बाह्य मैट्रिक्स रचनाओं और सेलुलर लोडिंग पैटर्न में जटिल को सही ढंग से दोहराने के लिए संघर्ष है, लेकिन आम तौर पर लंबी अवधि की लोडेबिलिटी और पार कम्पार्टमेंटल संचार रास्ते है कि कण्डरा रोग समन्वय अध्ययन करने के लिए आवश्यक कम्पार्टमेंटल इंटरफेस की कमी है और चोट की मरम्मत 48,49,80.

पूर्व विवो कण्डरा एक्सप्लांट मॉडल सिस्टम में विवो जैसी मैट्रिक्स संरचना में एक अंतर्निहित का विशिष्ट लाभ होता है जिसमें पेरिसेल्युलर निचे, क्रॉस-कम्पार्टमेंटल बाधाएं, साथ ही स्पैटिओटेम्पोरल साइटोकाइन / पोषक तत्व ग्रेडिएंट शामिल होते हैं और जब बढ़ाया जाता है तो जटिल लोडिंग पैटर्न को पुन: व्यवस्थित करताहै 8. आकार पर निर्भर पोषक तत्व प्रसार सीमा का एक परिणाम के रूप में, बड़े पशु मॉडल (यानी, घोड़ों) से explants कण्डरा रोग और चोटकी मरम्मत 81,82,83 के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए जीवित रखने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. इस बीच, murine प्रजातियों (यानी, Achilles कण्डरा, पटेलर कण्डरा) से छोटे explants reproducibly क्लैंप और यंत्रवत् लोड करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं. उनका आकार भी सामग्री की मात्रा को बाधित करता है जिसे सेल-, प्रोटीन- और जीन-स्तरीय रीडआउट के लिए नमूनों को पूल किए बिना और थ्रूपुट को कम किए बिना इकट्ठा किया जा सकता है। इस अर्थ में, murine पूंछ कण्डरा फासिकल्स कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत के उच्च-थ्रूपुट अध्ययन को अनलॉक करने की क्षमता प्रदान करते हैं क्योंकि वे एक ही माउस से बड़ी मात्रा में आसानी से उपलब्ध होते हैं, विवो पेरिसेलुलर मैट्रिक्स संरचना में परिसर को संरक्षित करते हैं, और सेलुलर लोडिंग पैटर्न को पुन: व्यवस्थित करते हैं। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, हालांकि, वे अपने अधिकांश बाहरी डिब्बे खो देते हैं और उसमें संवहनी, प्रतिरक्षा, और फाइब्रोब्लास्ट आबादी होती है जिसे अब कण्डरा रोग चलाने और 8,18 की मरम्मत करने के लिए माना जाता है।

इस अंतर को पाटने के लिए, 3 डी हाइड्रोजेल-आधारित मॉडल सिस्टम के फायदों के साथ म्यूरिन टेल टेंडन-व्युत्पन्न कोर एक्सप्लांट्स के फायदों को मिलाकर एक मॉडल प्रणाली विकसित की गई है। इस मॉडल प्रणाली में एक सेल से लदी (कोलेजन -1) हाइड्रोजेल पूंछ कण्डरा explants84,85 के आसपास डाली के होते हैं. इस पत्र में, आवश्यक विनिर्माण कदम उपयोगी रीडआउट के साथ विस्तार से प्रदान किए जाते हैं जो एंडोथेलियल सेल-लेटे हुए टाइप -1 कोलेजन हाइड्रोजेल (बाहरी डिब्बे) के भीतर कोर एक्सप्लांट्स (आंतरिक डिब्बे) को सह-संवर्धन करके प्राप्त किया जा सकता है।

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को जिम्मेदार अधिकारियों (कैंटन ज्यूरिख लाइसेंस नंबर ZH104-18 और ZH058-21) द्वारा अनुमोदित किया गया था। एक सिंहावलोकन चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है. 1. 12-15 सप्ताह पुराने चूहों (यानी, बी 6 / जे-आरजे) से कण्डरा संयोजन घटकों का अलगाव सीओ2 गैस प्रेरित श्वासावरोध के माध्यम से चूहों इच्छामृत्यु . उपज को अधिकतम करने के लिए, एक समय में 3 से अधिक चूहों की प्रक्रिया नहीं करते हैं और इच्छामृत्यु के तुरंत बाद सेल अलगाव के साथ आगे बढ़ें। न्यूमोथोरैक्स के द्विपक्षीय प्रेरण द्वारा मृत्यु सुनिश्चित करें। 80% इथेनॉल के साथ माउस त्वचा बाँझ और एक बाँझ जैव सुरक्षा हुड के लिए माउस ले जाएँ. पूंछ कण्डरा कोर एक्सप्लांट्स को अलग करें।एक स्केलपेल (नंबर 21) का प्रयोग करने के लिए यह अपने आधार पर काटने से माउस से पूंछ को अलग करने के लिए. पूंछ की नोक से शुरू करते हुए, इसे चिमटी से पकड़ें और त्वचा को तोड़ने के लिए इसे हिलाएं। फिर, धीरे चिमटी दूर पूंछ से खींच कण्डरा कोर explants बेनकाब करने के लिए. कण्डरा कोर एक्सप्लांट्स को मानक संस्कृति माध्यम (डीएमईएम/एफ12 + 10% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड) में रखें और उन्हें एक ताजा स्केलपेल ब्लेड (नंबर 21) का उपयोग करके खींची गई पूंछ के हिस्से से अलग करें। दोहराएँ 1.4.2 कदम. और 1.4.3। जब तक पूरी पूंछ संसाधित नहीं हो जाती है और कण्डरा एक्सप्लांट 25 मिमी से कम हो जाता है। एक ताजा स्केलपेल ब्लेड (नंबर 21) का उपयोग करके 25 मिमी लंबे टुकड़ों में पृथक कोर एक्सप्लांट्स को काटें। एक संलग्न डिजिटल सी-माउंट कैमरा के माध्यम से एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से जुड़े प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ कोर एक्सप्लांट्स के औसत व्यास को मापें।बिंदु का उपयोग करें और दाईं ओर लाइन माप उपकरण का चयन करने के लिए क्लिक करें। तीन अलग-अलग स्थानों पर एक्सप्लांट व्यास को मापें और उनके माध्य व्यास की गणना करें। बाद में क्लैंपिंग और यांत्रिक परीक्षण की सुविधा के लिए, केवल 100 माइक्रोन से अधिक औसत व्यास वाले कोर एक्सप्लांट के साथ आगे बढ़ें। मानक संस्कृति की स्थिति (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2, सीरम पूरकता) के लिए प्रदर्शनी के साथ संयुक्त उतराई अलगाव के बाद 6 घंटे के भीतर जीन अभिव्यक्ति को बदलता है और 7 दिनों21 के भीतर गिरावट में परिणाम देता है। एक अर्ध-होमोस्टेटिक अवस्था के साथ शुरू करने के लिए, कण्डरा संयोजन का उत्पादन करें और कण्डरा कोर अलगाव के तुरंत बाद प्रयोग शुरू करें। प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर, नियंत्रण समूह के रूप में विघटित कण्डरा कोर एक्सप्लांट की आवश्यकता होती है। कण्डरा कोर एक्सप्लांट्स को विघटित करने के लिए, उन्हें चिमटी का उपयोग करके 5 एस के लिए तरल नाइट्रोजन से भरे एक छोटे कंटेनर में फ्रीज करें और फिर उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 एस के लिए पिघलाएं। इस फ्रीज-पिघलना चक्र को 3 बार दोहराएं और चरण 4 (“कोर एक्सप्लांट्स को क्लैंपिंग”) के साथ आगे बढ़ें।चेतावनी: तरल नाइट्रोजन ठंड जलने का कारण बन सकता है, श्वासावरोध, और कई साधारण सामग्री emrittles. केवल कम तापमान वाले तरल पदार्थों के लिए डिज़ाइन किए गए कंटेनरों का उपयोग करें और सुरक्षात्मक कपड़े पहनें (यानी, चेहरा ढाल, उपयुक्त दस्ताने, बंद-शीर्ष जूते)। कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट को अलग करें।माउस के पैर के बीच में एक transversal चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल (नंबर 21) का प्रयोग करें. इस चीरे के प्रत्येक छोर से पिछले पैरों के किनारों के साथ और कूल्हों तक पैर के लंबवत दो कट बनाएं। पैर पर कट-आउट त्वचा फ्लैप को ठीक करने के लिए चिमटी का उपयोग करें और बछड़े की मांसपेशियों को कवर करने वाली त्वचा को छील दें। एक ही माउस से एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करते समय, इसके बजाय सभी त्वचा को हटा दें। एक ताजा स्केलपेल ब्लेड (नंबर 21) के साथ कैल्केनस हड्डी से अकिलीज़ कण्डरा को अलग करें। चिमटी के साथ Achilles कण्डरा के ढीले अंत को ठीक करें और गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी से दूसरे छोर को अलग करें। पीबीएस में एक बार Achilles कण्डरा धो लें और केवल सफेद कण्डरा ऊतक रहता है जब तक सभी शेष मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए स्केलपेल (नंबर 21) का उपयोग करें. यदि एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक ही माउस से अलग किया जाता है, तो पीबीएस में अकिलीज़ कण्डरा छोड़ दें और चरण 1.6 के साथ जारी रखें। पहला। एक जानवर से एच्लीस टेंडन को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में पूल करें जिसमें 10 एमएल कण्डरा पाचन माध्यम (डीएमईएम / एफ 12 + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज 1) और 6-8 घंटे के लिए पचाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस धीमी, निरंतर आंदोलन 15 आरपीएम पर कम गति कक्षीय शेकर का उपयोग करना। आरटी पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर पचाए गए कण्डरा समाधान को अपकेंद्रित्र करें, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें, और मानक संस्कृति माध्यम (डीएमईएम/एफ12 + 10% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड) के 8 एमएल में पुन: निलंबित करें, और मानक संस्कृति स्थितियों के तहत एक टी 25 संस्कृति फ्लास्क में संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) मीडिया परिवर्तन के बिना 7 दिनों के लिए। उसके बाद, प्रति सप्ताह एक बार मीडिया बदलें। एक T150 संस्कृति फ्लास्क (1:6) में 80% संगम पर कोशिकाओं को विभाजित करें. बाँझ फ़िल्टर्ड फ्रीजिंग माध्यम (70% डीएमईएम/एफ12 + 20% एफबीएस + 10% डीएमएसओ) के 2 एमएल में पारित 2 पर कोशिकाओं को फ्रीज करें जो दो 1.5 एमएल क्रायोट्यूब को वितरित किए गए हैं और उन्हें आगे उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। टिशू कल्चर प्लास्टिक से कोशिकाओं को हटाने के लिए ट्रिप्सिन का प्रयोग करें। मांसपेशी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करें।यदि कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट एक ही माउस से अलग नहीं हैं, तो चरण 1.5.1 और 1.5.2 से शुरू करें। कूल्हे के जोड़ को काटकर हिंद पैरों को शरीर से अलग करने के लिए कैंची का उपयोग करें। ठंड पीबीएस (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में एक बार hindlegs धो लें, एक स्केलपेल (नंबर 21) के साथ मांसपेशियों (quadriceps femoris, extensor digitorum longus, एकमात्र, और gastrocnemius) को हटा दें, और बर्फ पर एक पेट्री डिश में मांसपेशियों जगह. पेट्री डिश को बर्फ पर रखते हुए 1 मिमी3 से छोटे टुकड़ों में मांसपेशियों के ऊतकों को कीमा बनाने के लिए एक ताजा स्केलपेल ब्लेड (नंबर 21) का उपयोग करें। दोनों हिंदलेग्स से कीमा बनाया हुआ मांसपेशियों के ऊतकों को 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में पूल करें जिसमें मांसपेशियों के पाचन माध्यम (पीबीएस + 2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेज IV + 2 मिलीग्राम/एमएल डिस्पेस II + 2 एमएम सीएसीएल2) शामिल हैं। प्लास्टिक ट्यूब को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। सख्ती से समाधान हिला और यह एक और 10 मिनट के लिए वापस जगह है. तब तक दोहराएं जब तक कि घोल समरूप न हो जाए और कण्डरा और प्रावरणी के केवल (सफेद) टुकड़े रह जाएं (सीए 4 x 10 मिनट)। इस बीच, कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट अलगाव या मैक्रोफेज अलगाव के साथ जारी रखें। पाचन को रोकने के लिए प्लास्टिक ट्यूब में ठंड पीबीएस + 10% एफबीएस के 12.5 एमएल जोड़ें। प्लास्टिक ट्यूब से निलंबन महाप्राण करने के लिए एक 50 एमएल विंदुक के साथ सुसज्जित एक बैटरी चालित विंदुक धारक का प्रयोग करें. प्लास्टिक ट्यूब को 400 माइक्रोन सेल छलनी से लैस करें और मलबे को हटाने के लिए निलंबन को फ़िल्टर करें। एक 100 माइक्रोन सेल छलनी के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ. आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर फ़िल्टर्ड निलंबन अपकेंद्रित्र। ठंड पीबीएस + 10% एफबीएस के 10 एमएल में फिर से निलंबित करें और फिर से अपकेंद्रित्र। जनसंख्या चयन के लिए प्यूरोमाइसिन (4 मिलीग्राम/एमएल) के साथ पूरक एंडोथेलियल कल्चर माध्यम के 8 एमएल (डीएमईएम/एफ12 और एंडोपैन 3 किट + 10 यू/एमएल हेपरिन + 20% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 30 मिलीग्राम/एमएल एंडोथेलियल ग्रोथ सप्लीमेंट) के 8 एमएल में फिर से निलंबित करें। एक माउस से कोशिकाओं को एक टी 25 संस्कृति फ्लास्क में बीज करें जो पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक बाँझ 0.2% जिलेटिन समाधान के 2 एमएल के साथ लेपित था और फिर अतिरिक्त समाधान को हटाने के बाद आरटी पर रात भर सूख गया था। अलगाव से एक दिन पहले फ्लास्क तैयार करें। मानक संस्कृति की स्थिति (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) में 24 घंटे के बाद, प्यूरोमाइसिन-पूरक माध्यम को हटा दें, पीबीएस के साथ एक बार संलग्न कोशिकाओं को धो लें, और एंडोथेलियल संस्कृति माध्यम के 8 एमएल में उन्हें संस्कृति दें। जिलेटिन-लेपित फ्लास्क में 80% संगम पर कोशिकाओं को 1:5 पास करें और पी 2 तक प्रयोगों में उनका उपयोग करें। टिशू कल्चर प्लास्टिक से कोशिकाओं को हटाने के लिए ट्रिप्सिन (सामग्री की तालिका) के अलावा एक सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग करें और उन्हें फ्रीज न करें। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को अलग करें।यदि कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट या एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक ही माउस से अलग नहीं किया जाता है, तो पहले चरण 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 और 1.6.3 करें। त्वचा, कण्डरा और मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के बाद, ठंड पीबीएस (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में एक बार बचे हुए हड्डियों (फीमर और टिबिया) को धो लें। हड्डियों को ताजा ठंड पीबीएस (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में रखें और अस्थि मज्जा उजागर होने तक धीरे-धीरे एपिफेसिस को काटने के लिए एक स्केलपेल (नंबर 21) का उपयोग करें। यह हड्डी के दोनों तरफ लाल बिंदु के रूप में दिखाई देता है। एक 0.4 मिमी x 25 मिमी (जी 27) इंजेक्शन सुई के साथ एक सिरिंज लैस और मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम (डीएमईएम / एफ 12 + 10% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड) के 10 एमएल के साथ भरें। एक 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब से अधिक एक के बाद एक हड्डी पकड़ो, इंजेक्शन सुई के बारे में 1 मिमी गहरी शीर्ष पर उजागर अस्थि मज्जा में डालना, और सिरिंज खाली करके अस्थि मज्जा बाहर फ्लश. फ्लश-आउट अस्थि मज्जा मध्यम में निलंबित होने पर लाल ट्यूब जैसी संरचना के रूप में दिखाई देता है। धीरे यह ऊपर और नीचे पाइप द्वारा अस्थि मज्जा भंग एक 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग बार-बार. 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में वापस 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करने के लिए 50 एमएल पिपेट से लैस बैटरी चालित पिपेट धारक का उपयोग करें और आरटी पर 5 मिन के लिए 350 x ग्राम पर इसे अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें, 10 एमएल लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर में गोली को फिर से निलंबित करें, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र करें। मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम (डीएमईएम / एफ 12 + 10% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड) के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और इसे 100 मिमी व्यास (5-8 x 106 कोशिकाओं प्रति डिश) के साथ अनुपचारित पेट्री डिश में बीज दें। 4 घंटे के बाद, 20 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एम-सीएसएफ (1:1 मिश्रण) के बिना सेल कल्चर माध्यम में 40 एनजी/एमएल मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के साथ पूरक मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें। 6 दिनों के बाद, प्रयोगों में कोशिकाओं का उपयोग करें या आगे उपयोग तक उन्हें फ्रीज. टिशू कल्चर प्लास्टिक से कोशिकाओं को हटाने के लिए ट्रिप्सिन (सामग्री की तालिका) के अलावा एक सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग करें।नोट: एक बार अलग, कोशिकाओं का विस्तार नहीं रह गया है. सेल अलगाव विधियों यहाँ भी संकेत दिया आयु सीमा के बाहर चूहों और चूहों के साथ काम करते हैं. प्रवाह साइटोमेट्री के साथ पृथक सेल आबादी के फेनोटाइप को सत्यापित करने के लिए, चरण 6.3.4 के साथ जारी रखें। 2. विस्टार या स्प्रैग-डॉली चूहों से कोलेजन अलगाव 86 कहीं और विस्तार से वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल का पालन करें। यह चूहों के साथ भी काम करता है, यद्यपि बहुत कम उपज के साथ। हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन परख के साथ परिणामी समाधान की एकाग्रता का निर्धारण करें, एसडीएस-पेज के साथ शुद्धता का आकलन करें, और प्रयोगों में उपयोग होने तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 3. संस्कृति प्रणाली घटकों का उत्पादन 3D-प्रिंट क्लैंप धारकों, बढ़ते स्टेशन, और चैम्बर नए नए साँचे।संलग्न .stl लोड करें file (पूरक File 1) क्लैंप धारकों के लिए, बढ़ते स्टेशन, और चैम्बर मोल्ड्स स्लाइसिंग सॉफ़्टवेयर में। ऑब्जेक्ट संख्याओं को आवश्यकतानुसार अनुकूलित करने के लिए, ऑब्जेक्ट्स का चयन करने के लिए बिंदु और क्लिक का उपयोग करें और उन्हें गुणा करने के लिए कॉपी-एंड-पेस्ट करें। जी-कोड जनरेट करने के लिए एक्सपोर्ट जी-कोड (Ctrl-R) दबाएं और फिर उसे एक्सपोर्ट करें (Ctrl-G). जी-कोड को 3डी प्रिंटर में लोड करें। मुद्रण प्रक्रिया (यानी, पॉलीलैक्टिक एसिड) के लिए बिना रंग, जैव-संगत फिलामेंट्स का उपयोग करें। क्लैंप धारक के छेद में 3 मिमी धागे काटें जो थ्रेड कटर (पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल 3, छेद 1 और 3) का उपयोग करके शिकंजा ले जाएगा। क्लैंप धारक के पीछे छेद में स्टेनलेस स्टील डॉवेल पिन डालें (पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल 3, छेद 4)। उपयोग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए क्लैंप धारकों और यूवी प्रकाश के साथ बढ़ते स्टेशन को स्टरलाइज़ करें। 3D-प्रिंटेड क्लू का पुन: उपयोग न करेंamp होल्डरहरू। वैकल्पिक रूप से, संलग्न योजनाओं (पूरक फ़ाइल 2, पूरक फ़ाइल 3, और पूरक फ़ाइल 4) का उपयोग करके पॉलीथेरिमाइड के साथ क्लैंप धारकों और बढ़ते स्टेशन का उत्पादन करें, जो अधिक महंगा है लेकिन बेहतर नसबंदी विधियों (यानी, ऑटोक्लेविंग) और बार-बार उपयोग को सक्षम बनाता है। 3 डी-मुद्रित नए नए साँचे का उपयोग करके कक्षों को कास्ट करें।सिलिकॉन के साथ कक्ष नए नए साँचे भरें। 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम कक्ष (90 एमबार) में सिलिकॉन को डेगास करें। समाधान आरटी पर रात भर या 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर पोलीमराइज़ करें, जो मोल्ड्स के लिए उपयोग किए जाने वाले फिलामेंट्स के गर्मी प्रतिरोध पर निर्भर करता है। ध्यान से नए नए साँचे से बहुलक कक्षों को हटा दें और एक स्केलपेल (नंबर 21) के साथ अनावश्यक सिलिकॉन काट लें। वैकल्पिक: यदि असेंब्लॉइड और, इस प्रकार, आसपास के कक्षों को यंत्रवत् लोड किया जाना है, तो स्टेनलेस स्टील से बने खोखले ट्यूबों के साथ सिलिकॉन कक्षों में छेद को मजबूत करें। संलग्न योजना (पूरक फ़ाइल 5) का उपयोग करके स्टेनलेस स्टील से धातु क्लैंप को मशीन करें। प्रत्येक उपयोग से पहले, स्टेनलेस स्टील क्लैंप को धो लेंamps, पॉलीथेरिमाइड क्लैंप धारक, शिकंजा, और सिलिकॉन कक्ष।80% इथेनॉल (EtOH) और 20% रिवर्स ऑस्मोसिस पानी (ROW) में 10 मिन के लिए सोनिकेट। 50% EtOH और 50% Isopropanol में 10 मिनट के लिए Sonicate. पंक्ति के साथ 3x कुल्ला। 0.5% क्षारीय सफाई ध्यान केंद्रित में 10 मिनट के लिए सोनिकेट (यानी, पंक्ति के 600 एमएल में 3 एमएल)। 0.5% क्षारीय सफाई ध्यान केंद्रित में 10 मिनट के लिए सोनिकेट। 1 घंटे 50 मिनट के लिए मिलाते हुए 0.5% क्षारीय सफाई ध्यान केंद्रित में छोड़ दें। पंक्ति के साथ 3x कुल्ला। पंक्ति में 10 मिनट के लिए Sonicate. घटकों को एयरड्राई करें और उन्हें आटोक्लेव करें। 4. कोर एक्सप्लांट्स को क्लैंप करना मिलान करने वाले क्लैंप धारकों को एक धातु क्लैंप के साथ बढ़ते स्टेशन में प्रत्येक को रखें। धातु क्लैंप के शीर्ष पर गीले आटोक्लेव्ड पेपर के टुकड़े (4 मिमी x 25 मिमी) रखें और फिर स्केलपेल (नंबर 21) के साथ क्लैंप की आंतरिक सीमाओं के साथ कागज को काट लें। दूसरे कागज़ के टुकड़े से 2 अतिरिक्त, छोटे कागज़ के टुकड़े (4 मिमी x 1.5 मिमी) काटकर उन्हें गीला रखें। नुकीले चिमटी का उपयोग करके, धातु क्लैंप पर उनके समापन बिंदुओं के साथ धातु क्लैंप के बीच कागज पर 8 कोर एक्सप्लांट रखें। कोर एक्सप्लांट्स के समापन बिंदुओं को पढ़े हुए छोटे कागज के टुकड़ों (4 मिमी x 1.5 मिमी) के साथ कवर करें और फिर उनके ऊपर धातु के क्लैंप डालें। मेटल क्लamps और क्लैंप होल्डर के बीच कोर एक्सप्लांट को ठीक करने के लिए एक पेचकश और छोटे स्क्रू (M3 x 6 मिमी) का उपयोग करें। सिलिकॉन संस्कृति कक्षों में क्लैंप किए गए कोर एक्सप्लांट्स को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और इन कक्षों को मानक सेल कल्चर माध्यम (डीएमईएम/एफ12 + 10% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड) के 2 एमएल से भरें। वैकल्पिक: यदि असेंब्लॉइड/आसपास के कक्षों को यंत्रवत् लोड किया जाना है, तो उन्हें छेद 3 (पूरक फ़ाइल 3 और पूरक फ़ाइल 3, छेद 3) में अतिरिक्त स्क्रू (M3 x 16 मिमी) के साथ ठीक करें। 5. कोलेजन हाइड्रोजेल तैयारी और कास्टिंग सेल टुकड़ी समाधान के साथ टिशू कल्चर प्लास्टिक से लक्ष्य कोशिकाओं को निकालें, आरटी पर 5 मिन के लिए उन्हें 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें, और उन्हें मानक संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। एक संयोजन के लिए, 10 माइक्रोन पीबीएस (20x), 1 एम NaOH (125x) के 1.28 माइक्रोन, डबल आसुत जल के 8.72 माइक्रोन (डीडीएच2हे, 23x), कोलेजन -1 के 80 माइक्रोन (2.5x या 1.6 मिलीग्राम / एमएल अंतिम), और मानक संस्कृति मीडिया के 100 माइक्रोन (2x) (कोर // सेल-फ्री असेंबलॉइड के लिए) या सेल निलंबन की आवश्यकता होती है। इन घटकों को दो अलग-अलग समाधानों में तैयार करें और कास्टिंग से तुरंत पहले ही उन्हें मिलाएं।क्रॉसलिंकिंग समाधान: पीबीएस, NaOH, ddH20, और 12 असेंब्लोइड (+10% सुरक्षा मार्जिन) तक के सेल निलंबन को क्रॉसलिंकिंग समाधान में पूल करें और इसे बर्फ पर 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में रखें। दो समाधानों के मिश्रण के बाद निम्नलिखित अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन की एकाग्रता को समायोजित करें: 250,000 कोशिकाएं/एमएल कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट्स, 500,000 कोशिकाएं/एमएल मांसपेशी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाएं, या 370,000 कोशिकाएं/एमएल अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज। कोलेजन -1 समाधान: एक और 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 12 असेंबल (+ 10% सुरक्षा मार्जिन) के लिए आवश्यक कोलेजन -1 समाधान को पूल करें और इसे बर्फ पर रखें। एक बार क्रॉसलिंकिंग समाधान और कोलेजन -1 समाधान बर्फ पर तैयार हो जाने के बाद, क्लैंप किए गए कोर एक्सप्लांट्स वाले संस्कृति कक्षों से सेल संस्कृति माध्यम को महाप्राण करें। एक 1000 माइक्रोन विंदुक के साथ crosslinking समाधान के लिए कोलेजन 1 समाधान जोड़ें और बुलबुले बनाने के बिना जल्दी से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा दो समाधान मिश्रण. मिश्रित समाधान के 200 माइक्रोन के साथ व्यक्तिगत कण्डरा कोर एक्सप्लांट्स को सिलिकॉन कक्षों द्वारा प्रदान किए गए ग्रोव में पाइप करके कवर करें। हाइड्रोगेल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए पोलीमराइज़ करने दें। ध्यान से कक्षों के कोनों में यह pipetting द्वारा संबंधित सह संस्कृति माध्यम के 1.5 एमएल के साथ सिलिकॉन संस्कृति कक्षों भरें.कोर // फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृति के लिए, डीएमईएम / एफ 12, 10% एफबीएस, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% एम्फोटेरिसिन, 200 माइक्रोन एल-एस्कॉर्बिक एसिड, 20 एनजी / एमएल मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक कारक भरें। कोर // मैक्रोफेज सह-संस्कृति के लिए, डीएमईएम / एफ 12, 10% एफबीएस, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% एम्फोटेरिसिन, 200 माइक्रोन एल-एस्कॉर्बिक एसिड, 20 एनजी / एमएल मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक कारक भरें। कोर // एंडोथेलियल सेल सह-संस्कृति के लिए, डीएमईएम/एफ12 और एंडोपैन 3 किट + 10 यू/एमएल हेपरिन + 20% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन + 1% एम्फोटेरिसिन + 30 मिलीग्राम/एमएल एंडोथेलियल ग्रोथ सप्लीमेंट का 1:1 मिश्रण भरें। संस्कृति परिकल्पना के लिए उपयुक्त संस्कृति स्थितियों में संयोजन। एक घाव की तरह आला वातावरण की नकल करने के लिए, उदाहरण के लिए, उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 20% ओ2 पर संस्कृति. 1 सप्ताह में दो बार संस्कृति माध्यम बदलें। संक्रमण को रोकने के लिए, कक्षों को इनक्यूबेटर में डालने से पहले एक बड़े पेट्री डिश या एक बाँझ बॉक्स में रखें।नोट: संस्कृति का समय परिकल्पना और सह-संस्कृति सेटअप पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, घाव जैसे आला वातावरण में कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंबल लगभग 3 सप्ताह के बाद यांत्रिक रूप से अस्थिर हो जाते हैं। 6. उपलब्ध रीडआउट विधियां व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान परख सहित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करें।सामान्य तौर पर, असेंबलियों को पूर्ण माउंट के रूप में चित्रित किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, उन्हें क्लैंप के करीब कैंची के साथ काटने और उन्हें एक 12 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित करके clamps से assemblooids को हटा दें. पीबीएस के साथ एक बार संयोजन धो लें. यदि व्यवहार्यता विश्लेषण किया जाता है, तो अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए पीबीएस (ईटीएचडी -1) में 4 x 10−6 एम एथिडियम होमोडीमर के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक संयोजन को दाग दें। पीबीएस के साथ संयोजन 3x धो लें, तो आरटी पर 20 मिनट के लिए प्रत्येक 4% formaldehyde के 500 माइक्रोन के साथ उन्हें fixate.सावधानी: 4% फॉर्मलाडेहाइड में एलर्जीनिक, कार्सिनोजेनिक और म्यूटाजेनिक प्रभाव होते हैं, प्रजनन के लिए विषाक्त होता है, और विकास संबंधी विषाक्तता (रेप्रोटॉक्सिक) या अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है। सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने, आंखों की सुरक्षा, और मास्क या अन्य श्वास सुरक्षा पहनें। पीबीएस के साथ संयोजन 3x धो लें और पसंद के धुंधला प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें। धुंधला का एक चयन पहले84,85 वर्णित किया गया है.नोट: कोलेजन ऑटोफ्लोरेसेंस (लगभग 480 एनएम) के करीब उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ फ्लोरोफोर्स का उपयोग करने वाले धुंधला होने से बचें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, आरटी-क्यूपीसीआर या जीनोम-वाइड आरएनए अनुक्रमण के लिए डिब्बे-विशिष्ट आरएनए अलगाव करें।कैंची के साथ clamps से assemblooids निकालें. वैकल्पिक: बाहरी हाइड्रोजेल डिब्बे से कोर एक्सप्लांट्स को अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। पूल 20-24 20 मिमी कोर एक्सप्लांट्स या 2 सेल से लदी कोलेजन हाइड्रोगेल आरएनए की पर्याप्त मात्रा को अलग करने के लिए। पूल किए गए कोर एक्सप्लांट्स या पूल किए गए कोलेजन हाइड्रोगेल के बाह्य मैट्रिक्स को नष्ट करने के लिए ठंडे ट्राइज़ोल और यांत्रिक व्यवधान (यानी, धातु मोती या क्रायोजेनिक पीस) के 1 एमएल का उपयोग करें।चेतावनी: मौखिक, त्वचीय, और साँस लेना विषाक्तता. त्वचा और आंखों में जलन का कारण बनता है। केवल दस्ताने के साथ और एक रासायनिक सुरक्षा कैबिनेट में संभालें। मानक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर सेल lysate से शाही सेना अलगाव के साथ जारी रखें के रूप में पहले वर्णित या निर्माता के निर्देशों84,85 में वर्णित के रूप में. कम्पार्टमेंट-विशिष्ट प्रवाह साइटोमेट्री।कैंची के साथ clamps से assemblooids निकालें. वैकल्पिक: बाहरी हाइड्रोजेल डिब्बे से कोर एक्सप्लांट्स को अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। निरंतर आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए कोलेजनेज I (3 मिलीग्राम/एमएल) और डिस्पेस II (4 मिलीग्राम/एमएल) के साथ पीबीएस के 1 एमएल में डाइजेस्ट डिब्बे। आरटी पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर पचा समाधान अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण aspirate. एफएसीएस बफर (पीबीएस में 1% एफबीएस) के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें पसंद के फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी शामिल हैं। काम फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी का चयन पहले84,85 वर्णित किया गया है। आरटी पर 30 मिनट के लिए धुंधला समाधान सेते हैं. एफएसीएस बफर के 1.4 एमएल के साथ धुंधला समाधान पतला और आरटी पर 500 x ग्राम पर 5 मिन के लिए इसे अपकेंद्रित्र करें। एफएसीएस बफर के 350 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पसंद के प्रवाह साइटोमीटर के साथ विश्लेषण करने से पहले 100 माइक्रोन नायलॉन जाल छलनी टोपी के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण करें।सतह पर तैरनेवाला संग्रह से 3 दिन पहले सीरम मुक्त सह संस्कृति माध्यम के साथ सह संस्कृति माध्यम बदलें. एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) और मेसो स्केल खोज (एमएसडी) परख किट के साथ समृद्ध, undiluted सतह पर तैरनेवाला के तत्काल और देरी से विश्लेषण प्रदर्शन. देरी विश्लेषण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला की दुकान। संयोजन यांत्रिक गुणों का आकलन करें।यांत्रिक बलों को लागू करने और यांत्रिक गुणों को मापने के लिए एक कस्टम-निर्मित स्ट्रेचिंग डिवाइस का उपयोग करें22. स्टेनलेस स्टील डॉवेल पिन और स्टेनलेस स्टील के शिकंजा क्लैंप को अन्य स्ट्रेचिंग उपकरणों से भी जोड़ते हैं। चूंकि असेंबल के यांत्रिक गुण काफी हद तक एम्बेडेड कोर एक्सप्लांट 18 द्वारा निर्धारित किए जाते हैं, माप प्रक्रिया में हौसले से डाले गए हाइड्रोजेल को नष्ट करने के जोखिम को कम करने के लिए हाइड्रोजेल में एम्बेड करने से पहले कोर एक्सप्लांट के यांत्रिक गुणों को मापें।

Representative Results

घटक अलगाव (चित्र 1 और चित्र 2)असेंबल सह-संस्कृति में कोर एक्सप्लांट्स और सेल आबादी का उपयोग करने से पहले, इन घटकों को माइक्रोस्कोप(चित्रा 1)के तहत जांचा जाना है। कोर एक्सप्लांट्स में एक समान व्यास (100-200 माइक्रोन) होना चाहिए और कोई दृश्य किंक या झुर्रियाँ नहीं होनी चाहिए। एंडोथेलियल कोशिकाओं को अन्य कोशिकाओं के संपर्क में एक लम्बी आकृति पेश करनी चाहिए, जो वे अलगाव से कम प्रारंभिक उपज के कारण बहुत कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त नहीं करते हैं। इस मामले में, एंडोथेलियल कोशिकाएं साइटोस्केलेटल एक्सटेंशन के साथ अधिक गोल आकार ग्रहण करती हैं और स्पष्ट रूप से धीमी गति से फैलती हैं। 7-10 दिनों के बाद उन्हें 1:5 विभाजित करें। अकिलीज़ टेंडन से अलग किए गए टेंडन फाइब्रोब्लास्ट 1-2 मार्ग (10-14 दिन प्रत्येक) के भीतर अपने मानव समकक्षों की तुलना में अधिक गोल आकृति विज्ञान मानते हैं जब वे 1: 6 विभाजित थे। मैक्रोफेज फाइब्रोब्लास्ट या एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में बहुत छोटे होते हैं और अलगाव के बाद प्रसार नहीं करते हैं। बैच के आधार पर, उनका आकार पिरामिड से गोल तक भिन्न हो सकता है। सेलुलर घटकों के फेनोटाइप को प्रवाह साइटोमेट्री के साथ सत्यापित किया गया था। एक संयुग्मित सीडी 31 एंटीबॉडी का उपयोग एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 2ए)के लिए एक मार्कर के रूप में किया गया था। एक बेदाग नियंत्रण नमूना (ग्रे) के आधार पर प्रतिदीप्ति सीमा की स्थापना, मार्ग 1 (पी 1) के 90.1% और मार्ग 2 (पी 2) एंडोथेलियल कोशिकाओं के 48.7% सीडी 31 पॉजिटिव के रूप में पहचाने गए थे। एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइन एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ScxGFP) और एक संयुग्मित CD146 एंटीबॉडी के साथ कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट मार्कर स्क्लेरैक्सिस सह व्यक्त कण्डरा fibroblasts(चित्रा 2B)35,60को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक मार्ग (P1) के बाद, 37.3% फाइब्रोब्लास्ट ScxGFP + CD146- थे, 0.2% ScxGFP + CD146+ थे, 4.3% ScxGFP-CD146+ थे, और 58% ScxGFP-CD146- थे। दो मार्ग (P2) के बाद, ScxGFP+CD146- कोशिकाओं का प्रतिशत घटकर 27.6% हो गया, ScxGFP+CD146+ कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़कर 6.9% हो गया, ScxGFP-CD146+ कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़कर 10.6% हो गया, और ScxGFP-CD146- कोशिकाओं का प्रतिशत घटकर 54.9% हो गया। मैक्रोफेज की पहचान और विशेषता के लिए, एक एफ 4/80 एंटीबॉडी का उपयोग सीडी 86 और सीडी 206 एंटीबॉडी (चित्रा 2सी) के संयोजन में किया गया था। अलगाव और संस्कृति के बाद, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं का 96.4% एफ 4/80-पॉजिटिव था। इन F4/80-पॉजिटिव कोशिकाओं में, 8.6% CD206+CD86- थे, 23.6% CD206+CD86+ थे, 28.3% CD206-CD86+ थे, और 39.4% CD206-CD86- थे। कोलेजन क्रॉसलिंकिंग गति बैच से बैच में भिन्न हो सकती है और प्रयोग शुरू करने से पहले परीक्षण किया जाना है। संयोजन उपस्थिति (चित्र 3)घाव जैसी संस्कृति की स्थिति (36 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) में, कोर एक्सप्लांट यंत्रवत् रूप से खिंचाव योग्य रहा, उपस्थिति में नहीं बदला, और कम से कम 21 दिनों (चित्रा 3 ए, बी) में आसपास के हाइड्रोजेल से नेत्रहीन रूप से अलग और शारीरिक रूप से अलग होना जारी रखा। आसपास के हाइड्रोजेल को समय के साथ संकुचित किया गया था, जिसमें सेल आबादी के आधार पर संघनन गति थी। अकिलीज़ कण्डरा-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स ने अपने आसपास के हाइड्रोजेल को सबसे तेजी से अनुबंधित किया और ऐसा रेडियल रूप से किया जब एक हाइड्रोजेल में एक कोर एक्सप्लांट के चारों ओर और सभी दिशाओं में नहीं (चित्रा 3बी, सी)। प्रारंभ में, सेल-मुक्त हाइड्रोगेल को एक कोर एक्सप्लांट के चारों ओर कॉम्पैक्ट किया जाता है, साथ ही साथ। यह संकुचन संभवतः कोर एक्सप्लांट से कोशिकाओं को माइग्रेट करने के कारण हुआ था, जो एक गतिशील क्रॉस-कम्पार्टमेंटल इंटरफ़ेस का संकेत देता है। चूंकि एक एम्बेडेड कोर एक्सप्लांट के बिना सेल-फ्री हाइड्रोगेल ने पता लगाने में कॉम्पैक्ट नहीं किया, पानी के नुकसान से प्रेरित संकोचन का योगदान नगण्य प्रतीत होता है (चित्र 3बी और पूरक फ़ाइल 6)। हाइड्रोजेल संघनन की कमी, इसलिए, संयोजन विधानसभा (यानी, कम सेल सांद्रता) में गलतियों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अधिक महंगी readout तरीकों के साथ जारी रखने से पहले जाँच की जानी चाहिए. इस पद्धति को स्थापित करते समय, सेल एकाग्रता को कम करने वाली सामान्य गलतियों में बाहरी हाइड्रोजेल में मरने वाली कोशिकाएं शामिल थीं क्योंकि उन्हें अपेक्षाकृत कठोर क्रॉसलिंकिंग समाधान (उच्च पीएच, कम तापमान) में बहुत लंबे समय तक छोड़ दिया गया था और कोर एक्सप्लांट्स को सुखाने के लिए क्योंकि मध्यम आकांक्षा और हाइड्रोजेल इंजेक्शन के बीच का समय बहुत लंबा था, या क्योंकि कोर एक्सप्लांट कोलेजन में एम्बेडेड होने के लिए बहुत अधिक क्लैंप किया गया था। कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान विश्लेषण (चित्रा 3)एक बार कैंची (चित्रा 3 बी) के साथ क्लैंप से हटा दिया जाता है, असेंब्लोइड को सेक्शनिंग के बिना एक पूरे के रूप में एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ तय, दाग और इमेज किया जा सकता है। यहां, कोर // एंडोथेलियल सेल, कोर // मैक्रोफेज, और कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंबलॉइड को व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए डीएपीआई (न्यूकब्लू) और एथिडियम होमोडीमर (ईटीएचडी -1) के साथ दाग दिया गया था और 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल(चित्रा 3डी)में आकृति विज्ञान और सेल प्रसार का विश्लेषण करने के लिए डीएपीआई और एफ-एक्टिन। कोर // एंडोथेलियल सेल असेंबलॉइड (चित्रा 3ई) की व्यवहार्यता मात्रा निर्धारित की गई थी और कोर // मैक्रोफेज और कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंबलॉइड84 के लिए पहले की तुलना में संयोजन विधानसभा के बाद आम तौर पर कम पाया गया था। हालांकि, व्यवहार्यता कम से कम दिन 7 तक संयोजन संस्कृति के दौरान स्थिर रही। यंत्रवत् प्रेरित माइक्रोडैमेज और यांत्रिक गुणों का माप(चित्र 4)क्लैंप धारकों से जुड़े शिकंजा और पिन क्लैंप किए गए असेंबलियों को एकअक्षीय स्ट्रेचिंग उपकरणों के निर्धारण की अनुमति देते हैं। यहां उपयोग किए जाने वाले कस्टम-निर्मित स्ट्रेचिंग डिवाइस 10 एन लोड सेल से लैस है और पिछले प्रकाशनों (चित्रा 4ए)22में वर्णित किया गया है। सभी नमूने माप से पहले 1% तनाव के लिए पांच खिंचाव चक्रों के साथ पूर्व वातानुकूलित थे। कोर एक्सप्लांट्स या असेंब्लोइड्स(चित्रा 4बी)के पूर्ण तनाव-तनाव वक्र को रिकॉर्ड करने से रैखिक लोचदार मापांक (α), अधिकतम तनाव (β), और अधिकतम तनाव (у) की मात्रा का ठहराव होगा। हालांकि, यह अपरिवर्तनीय रूप से कोर एक्सप्लांट या असेंब्लोइड को नुकसान पहुंचाता है, जिससे अधिकतम तनाव (β) और अधिकतम तनाव (у) के अनुदैर्ध्य विकास का आकलन करना असंभव हो जाता है। यहां, रैखिक लोचदार मापांक का उपयोग नमूने की बलों का सामना करने की क्षमता के लिए एक उपाय के रूप में किया गया था, क्योंकि इस माप के लिए नमूना को केवल 2% तनाव तक खींचने की आवश्यकता होती है, जिसे पहले रैखिक लोचदार मापांक18 में स्थायी कटौती का कारण नहीं दिखाया गया है। विशेष रूप से, कोर // एंडोथेलियल सेल असेंबलॉइड को 2% तनाव (रैखिक लोचदार क्षेत्र के लगभग अंत) या 6% तनाव (लगभग अधिकतम तनाव) के लिए क्लैंपिंग प्रक्रिया से अवगत कराया गया था। परिणामी माइक्रोडैमेज का मूल्यांकन प्रक्रिया से पहले और बाद में रैखिक लोचदार मापांक को मापकर किया गया था (चित्र 4C)। मोनो-सुसंस्कृत कोर एक्सप्लांट्स का शोषण करने वाले पहले किए गए प्रयोगों के अनुरूप, कोर // एंडोथेलियल सेल असेंब्लॉइड ने कम से कम 14 दिनों के लिए अपने रैखिक लोचदार मापांक को बनाए रखा जब अर्ध-होमोस्टेटिक आला स्थितियों (29 डिग्री सेल्सियस, 3% ओ2) में सुसंस्कृत किया गया और 2,21से अधिक उपभेदों के संपर्क में नहीं आया। यांत्रिक आधारभूत उत्तेजना के बारे में, क्लैंप के माध्यम से लागू स्थिर खिंचाव आम तौर पर मैट्रिक्स उतराई87 के साथ जुड़े catabolic प्रक्रियाओं को रोकने के लिए विवो में कण्डरा कोर इकाइयों द्वारा अनुभव देशी तनाव के स्तर की पर्याप्त नकल करने के लिए लग रहा था. दरअसल, 6% तनाव के संपर्क में कोर // एंडोथेलियल सेल असेंब्लॉइड में देखे गए रैखिक लोचदार मापांक की प्रगतिशील और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण गिरावट को यांत्रिक रूप से प्रेरित मैट्रिक्स माइक्रोडैमेज से उपजी मैट्रिक्स अनलोडिंग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इन प्रयोगों को करते समय, संयोजन के सूखने को रोकना महत्वपूर्ण है। यहां, उन्हें आटोक्लेव और गीले कागज में संलग्न किया गया था, लेकिन उपयोग किए गए स्ट्रेचिंग डिवाइस के साथ उनकी संगतता के आधार पर अन्य तरीके भी व्यवहार्य हो सकते हैं। चूंकि धातु के क्लैंप और कोर एक्सप्लांट के बीच घर्षण सीमित है, इसलिए फिसलन को रोकने के लिए क्लैंपिंग के दौरान धातु और कोर एक्सप्लांट के बीच कागज के छोटे टुकड़े जोड़ें और फिसल गए कोर एक्सप्लांट और असेंबलॉइड का पता लगाने और बाहर करने के लिए स्ट्रेचिंग प्रक्रिया की बारीकी से निगरानी करें। कम्पार्टमेंट-विशिष्ट प्रतिलेख और संयोजन-विशिष्ट सेक्रेटोम विश्लेषण (चित्रा 5 और चित्रा 6)यहां प्रस्तुत कोर मोनो-संस्कृति प्रयोगों के पहले सेट में, एक्सप्लांट अलगाव के बाद कोर जीन अभिव्यक्ति की स्थिरता का मूल्यांकन प्रयोगात्मक प्रभाव(चित्रा 5ए)से अलगाव को कम करने के लिए किया गया था। हालांकि सटीक निष्कर्ष के लिए उच्च प्रतिकृति संख्या आवश्यक है, वेगफा और एमएमपी की अभिव्यक्ति घाव जैसी आला स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) में सुसंस्कृत होने पर एक्सप्लांट अलगाव के बाद घंटों के भीतर ताजा पृथक कोर एक्सप्लांट्स में दृढ़ता से वृद्धि हुई। नवसंवहनीकरण कण्डरा रोग और मरम्मत का एक केंद्रीय हॉलमार्क है, जो भाग में, हाइपोक्सिया88 के तहत कण्डरा कोर द्वारा स्रावित प्रो-एंजियोजेनिक कारकों (यानी, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर, वेगफा) द्वारा सक्रिय एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा संचालित किया जा सकता है। इस संभावित क्रॉसस्टॉक(चित्रा 5बी)के पहले चरण की जांच करते हुए, वेगफा और हाइपोक्सिया मार्कर कार्बोनिक एनहाइड्रेज़ 9 (सीए9) दोनों की अभिव्यक्ति को कम ऑक्सीजन तनाव (3% ओ2) के तहत मोनो-सुसंस्कृत एक्सप्लांट में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण पाया गया, जो उच्च ऑक्सीजन तनाव (20% ओ2) के तहत मोनो-सुसंस्कृत के विपरीत थे). इस बीच, कम ऑक्सीजन तनाव ने स्क्लेरैक्सिस (एससीएक्स) और कोलेजन -1 (सीओएल 1 ए 1) जैसे कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट मार्करों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का कारण नहीं बना। साथ में, ये परिणाम एक हाइपोक्सिक आला में प्रो-एंजियोजेनिक सिग्नलिंग के लिए प्रशंसनीय योगदानकर्ताओं के रूप में कोर-निवासी कोशिकाओं की पहचान करते हैं। इसके बाद, प्रो-एंजियोजेनिक कोर सिग्नलिंग द्वारा एंडोथेलियल कोशिकाओं की सक्रियता का मूल्यांकन कोर // एंडोथेलियल सेल असेंब्लोइड सह-संस्कृति में उच्च (20% ओ2) और निम्न (3% ओ2) ऑक्सीजन तनाव के तहत किया गया था। सौभाग्य से, असेंब्लोइड की मॉड्यूलर संरचना बाहरी कोलेजन हाइड्रोगेल(चित्रा 6ए)से कोर एक्सप्लांट को शारीरिक रूप से अलग करके संस्कृति के बाद डिब्बे-विशिष्ट प्रतिलेख विश्लेषण की अनुमति देती है। कोर एक्सप्लांट (चित्रा 6 डी) में, वेगफा अभिव्यक्ति को फिर से कम ऑक्सीजन तनाव के तहत बढ़ने की पुष्टि की गई थी, हालांकि एफजीएफ 2 जैसे अन्य हाइपोक्सिक मार्करों पर प्रभाव कम स्पष्ट था और सटीक निष्कर्ष के लिए उच्च प्रतिकृति संख्या की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, टीएनएफ-α जैसे प्रो-भड़काऊ मार्करों की अभिव्यक्ति और एमएमपी 3 जैसे बाह्य मैट्रिक्स गिरावट के लिए मार्करों को कम ऑक्सीजन तनाव के तहत कोर में कम किया गया था। शुरू में एंडोथेलियल कोशिकाओं(चित्रा 6ईई)के साथ वरीयता प्राप्त बाहरी हाइड्रोजेल में, एक जीवित कोर एक्सप्लांट (एसी) की उपस्थिति ने कम ऑक्सीजन तनाव के तहत वेगफा अभिव्यक्ति को कम कर दिया, लेकिन उच्च ऑक्सीजन तनाव के तहत नहीं। इसके अलावा, कम ऑक्सीजन तनाव के तहत एक विघटित (डीसी) कोर एक्सप्लांट की उपस्थिति ने वेगफा अभिव्यक्ति को कम नहीं किया। कम ऑक्सीजन तनाव के तहत, बाहरी हाइड्रोजेल में टीएनएफ -α अभिव्यक्ति एसी / डीसी के आसपास तुलनीय थी, लेकिन जीवित कोर एक्सप्लांट के आसपास उच्च ऑक्सीजन तनाव के तहत वृद्धि हुई। उच्च ऑक्सीजन तनाव के तहत एक विघटित कोर एक्सप्लांट के आसपास सुसंस्कृत बाहरी एंडोथेलियल सेल-लेटे हुए हाइड्रोजेल की तुलना में सभी स्थितियों में एफजीएफ 2 अभिव्यक्ति कम हो गई थी, लेकिन अधिकांश कम ऑक्सीजन तनाव के तहत। Mmp3 अभिव्यक्ति उच्च ऑक्सीजन तनाव के तहत जीवित कोर एक्सप्लांट्स के आसपास सबसे अधिक थी और कम ऑक्सीजन तनाव के तहत विघटित कोर एक्सप्लांट्स के आसपास सबसे कम थी। कुल मिलाकर, सह-सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाएं सक्रिय कोर एक्सप्लांट दोनों के लिए उत्तरदायी लगती हैं, जो ऑक्सीजन के स्तर में क्रॉसस्टॉक और भिन्नता शुरू करने में सक्षम है। एक अधिक व्यापक प्रतिलेख विश्लेषण उनके संबंधित योगदानों के स्पष्टीकरण की सुविधा प्रदान करेगा। असेंबल सिस्टम की मॉड्यूलरिटी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन युक्त आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के एकीकरण की अनुमति देती है। यहां, पीडीजीएफबी-आईक्रेयर एमजी चूहों89 से अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं को हाइड्रोजेल डिब्बे में वरीयता दी गई थी। ये कोशिकाएं एंडोथेलियल सेल मार्कर प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक सबयूनिट बी (पीडीजीएफबी) को बढ़ाया हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के साथ सह-व्यक्त करती हैं, जो पीडीजीएफबी-व्यक्त एंडोथेलियल कोशिकाओं को माइक्रोस्कोपी(चित्रा 6सी)के तहत हरा दिखाई देती है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, पीडीजीएफबी-व्यक्त एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति को संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस) में 7 दिनों से अधिक बनाए रखने की पुष्टि की गई थी और ऑक्सीजन तनाव (3% ओ2 की तुलना में 20% ओ2) से स्वतंत्र प्रतीत होता था। असेंब्लोइड्स के स्रावी का विश्लेषण करने के लिए, कोर // सेल-फ्री और कोर // फाइब्रोब्लास्ट, कोर // मैक्रोफेज, या कोर // एंडोथेलियल सेल सह-संस्कृति के लिए क्रमशः उपयोग किए जाने वाले संस्कृति माध्यम को अपने सीरम मुक्त समकक्ष के साथ बदल दिया गया था, जो अब स्रावी (चित्रा 6ए)से समृद्ध सुपरनेटेंट को एस्पिरेटिंग और फ्रीजिंग से तीन दिन पहले बदल दिया गया था। यह संवर्धन समय एमएसडी परख के साथ संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) जैसे साइटोकिन्स का पता लगाने के लिए पर्याप्त था, जैसा कि कोर एक्सप्लांट्स और कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंब्लॉइड के लिए यहां दिखाया गया है, जो घाव जैसी आला स्थितियों(चित्रा 6बी)में सुसंस्कृत है। कोर एक्सप्लांट्स और असेंबलॉइड के सेक्रेटोम और ट्रांसक्रिपटोम का विश्लेषण करते समय महत्वपूर्ण विचार उचित नियंत्रण के उपयोग की चिंता करते हैं। हौसले से पृथक कोर एक्सप्लांट्स का सीमित मूल्य होता है, क्योंकि विशेष रूप से वेगफा और एमएमपीएस की उनकी अभिव्यक्ति अलगाव (चित्रा 5ए)के बाद घंटों के भीतर दृढ़ता से बढ़ जाती है। शुरू में सेल-फ्री हाइड्रोजेल से घिरे समय-मिलान वाले एक्सप्लांट कोर कम्पार्टमेंट जीन अभिव्यक्ति के लिए नियंत्रण के रूप में अधिक उपयुक्त हैं। बाहरी हाइड्रोजेल के लिए, कोर एक्सप्लांट के बिना सुसंस्कृत सेल-लेटे हुए हाइड्रोगेल विघटित कोर एक्सप्लांट्स (पूरक फ़ाइल 7) के आसपास सुसंस्कृत सेल-लेटे हुए हाइड्रोगेल की तुलना में अवर नियंत्रण हैं, मुख्यतः क्योंकि वे लम्बी हाइड्रोगेल के बजाय गोल आकार में कॉम्पैक्ट होते हैं जो सेल आकृति विज्ञान(चित्रा 3ए)को बहुत बदलते हैं। चित्रा 1: विवो क्रॉसस्टॉक में मॉडल के लिए संयोजन घटक अलगाव और विधानसभा। टेंडन कोर एक्सप्लांट को माउस पूंछ, कट और क्लैंप से निकाला गया था। माउस पैर की मांसपेशियों (यानी, क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस (क्यूएफ), गैस्ट्रोकनेमियस (जी), और टिबिअलिस पूर्वकाल (टीए)) को एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए पचाया गया था जो तब टिशू कल्चर प्लास्टिक पर सुसंस्कृत थे। अकिलीज़ टेंडन (एटी) को कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट्स को अलग करने के लिए पचाया गया था, जो तब टिशू कल्चर प्लास्टिक पर सुसंस्कृत थे। टिबिया और फीमर से अस्थि मज्जा को हड्डियों से बाहर निकाल दिया गया था। फिर, पृथक मोनोसाइट्स को टिशू कल्चर प्लास्टिक पर सुसंस्कृत किया गया और भोले मैक्रोफेज में विभेदित किया गया। प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां (10x) कोर एक्सप्लांट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट्स और मैक्रोफेज की उपस्थिति को तुरंत असेंबल में एकीकरण से पहले दर्शाती हैं। असेंबली के दौरान, प्लास्टिक पर सुसंस्कृत कोशिकाओं को निलंबन में रखा गया था और फिर कोलेजन -1 समाधान (1.6 मिलीग्राम / एमएल) में वरीयता दी गई थी। फिर, सेल-हाइड्रोजेल मिश्रण को क्लैंप किए गए कोर एक्सप्लांट के चारों ओर डाला गया था और संस्कृति माध्यम जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए पोलीमराइज़ किया गया था। संस्कृति की स्थिति क्लैंप (यांत्रिक तनाव) और इनक्यूबेटर सेटिंग्स (ऑक्सीजन एकाग्रता, तापमान) के माध्यम से नियंत्रित किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 2: सेलुलर संयोजन घटकों की विशेषता। (ए) एक मार्ग (पी 1, शीर्ष पंक्ति) और दो मार्ग (पी 2, नीचे पंक्ति) के बाद मांसपेशियों से व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। बेदाग (ग्रे) और सीडी 31-सना हुआ (हरा) कोशिकाओं के लिए मायने रखता है मोडल के लिए सामान्यीकृत किया गया. सीडी 31-सना हुआ समूह के लिए प्रतिशत दिया गया है। (बी) एक मार्ग (पी 1, शीर्ष पंक्ति) और दो मार्ग (पी 2, नीचे पंक्ति) के बाद अकिलीज़ कण्डरा-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। कुल्हाड़ियों unstained कोशिकाओं (ग्रे) और कोशिकाओं दोनों ScxGFP व्यक्त और CD146 एंटीबॉडी (इंद्रधनुष रंग) के साथ दाग की प्रतिदीप्ति तीव्रता की रिपोर्ट. (सी)संस्कृति के बाद अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। शीर्ष पंक्ति में, बेदाग (ग्रे) और एफ 4/80-सना हुआ (हरा) कोशिकाओं के लिए मायने रखता है मोडल के लिए सामान्यीकृत किया गया था। प्रतिशत F4/80-दाग वाले समूह के लिए दिए गए हैं। नीचे की पंक्ति में ग्राफ बिना दाग वाली कोशिकाओं (ग्रे) की प्रतिदीप्ति तीव्रता और सीडी 206 एंटीबॉडी और सीडी 80 एंटीबॉडी (इंद्रधनुष रंग) के साथ दाग कोशिकाओं के एफ 8/86 + सबसेट की रिपोर्ट करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 3: संयोजन इमेजिंग और उपस्थिति। (ए) संस्कृति के दिन 0 (डी0) और दिन 21 (डी 21) (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) में ली गई प्रतिनिधि तस्वीरें एक हाइड्रोजेल के बहु-आयामी संकुचन को दिखाती हैं जिसमें एक एम्बेडेड कोर एक्सप्लांट के बिना बाहरी फाइब्रोब्लास्ट होते हैं और एक कोर एक्सप्लांट के चारों ओर बाहरी फाइब्रोब्लास्ट युक्त हाइड्रोजेल का मजबूत रेडियल संघनन होता है। (बी) संस्कृति के दिन 21 (डी 21) में ली गई प्रतिनिधि तस्वीरें (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) सेल-फ्री हाइड्रोगेल, सेल-फ्री हाइड्रोगेल के बीच संघनन गति में अंतर दिखाती हैं, जो एक कोर एक्सप्लांट के चारों ओर डाली जाती हैं, और कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट-लेटे हुए हाइड्रोगेल एक कोर एक्सप्लांट के चारों ओर डाली जाती हैं। (सी)संस्कृति के दिन 0 (डी0) और दिन 21 (डी21) (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) में ली गई प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां (10x) सेल आबादी की उपस्थिति में अनुदैर्ध्य परिवर्तन और कोर एक्सप्लांट (ई) के आसपास कोलेजन हाइड्रोजेल (एचजी) की संघनन गति को इंगित करती हैं। योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व कोर // सेल-फ्री असेंब्लोइड और कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंबल सह-संस्कृति के बीच हाइड्रोजेल संघनन में अंतर को दर्शाता है। (डी)कोर // एंडोथेलियल सेल, कोर // मैक्रोफेज, और कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंब्लोइड सह-संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) के दिन 7 (डी 7) में ली गई प्रतिनिधि फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां। बाईं पंक्ति में छवियों सेल नाभिक नीले (DAPI) और मृत कोशिकाओं गुलाबी (Ethidium homodimer-1) में दाग के साथ संयोजन चित्रित. अन्य दो पंक्तियों में नीले (डीएपीआई ) में दाग वाले सेल नाभिक और हरे रंग (एफ-एक्टिन) में एक्टिन फिलामेंट्स के साथ संयोजन को दर्शाया गया है। (ई) सह-संस्कृति के दिन 1 (डी 1) और दिन 7 (डी 7) में कोर // एंडोथेलियल सेल असेंबलियों की मात्रात्मक व्यवहार्यता को दर्शाने वाले बॉक्सप्लॉट। एन = 5. ऊपरी और निचले टिका पहले और तीसरे चतुर्थक (25वें और 75वें प्रतिशत) और मध्य वाले को माध्यिका के अनुरूप होते हैं। मूंछें ऊपरी/निचले काज से सबसे बड़े/सबसे छोटे मान तक फैली हुई हैं, जो इंटरक्वार्टाइल रेंज के 1.5 गुना से अधिक नहीं हैं। पी-मान: एनएसपी > 0.05। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 4: संयोजन की यांत्रिक उत्तेजना और संयोजन यांत्रिक गुणों की माप। (ए) कस्टम-निर्मित स्ट्रेचिंग डिवाइस का चित्रमय चित्रण जिसमें क्लैंप धारक प्लेटफॉर्म, एक बल सेंसर और एक स्टेपर मोटर शामिल है। फोटोग्राफिक छवि क्लैंप के साथ स्ट्रेचिंग डिवाइस पर घुड़सवार एक संयोजन दिखाती है। पैमाने के लिए उपयोग की जाने वाली 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब (Ø: 17 मिमी) का ढक्कन। (बी) कोर एक्सप्लांट्स (हल्का नीला) और असेंब्लोइड (हल्का लाल) के लिए प्रतिनिधि तनाव / तनाव घटता का चित्रण ग्राफ। रैखिक लोचदार मापांक (α), अधिकतम तनाव (β), और अधिकतम तनाव (у) को यांत्रिक रूप से कोर एक्सप्लांट या असेंब्लोइड को चिह्नित करने के लिए डेटा से निकाला जा सकता है। एंडोथेलियल सेल असेंब्लॉइड सह-सुसंस्कृत (29 डिग्री सेल्सियस, 3% ओ2) के रैखिक लोचदार मापांक (एमोड) को क्लैंप (ठोस रेखा) होने के बाद 14-दिवसीय समय पाठ्यक्रम पर, क्लैंप किया गया और 2% एल0 तनाव (बिंदीदार रेखा) तक बढ़ाया गया, या प्रयोग की शुरुआत में 6% एल0 तनाव (धराशायी रेखा) तक बढ़ाया और बढ़ाया गया। एन = 5. डेटा बिंदुओं को स्ट्रेचिंग से पहले प्रारंभिक मापांक रैखिक लोचदार मापांक के लिए सामान्यीकृत किया गया था और सभी को माध्य (±sem) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। पी-मान: *p < 0.05, **p < 0.01. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 5: विभिन्न आला परिस्थितियों में अलगाव और संस्कृति के बाद कोर प्रतिलेख में परिवर्तन। (ए) स्कैटरप्लॉट मोनो-सुसंस्कृत (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) में वेगफा, एमएमपी 13, और एमएमपी 3 जीन अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन को दर्शाता है, उन्हें पूंछ से अलग करने के बाद 2 एच, 4 एच, 6 एच, और 8 एच। संबंधित समय बिंदुओं पर गुना परिवर्तन अलगाव के 2 घंटे बाद जीन अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किए गए थे। एन = 2. (बी) कम ऑक्सीजन तनाव (3% ओ2) के तहत मोनो-सुसंस्कृत कोर एक्सप्लांट्स में सीए 9, वेगफा, एससीएक्स और कोल 1 ए 1 जीन अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन को दर्शाने वाले बॉक्सप्लॉट सामान्यीकृत और उच्च ऑक्सीजन तनाव (20% ओ2) के तहत मोनो-सुसंस्कृत की तुलना में। एन = 5-6। बॉक्सप्लॉट के ऊपरी और निचले टिका पहले और तीसरे चतुर्थक (25वें और 75वें प्रतिशत) और मध्य वाले को माध्यिका के अनुरूप होते हैं। मूंछें ऊपरी/निचले काज से सबसे बड़े/सबसे छोटे मान तक फैली हुई हैं, जो इंटरक्वार्टाइल रेंज के 1.5 गुना से अधिक नहीं हैं। सामान्यीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटापॉइंट को काले डॉट्स और व्यक्तिगत डेटापॉइंट को लाल डॉट्स के रूप में दर्शाया गया है। पी-मान: **p < 0.01, ***p < 0.001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 6: असेंबल-विशिष्ट सेक्रेटोम और कम्पार्टमेंट-विशिष्ट प्रतिलेख विश्लेषण। (ए) प्रतिनिधि तस्वीर 7 दिन (डी 7) में संयोजन दिखा रही है, जब सेक्रेटोम और ट्रांसक्रिप्टोम नमूने लिए गए थे, और अंतर्निहित वर्कफ़्लो का चित्रण। (बी) सह-संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ2) के 7 दिनों के बाद कोर// सेल-मुक्त और कोर // फाइब्रोब्लास्ट असेंबलियों के सुपरनेटेंट में वीईजीएफ एकाग्रता (पीजी/एमएल) को बॉक्सप्लॉट के रूप में दर्शाया गया है। एन = 6. एंडोथेलियल सेल असेंबलॉइड की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां उच्च ऑक्सीजन तनाव (20% ओ2) और कम ऑक्सीजन तनाव (3% ओ2) के तहत सह-संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस) के 7 दिनों के बाद। सेल नाभिक नीले (डीएपीआई में) में दाग रहे हैं, और एम्बेडेड एंडोथेलियल कोशिकाओं सह एक्सप्रेस बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) एंडोथेलियल सेल मार्कर प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक सबयूनिट बी (पीडीजीएफबी) के साथ. बिंदीदार रेखा कोर एक्सप्लांट (ई) और एंडोथेलियल सेल-लेटे हुए हाइड्रोजेल (एचजी) के बीच कम्पार्टमेंटल इंटरफेस को इंगित करती है। (डी) कम ऑक्सीजन तनाव (3% ओ2) के तहत सह-सुसंस्कृत कोर // एंडोथेलियल सेल असेंब्लॉइड से कोर डिब्बे में वेगफा, टीएनएफ-α, एफजीएफ 2, और एमएमपी 3 जीन अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन को दर्शाते हुए स्कैटरप्लॉट सामान्यीकृत और उच्च ऑक्सीजन तनाव (20% ओ2) के तहत सुसंस्कृत लोगों की तुलना में। एन = 2. (ई) स्कैटरप्लॉट उच्च ऑक्सीजन तनाव (20% ओ2) और कम ऑक्सीजन तनाव (3% ओ2) के तहत सह-सुसंस्कृत एक जीवित कोर (एसी) या एक विघटित कोर (डीसी) के साथ कोर // एंडोथेलियल सेल असेंबलॉइड के बाहरी डिब्बे में वेगफा, टीएनएफ-α, एफजीएफ 2, और एमएमपी 3 जीन अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन का चित्रण करता है।). संबंधित स्थितियों में गुना परिवर्तन उच्च ऑक्सीजन तनाव (20% ओ2) के तहत सह-सुसंस्कृत एक विघटित कोर (डीसी) के साथ एक कोर // एंडोथेलियल सेल असेंबल के बाहरी डिब्बे में सामान्यीकृत थे। एन = 3-4। बी में, बॉक्सप्लॉट के ऊपरी और निचले टिका पहले और तीसरे चतुर्थक (25वें और 75वें प्रतिशत) और मध्य वाले के अनुरूप होते हैं। मूंछें ऊपरी/निचले काज से सबसे बड़े/सबसे छोटे मान तक फैली हुई हैं, जो इंटरक्वार्टाइल रेंज के 1.5 गुना से अधिक नहीं हैं। आउटलेयर को काले डॉट्स के रूप में दर्शाया गया है। पी-मान: *p < 0.05। डी और ई में, सामान्यीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटापॉइंट को काले डॉट्स के रूप में दर्शाया गया है, और व्यक्तिगत डेटापॉइंट को लाल डॉट्स के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. तालिका 1: कण्डरा रोग और चोट मॉडल सिस्टम के लिए इनपुट आवश्यकताएं। प्राथमिक कण्डरा रोग ट्रिगर और माध्यमिक ड्राइवरों की एक सूची इनपुट मापदंडों के चयन से मेल खाती है जिनकी ट्रैक्टेबिलिटी कण्डरा रोग और चोट मॉडलिंग के लिए केंद्रीय है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. तालिका 2: कण्डरा रोग और चोट मॉडल सिस्टम के लिए आउटपुट आवश्यकताएं। कण्डरा रोग हॉलमार्क का चयन आउटपुट मापदंडों के चयन से मेल खाता है जिसकी मात्राशीलता कण्डरा रोग और चोट मॉडल व्यवहार की व्याख्या के लिए केंद्रीय है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. अनुपूरक File 1: .stl फ़ाइल क्लैंप धारकों के लिए, बढ़ते स्टेशन, और कक्ष मोल्ड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. अनुपूरक फ़ाइल 2: सही क्लैंप धारक की योजना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. अनुपूरक फ़ाइल 3: बाएं क्लैंप धारक की योजना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. अनुपूरक फ़ाइल 4: बढ़ते मंच की योजना कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। अनुपूरक फ़ाइल 5: धातु क्लैंप की योजना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. पूरक फ़ाइल 6: सेल मुक्त हाइड्रोजेल संकोचन दिखा छवि. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. अनुपूरक फ़ाइल 7: एक विघटित कोर एक्सप्लांट दिखाने वाली छवि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत असेंबल मॉडल सिस्टम में हाइलाइट करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, मॉडल प्रणाली केवल अपने घटकों की गुणवत्ता के रूप में अच्छी है। यह विधानसभा प्रक्रिया शुरू करने से पहले खुर्दबीन के तहत कोर संयंत्र और होने के लिए बीज सेल आबादी की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. फ्लो साइटोमेट्री के साथ कम से कम एक बार पृथक सेल आबादी के फेनोटाइप को सत्यापित करना भी उतना ही महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से जब कोलेजन -1 का एक नया बैच पहली बार उपयोग किया जाता है, तो इसमें कोशिकाओं को एम्बेड करने से पहले ट्रायल रन में क्रॉसलिंकिंग गति की जांच करना फायदेमंद होता है। असेंबल असेंबली को बहुत अधिक मैनुअल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जिससे संक्रमण का खतरा बढ़ जाता है। संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, लामिना वायु प्रवाह के साथ एक बाँझ जैव सुरक्षा हुड में काम करते हैं, अक्सर दस्ताने का आदान-प्रदान करते हैं, और दस्ताने के साथ-साथ 80% इथेनॉल के साथ काम करने की जगह को भी नष्ट कर देते हैं। समान कारणों से, 3D-प्रिंटेड क्लैंप होल्डर का एक से अधिक बार उपयोग न करें। एम्बेडिंग प्रक्रिया से पहले, समय से पहले क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए बर्फ पर सभी हाइड्रोजेल घटकों (क्रॉसलिंकिंग समाधान, कोलेजन -1 समाधान) को रखना महत्वपूर्ण है। नतीजतन, क्रॉसलिंकिंग समाधान के उच्च पीएच और कम तापमान के कारण कोशिका मृत्यु को सीमित करने के लिए कोशिकाओं को क्रॉसलिंकिंग समाधान में जोड़े जाने के बाद जल्दी से काम करना चाहिए। कोर एक्सप्लांट में सुखाने से संबंधित कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए, कोलेजन -1 समाधान के साथ क्रॉसलिंकिंग समाधान मिश्रण करने से तुरंत पहले क्लैंप किए गए कोर एक्सप्लांट्स को कवर करने वाले माध्यम को महाप्राण करें। हाइड्रोजेल के भीतर कोर एक्सप्लांट के केंद्रीय प्लेसमेंट की गारंटी के लिए, हाइड्रोजेल को एक क्लैंप्ड कोर एक्सप्लांट के चारों ओर डालना आदर्श है जो थोड़ा तनावपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, क्लैंप धारकों को उचित लंबाई पर छेद के साथ सेट (3 डी-प्रिंटेड) प्लेट में ठीक करने के लिए डॉवेल पिन और एम 3 x 16 मिमी बोल्ट स्क्रू का उपयोग करें। 50 मिनट पोलीमराइजेशन समय के बाद, एम्बेडेड कोर एक्सप्लांट को वांछित संस्कृति स्थितियों के आधार पर फिर से डिटेंशन किया जा सकता है। संस्कृति के दौरान संयोजन अनुभवों तनाव की मात्रा प्रयोगात्मक परिणामों पर गहरा प्रभाव पड़ता है और नमूने औरशर्तों 21 भर में एक समान रखा जा रहा है.

फिर भी, प्रयोगात्मक परिणामों पर यांत्रिक (संयुक्त राष्ट्र-) लोडिंग का बड़ा प्रभाव अधिकांश ऊतक-इंजीनियर विकल्पों पर संयोजन मॉडल का एक मुख्य लाभ है, खासकर जब से कोर एक्सप्लांट की बनाए रखा मैट्रिक्स संरचना को सेलुलर स्तर90 पर विवो लोडिंग पैटर्न में जटिल को फिर से बनाना चाहिए। व्यवहार में, केवल रैखिक लोचदार मापांक की माप, अधिकतम तन्यता तनाव, और assemblooids के अधिकतम तन्यता तनाव अब तक प्रदर्शन किया गया है, थकान शक्ति और तनाव छूट माप के लिए प्रोटोकॉल कहीं और कण्डरा कोर explants के लिए वर्णित किया गया है और assemblooids91,92 के लिए लागू किया जाना चाहिए. विवो जैसे लोडिंग पैटर्न के अलावा, असेंबल की मल्टी-लेवल मॉड्यूलरिटी इसका सबसे बड़ा फायदा है। व्यक्तिगत संस्कृति कक्षों के लिए धन्यवाद, प्रत्येक नमूने के लिए अलग से आला स्थितियों का एक नियंत्रणीय सेट सेट किया जा सकता है (यानी, तापमान, ऑक्सीजन तनाव, ग्लूकोज एकाग्रता, पूरक, उत्तेजक, अवरोधक, और एक प्लेट के साथ स्थिर खिंचाव)। अगला, मैट्रिक्स कठोरता और बाह्य डिब्बे की मैट्रिक्स संरचना हाइड्रोजेल संरचना के माध्यम से अनुकूलन योग्य हैं और उदाहरण के लिए, अधिक कोलेजन -3 और सेलुलर फाइब्रोनेक्टिन 93,94,95को शामिल करके तेजी से रोगग्रस्त ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देंगे। बाह्य डिब्बे में मूल्यांकन सेल आबादी बीज के लिए जो कोशिकाओं का चयन करके आसानी से अनुकूलनीय हैं, लेकिन यह भी स्थापित आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों और माउस लाइनों (यानी, ScxLin सेल की कमी)96का लाभ उठाने से कण्डरा कोर संयंत्र में संशोधित किया जा सकता है. दो डिब्बों की अलग-अलग मैट्रिक्स और सेल संरचना आगे एक अद्वितीय कंपार्टमेंटल 3 डी संरचना प्रदान करती है जो एक और केंद्रीय कण्डरा हॉलमार्क 1,30,46 है।

इस प्रणाली का उपयोग करते समय, परिणाम मापदंडों की ग्रैन्युलैरिटी के लिए सिस्टम की प्रतिरूपकता के परिणामों पर विचार करना महत्वपूर्ण है। जबकि सेल प्रसार और भर्ती का मूल्यांकन प्रत्येक डिब्बे के लिए अलग से किया जा सकता है, यांत्रिक गुण, स्रावी घटक, और गिरावट उत्पाद वर्तमान में केवल पूर्ण संयोजन के लिए औसत दर्जे का है। थ्रूपुट के संबंध में, एक ठीक से प्रशिक्षित व्यक्ति नियमित कार्यदिवस में 50 असेंबल तक तैयार कर सकता है, जिसमें मुख्य अड़चन क्लैंपिंग प्रक्रिया है। जबकि कुछ रीडआउट विधियां परस्पर अनन्य हैं, यांत्रिक गुणों और स्रावी घटकों का आकलन एक ही नमूने के साथ-साथ या तो सेल जनसंख्या संरचना (प्रवाह साइटोमेट्री), सेल ट्रांसक्रिप्टोम (आरटी-क्यूपीसीआर, आरएनए-अनुक्रमण), या मैट्रिक्स और सेल वितरण (इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री / प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) पर दोहराव से करना संभव है। पिछले प्रकाशनों में, इन तरीकों को बड़े पैमाने पर अंतरकोशिकीय, कोर में पार compartmental बातचीत चिह्नित करने के लिए तैनात किया गया है // fibroblast और कोर // मैक्रोफेज assmbloids एक घाव की तरहआला 84,85 के संपर्क में है. इस काम में, विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंटल उत्तेजनाओं के तहत कोर और बाह्य एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच क्रॉस-कम्पार्टमेंटल इंटरप्ले की जांच करने के लिए असेंबल मॉडल सिस्टम की क्षमता का पता लगाया गया है।

मॉडल प्रणाली की प्रतिरूपकता विधि के भविष्य के शोधन की अनुमति देती है, जो वर्तमान डिजाइन पुनरावृत्ति की निम्नलिखित सीमाओं को दूर करने के लिए आवश्यक है। इस काम में प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और हाल ही में प्रकाशित एकल-कोशिका आरएनए-अनुक्रमण डेटा से पता चला है कि कण्डरा कोर-निवासी टेनोसाइट्स और अकिलीज़ कण्डरा-व्युत्पन्न आबादी पहलेसे 24,34,59,84,97 की तुलना में अधिक विषम हैं। इसके अलावा, शुरू में कोर- या हाइड्रोजेल-निवासी सेल आबादी का प्रवासी व्यवहार संस्कृति के दौरान संयोजन को धुंधला करता है। दोनों कारक एक साथ विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक मतभेदों को विशेषता देना और प्रवासन-आधारित प्रक्रियाओं से प्रसार को अलग करना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इस सीमा को हाल ही में विवो अध्ययनों में विशेषता स्वस्थ या रोगग्रस्त tendons की सेलुलर संरचना के आधार पर प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ इनपुट आबादी को परिष्कृत करके दूर किया जा सकता है, एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण को लागू करके रीडआउट में सुधार, और माइक्रोस्कोपी के दौरान एक EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) धुंधला हो जाना जैसे प्रसार मार्करों को एकीकृत करना।

यहाँ प्रस्तुत संयोजन भी वर्तमान में उपलब्ध इन विट्रो सिस्टम है कि रोगग्रस्त अंगों शरीर98,99 के बाकी हिस्सों से काट दिया अनुकरण में के अधिकांश के साथ एक कमजोरी साझा. हालांकि, यहां उपयोग किए जाने वाले संस्कृति कक्ष-आधारित मंच मॉडल प्रणाली को एक बहु-अंग मंच में एकीकरण के लिए अच्छी तरह से रखता है जहां विभिन्न अंगों की नकल करने वाले संयोजन जुड़े हुए हैं और इंटरऑर्गन इंटरैक्शन का अध्ययन किया जा सकता है।

इसके मूल में, मॉडल प्रणाली स्थितीय कृंतक टेंडन पर आधारित है, जिसके परिणामस्वरूप कमियों का अपना अनूठा सेट होता है। सबसे पहले, परिणामों की अनुवाद क्षमता जंगली प्रकार के चूहों द्वारा बाधित है जो कण्डरा रोगों 8,100,101 से विकसित या पीड़ित नहीं है। मनुष्यों या नव विकसित माउस उपभेदों से ऊतकों और कोशिकाओं को एकीकृत करना जो कण्डरा रोग के पहलुओं को प्रदर्शित करते हैं, इस मुद्दे को कम कर सकते हैं102. मानव-आधारित संयोजन की ओर स्विच विशेष रूप से दिलचस्प है, क्योंकि यह अलग-अलग रोगग्रस्त टेंडन (यानी, टेंडिनिटिस, टेंडिनोसिस, या पेरिटेंडिनिटिस) और यहां तक कि उपचार-प्रतिरोधी दाताओं से रोगी-व्युत्पन्न ऊतकों के साथ अध्ययन को सक्षम करेगा जो अधिक व्यक्तिगत उपचार कार्यक्रमों को अनलॉक कर सकते हैं। दूसरा, murine पूंछ कण्डरा explants अधिभार-प्रेरित microdamage विशेष रूप से अच्छी तरह से संभाल नहीं है, जो तीव्र कण्डरा क्षति के अध्ययन के लिए मॉडल प्रणाली की प्रयोज्यता को सीमित करता है.

इन सभी कारणों से, एक्सप्लांट // हाइड्रोजेल असेंबलॉइड कण्डरा कोर जीव विज्ञान, मैट्रिक्स संरचना-फ़ंक्शन इंटरैक्शन, और आला-प्रेरित माइक्रोडैमेज के जवाब में विशिष्ट सेल आबादी के बीच क्रॉस-कम्पार्टमेंटल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख स्थिति में हैं। इन उच्च-थ्रूपुट अध्ययनों से एकत्रित अंतर्दृष्टि विवो अनुसंधान और उपचार विकास में दिशा दे सकती है।

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को ईटीएच ग्रांट 1-005733 द्वारा वित्त पोषित किया गया था

Materials

0.4 mm x 25 mm injection needle (G27) Sterican 9186174
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament Prusa NA
4% formaldehyde Roti-Histofix P087.4
Accutase cell detachment solution Sigma-Aldrich A6964-100ML
Amphotericin VWR L0009-100
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2 Motic NA
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel RS PRO 1871235
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel RS PRO 1871207
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
CD146 antibody: PE anti-mouse BioLegend 134703
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse BioLegend 141709
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse BioLegend 102413
CD86 antibody: PE anti-mouse BioLegend 105007
Collagenase I Thermo Fisher Scientific 17100017
Collagenase IV  Gibco 17104-019
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392-100ML
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 7000183
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G
DMEM/F12  Sigma 7002211
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel Accu HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone KauPO 09301-004-000001
Endopan 3 Kit Pan-Biotech P04-0010K
Endothelial cell growth supplement  Lonza CC-3162
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL) Eppendorf 30121023
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO Sigma-Aldrich 46043-1MG-F
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse BioLegend 123151
Falcon plastic tube (15 mL) Corning 352096
Falcon plastic tube (50 mL) Corning 352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa BD Bioscience 23-11617-02
Gelatin Invitrogen D12054
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate Sigma Z805939-1EA
Heparin Sigma-Aldrich H3149-10KU
Hydroxyproline assay Sigma-Aldrich MAK008
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML Motic NA
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate Wako Chemicals 013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker Corning 6780-FP
MEM non-essential amino acids Sigma 7002231
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF) PeproTech 315-02-50ug
MSD assay Mesoscale Discovery various
NucBlue Thermo Fisher Scientific R37605
Nylon mesh strainer cap, 100 µm Corning 734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer Prusa i3 MK3S
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L Gibco 10010001
Puromycin Gibco A1113803
RBC lysis buffer VWR 786-650
recombinant m-CSF  PeproTech 315-02
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro Qiagen 74034
Slicing software: PrusaSlicer Prusa NA Version 2.6.0 or higher
Sterile Cell Strainer 100 µm Fisherbrand 22363549
Surgical scalpel blade No. 21 Swann-Morton 307
Trizol reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Trypsin-EDTA (0.5 %) Gibco 15400054
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References

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Stauber, T., Wolleb, M., Snedeker, J. G. Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair. J. Vis. Exp. (205), e65987, doi:10.3791/65987 (2024).
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