यहां, हम लोड-असर कण्डरा कोर ऊतक और बीमारी और चोट से सक्रिय सेल आबादी वाले एक बाहरी डिब्बे के बीच कण्डरा सेलुलर क्रॉसस्टॉक की नकल करने के लिए एक संयोजन मॉडल प्रणाली प्रस्तुत करते हैं। एक महत्वपूर्ण उपयोग के मामले के रूप में, हम प्रदर्शित करते हैं कि बाहरी एंडोथेलियल कोशिकाओं के रोग-प्रासंगिक सक्रियण की जांच के लिए सिस्टम को कैसे तैनात किया जा सकता है।
टेंडन मांसपेशियों की ताकतों को हड्डियों में स्थानांतरित करके हरकत को सक्षम करते हैं। वे एक कठिन कण्डरा कोर पर भरोसा करते हैं जिसमें कोलेजन फाइबर और स्ट्रोमल सेल आबादी शामिल होती है। यह लोड-असर कोर एक श्लेष जैसी ऊतक परत द्वारा शामिल, पोषित और मरम्मत की जाती है जिसमें बाहरी कण्डरा डिब्बे शामिल होते हैं। इस परिष्कृत डिजाइन के बावजूद, कण्डरा की चोटें आम हैं, और नैदानिक उपचार अभी भी फिजियोथेरेपी और सर्जरी पर निर्भर करता है। उपलब्ध प्रयोगात्मक मॉडल प्रणालियों की सीमाओं ने उपन्यास रोग-संशोधित उपचार और रिलैप्स-रोकथाम नैदानिक शासनों के विकास को धीमा कर दिया है।
विवो में , मानव अध्ययन मरम्मत सर्जरी के दौरान नमूना किए गए अंत-चरण रोगग्रस्त या टूटे हुए ऊतकों के लिए स्वस्थ tendons की तुलना करने के लिए सीमित हैं और अंतर्निहित कण्डरा रोग के अनुदैर्ध्य अध्ययन की अनुमति नहीं देते हैं। विवो में पशु मॉडल भी अपारदर्शी शारीरिक जटिलता, जानवरों पर नैतिक बोझ और उनके उपयोग से जुड़ी बड़ी आर्थिक लागतों के बारे में महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, विवो पशु मॉडल में दवाओं और बहुकोशिकीय, बहु-ऊतक बातचीत मार्गों की व्यवस्थित जांच के लिए खराब अनुकूल हैं। इन विट्रो मॉडल सिस्टम में सरल भी कम हो गया है। एक प्रमुख कारण कण्डरा कोशिकाओं और उनके कार्य का सार्थक अध्ययन करने के लिए आवश्यक त्रि-आयामी यांत्रिक लोडिंग को पर्याप्त रूप से दोहराने में विफलता है।
यहां प्रस्तुत नई 3 डी मॉडल प्रणाली म्यूरिन टेल टेंडन कोर एक्सप्लांट्स का शोषण करके इनमें से कुछ मुद्दों को कम करती है। महत्वपूर्ण रूप से, ये एक्सप्लांट एक माउस से बड़ी संख्या में आसानी से सुलभ हैं, सेलुलर स्तर पर सीटू लोडिंग पैटर्न में 3 डी बनाए रखते हैं, और विवो जैसे बाह्य मैट्रिक्स में सुविधा देते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मांसपेशियों से व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं, कण्डरा-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स, और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के साथ कोलेजन हाइड्रोगेल के साथ कण्डरा कोर एक्सप्लांट्स को बढ़ाने के तरीके पर चरण-दर-चरण निर्देश दिए जाते हैं ताकि रोग को प्रतिस्थापित किया जा सके- और चोट-सक्रिय सेल आबादी बाहरी कण्डरा डिब्बे के भीतर। यह प्रदर्शित किया जाता है कि बीमारी और चोट के दौरान उभरते बहुकोशिकीय क्रॉसस्टॉक की जांच के लिए परिणामी कण्डरा असेंब्लोइड को यंत्रवत् या परिभाषित माइक्रोएन्वायरमेंटल उत्तेजनाओं के माध्यम से कैसे चुनौती दी जा सकती है।
आंदोलन को सक्षम करने के लिए हड्डियों को मांसपेशियों की ताकतों को स्थानांतरित करने के अपने समारोह में, tendons मानव शरीर 1,2,3 में होने वाली सबसे चरम यांत्रिक तनाव में से कुछ का सामना. उम्र बढ़ने समाजों के कारण, मोटापे का प्रचलन बढ़ रहा है, और यंत्रवत् मांग खेल गतिविधियों की बढ़ती लोकप्रियता, कण्डरा रोगों और चोटों की व्यापकताविकसित देशों 4,5,6 में चढ़ाई करने का अनुमान है. इस वृद्धि का मुकाबला करने के लिए उपन्यास साक्ष्य आधारित और रोग संशोधित उपचार regimens के विकास वर्तमान में उपलब्ध मॉडल सिस्टम 1,7,8 की सीमाओं से बाधा उत्पन्न हुई है.
आदर्श रूप से, रोग और चोट की मरम्मत मॉडल यह अध्ययन करने की अनुमति देगा कि लक्ष्य अंग इनपुट मापदंडों के एक परिभाषित सेट (रोग ट्रिगर, तालिका 1 की नकल) को मापने योग्य आउटपुट मापदंडों (रोग हॉलमार्क का प्रतिनिधित्व, तालिका 2 का प्रतिनिधित्व) में कैसे संसाधित करता है, जबकि भ्रमित कारकों के लिए नियंत्रित करता है। इस तरह के मॉडल सिस्टम का उपयोग करने वाले अध्ययन तब बीमारी और चोट की मरम्मत के अंतर्निहित (पैथो-) शारीरिक प्रक्रियाओं की पहचान करने और ज्ञान प्राप्त करने में सक्षम होंगे जिनका उपयोग क्लीनिकों में बीमारी और चोट के निशान को रोकने या कम करने के लिए किया जा सकता है। टेंडन के लिए इस सिद्धांत को लागू करते हुए, एक उपयोगी मॉडल प्रणाली को बीमारी और चोट के लिए विवो कण्डरा प्रतिक्रिया के मध्य भागों को पुन: व्यवस्थित करना चाहिए, जिसमें निम्नलिखित हॉलमार्क शामिल हैं: माइक्रोडैमेज, सूजन, नवसंवहनीकरण, हाइपरसेल्युलरता, त्वरित मैट्रिक्स टर्नओवर, और डिकंपार्टमेंटलाइजेशन 9,10,11,12,13,14,15 . आधार के रूप में इन हॉलमार्क का उपयोग करके, एक सफल कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत मॉडल प्रणाली के लिए निम्नलिखित आवश्यकताओं का अनुमान लगाया जा सकता है।
यांत्रिक अधिभार कण्डरा चोट और रोग रोगजनन में एक केंद्रीय कारक होने की परिकल्पना की है और इस प्रकार माइक्रोडैमेज16 बनाने के लिए एक आम तौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है. इसलिए, नियंत्रणीय यांत्रिक भार क्षमता कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत मॉडल के लिए एक प्रमुख शर्त है। आदर्श रूप से, मॉडल सिस्टम तीन मुख्य मोड को सक्षम बनाता है: सिंगल स्ट्रेच-टू-डैमेज लोडिंग, थकान लोडिंग औरअनलोडिंग 8,17,18। यांत्रिक विरूपण पर, ऊतक निवासी कोशिकाओं तनाव बलों, कतरनी बलों (कोशिकाओं के आसपास कोलेजन फाइबर के फिसलने के कारण), और उतराई के दौरान या enthesis19,20 के पास होने वाली संपीड़न बलों का एक जटिल संयोजन अनुभव. मॉडल सिस्टम को इन जटिल लोडिंग पैटर्न को यथासंभव बारीकी से फिर से बनाना चाहिए।
मैट्रिक्स माइक्रोडैमेज को पेश करने का एक वैकल्पिक तरीका जैव रासायनिक तनावों का लाभ उठाना है जो कण्डरा रोग और चोट के लिए प्रणालीगत पूर्वाग्रहों की नकल करते हैं, जैसे (प्रो-) भड़काऊ साइटोकिन्स, ऑक्सीडेटिव तनाव, या उच्च ग्लूकोज सांद्रता 21,22,23। नतीजतन, एक नियंत्रणीय आला माइक्रोएन्वायरमेंट एक कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत मॉडल प्रणाली के लिए फायदेमंद है।
सूजन, नवसंवहनीकरण, और hypercellularity पुनरावृत्ति करने में सक्षम होने के लिए मॉडल सिस्टम के लिए एक आम शर्त सेल आबादी है कि इन प्रक्रियाओं24 ड्राइव की चयनात्मक उपस्थिति है. भड़काऊ प्रक्रियाओं के लिए, इन आबादी में न्यूट्रोफिल, टी-कोशिकाएं और मैक्रोफेज शामिल हैं, जबकि एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स को नवसंवहनीकरण 25,26,27,28,29का अध्ययन करने की आवश्यकता होगी। कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट न केवल कण्डरा की मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं, बल्कि प्रोलिफेरेटिव और माइग्रेटिंग कोशिकाओं के रूप में, कण्डरा रोग30,31,32,33,34,35,36में देखे गए स्थानीय हाइपरसेल्युलरिटी के लिए भी आंशिक रूप से जिम्मेदार हैं।
निवासी सेल आबादी में परिवर्तन के अलावा, कण्डरा मैट्रिक्स संरचना कण्डरा रोग और चोट के रूप में अच्छी तरह से 7,37,38,39,40 में बदल जाती है। सही रोग-प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंटल संकेतों को प्रस्तुत करने के लिए, मॉडल सिस्टम को लक्षित बीमारी या चोट चरण से मेल खाने वाली एक बाह्य मैट्रिक्स संरचना को एकीकृत करने में सक्षम होना चाहिए, उदाहरण के लिए, कोलेजन -1, कोलेजन -3 और सेलुलर फाइब्रोनेक्टिन41 के प्रासंगिक आनुपातिक संयोजनों को सक्षम करके।
कण्डरा कोर और बाह्य डिब्बों (यानी, एंडोटेनन, एपिटेनन और पैरेनॉन) में स्वस्थ टेंडन का कम्पार्टमेंटलाइजेशन उनके कार्य के लिए केंद्रीय है और अक्सर रोगग्रस्त या घायल टेंडन 1,42,43,44,45,46,47 में परेशान होता है . कण्डरा मॉडल सिस्टम में 3 डी कण्डरा compartmentalization को शामिल इसलिए न केवल अंतर्निहित de- और फिर से compartmentalization अधिक बारीकी से प्रक्रियाओं अनुकरण करने के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी साइटोकिन्स और पोषक तत्वों48,49 के सही spatiotemporal ढाल स्थापित करने में मदद करता है.
अंत में, प्रतिरूपकता मॉडल सिस्टम का एक और केंद्रीय संपत्ति है, शोधकर्ताओं की जांच प्रक्रियाओं 8,17 के दौरान पहले वर्णित तनाव के बीच के सही रिश्तेदार योगदान और परस्पर क्रिया गठबंधन करने के लिए अनुमति देता है.
इष्टतम इनपुट तौर-तरीकों का चयन करने के अलावा, एक महत्वपूर्ण कदम परिणामी आउटपुट में परिवर्तनों को मापने, निरीक्षण करने और ट्रैक करने में सक्षम है। मॉडल प्रणाली के यांत्रिक गुण (यानी, पैर की अंगुली क्षेत्र की लंबाई, रैखिक लोचदार मापांक, अधिकतम तन्यता तनाव, अधिकतम तन्यता तनाव, थकान शक्ति, और तनाव विश्राम) यहां केंद्रीय हैं, क्योंकि वे कण्डरा के मुख्य कार्य50,51,52की विशेषता रखते हैं। ऊतक-स्तर परिवर्तनों के लिए इन कार्यात्मक परिवर्तनों को जोड़ने के लिए, यह (कोलेजन) संरचनात्मक मैट्रिक्स क्षति का पता लगाने और ट्रैकिंग प्रसार और रोग की भर्ती पर नज़र रखने के तरीकों को सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है- और मरम्मत-प्रासंगिक सेल आबादी 30,53,54,55,56,57,58,59,60.
उभरते सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए, किसी को मात्रा का ठहराव (यानी, एलिसा, प्रोटिओमिक्स, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, फ्लो साइटोमेट्री)14,21,61,62के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन को अलग या चिह्नित करने में सक्षम होना चाहिए। जनसंख्या- या कम से कम डिब्बे-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण भी संभव होना चाहिए (यानी, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई [एफएसीएस], एकल-सेल/थोक आरएनए-अनुक्रमण, और वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर))21,24,27,63. मॉडल प्रणाली को एक ही नमूने पर और कई नमूनों पर उच्च-थ्रूपुट अध्ययनों को अनलॉक करने के लिए पर्याप्त तेजी से उपरोक्त आउटपुट मापदंडों को मापने की अनुमति देनी चाहिए।
मानव कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध मॉडल प्रणालियों में, मानव शरीर ही, निश्चित रूप से, सबसे अधिक प्रतिनिधि है। यह प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के साथ भी कम से कम संगत है। जबकि तीव्र कण्डरा चोटों के साथ रोगियों नैदानिक अध्ययन के लिए प्रचुर मात्रा में उपलब्ध हैं, प्रारंभिक tendinopathy के साथ रोगियों (सबसे आम कण्डरा रोग) काफी हद तक लक्षण मुक्त हैं और अक्सर नैदानिक रूप से पता लगाया जाना जब तक अधिक गंभीर परिवर्तन 14,64,65प्रकट होते हैं. यह महत्वपूर्ण क्षण जब कण्डरा homeostasis पटरी से उतर और इस पटरी से उतरने 16,66,67,68,69 के पीछे तंत्र को इंगित करने के लिए मुश्किल बनाता है. इसके अलावा, स्वस्थ tendons से बायोप्सी निकालने नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि इससे लगातार नुकसान हो सकता है। पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट पुनर्निर्माण सर्जरी से हैमस्ट्रिंग कण्डरा अवशेष अक्सर स्वस्थ नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, लेकिन यकीनन रोटेटर कफ, अकिलीज़ और पेटेलर टेंडन की तुलना में समारोह, यांत्रिक गुणों, सेल आबादी और मैट्रिक्स संरचना में भिन्न होते हैं जो आमतौर पर कण्डरा रोग और चोट70,71,72,73से प्रभावित होते हैं।
विवो में पशु मॉडल अधिक सुलभ और ट्रैक्टेबल हैं, लेकिन उनका उपयोग जानवरों पर एक महत्वपूर्ण नैतिक बोझ और शोधकर्ताओं पर आर्थिक लागत लगाता है। इसके अलावा, अधिकांश लोकप्रिय मॉडल जानवर या तो अनायास टेंडिनोपैथिक घावों (यानी, चूहों, चूहों, खरगोशों) को विकसित नहीं करते हैं या इसमें शामिल बहुकोशिकीय संचार मार्गों (यानी, घोड़े, खरगोश) को ट्रैक करने के लिए आवश्यक प्राइमरों और आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की कमी होती है।
इन विट्रो मॉडल सिस्टम में सरल 2 डी जटिलता/ट्रैक्टेबिलिटी स्पेक्ट्रम के दूसरी तरफ हैं और ट्रिगर्स 8,74 के अधिक नियंत्रणीय सेट के जवाब में विशिष्ट अंतरकोशिकीय संचार मार्गों के नियंत्रित, समय-कुशल अध्ययन की बेहतर अनुमति देते हैं। हालांकि, ये सरलीकृत प्रणालियां आमतौर पर बहु-आयामी यांत्रिक लोडिंग (यानी, तनाव, संपीड़न और कतरनी) को पुन: व्यवस्थित करने में विफल रहती हैं जो कण्डरा कार्यक्षमता के लिए केंद्रीय है। इसके अलावा, (बहुत) टिशू कल्चर प्लास्टिक की उच्च कठोरता ब्याज75,76 की रोग राज्य की नकल करने के उद्देश्य से कोटिंग्स द्वारा प्रदान की गई किसी भी मैट्रिक्स संकेतों ओवरराइड करते हैं.
इस खामी को दूर करने के लिए, तेजी से परिष्कृत ऊतक-इंजीनियर 3 डी मॉडल सिस्टम को एक लोड करने योग्य मैट्रिक्स प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है जिसकी संरचना कम से कम आंशिक रूप से वांछित रोगराज्य 77,78,79से मेल खा सकती है। फिर भी, इन प्रणालियों को न केवल विवो बाह्य मैट्रिक्स रचनाओं और सेलुलर लोडिंग पैटर्न में जटिल को सही ढंग से दोहराने के लिए संघर्ष है, लेकिन आम तौर पर लंबी अवधि की लोडेबिलिटी और पार कम्पार्टमेंटल संचार रास्ते है कि कण्डरा रोग समन्वय अध्ययन करने के लिए आवश्यक कम्पार्टमेंटल इंटरफेस की कमी है और चोट की मरम्मत 48,49,80.
पूर्व विवो कण्डरा एक्सप्लांट मॉडल सिस्टम में विवो जैसी मैट्रिक्स संरचना में एक अंतर्निहित का विशिष्ट लाभ होता है जिसमें पेरिसेल्युलर निचे, क्रॉस-कम्पार्टमेंटल बाधाएं, साथ ही स्पैटिओटेम्पोरल साइटोकाइन / पोषक तत्व ग्रेडिएंट शामिल होते हैं और जब बढ़ाया जाता है तो जटिल लोडिंग पैटर्न को पुन: व्यवस्थित करताहै 8. आकार पर निर्भर पोषक तत्व प्रसार सीमा का एक परिणाम के रूप में, बड़े पशु मॉडल (यानी, घोड़ों) से explants कण्डरा रोग और चोटकी मरम्मत 81,82,83 के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए जीवित रखने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. इस बीच, murine प्रजातियों (यानी, Achilles कण्डरा, पटेलर कण्डरा) से छोटे explants reproducibly क्लैंप और यंत्रवत् लोड करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं. उनका आकार भी सामग्री की मात्रा को बाधित करता है जिसे सेल-, प्रोटीन- और जीन-स्तरीय रीडआउट के लिए नमूनों को पूल किए बिना और थ्रूपुट को कम किए बिना इकट्ठा किया जा सकता है। इस अर्थ में, murine पूंछ कण्डरा फासिकल्स कण्डरा रोग और चोट की मरम्मत के उच्च-थ्रूपुट अध्ययन को अनलॉक करने की क्षमता प्रदान करते हैं क्योंकि वे एक ही माउस से बड़ी मात्रा में आसानी से उपलब्ध होते हैं, विवो पेरिसेलुलर मैट्रिक्स संरचना में परिसर को संरक्षित करते हैं, और सेलुलर लोडिंग पैटर्न को पुन: व्यवस्थित करते हैं। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, हालांकि, वे अपने अधिकांश बाहरी डिब्बे खो देते हैं और उसमें संवहनी, प्रतिरक्षा, और फाइब्रोब्लास्ट आबादी होती है जिसे अब कण्डरा रोग चलाने और 8,18 की मरम्मत करने के लिए माना जाता है।
इस अंतर को पाटने के लिए, 3 डी हाइड्रोजेल-आधारित मॉडल सिस्टम के फायदों के साथ म्यूरिन टेल टेंडन-व्युत्पन्न कोर एक्सप्लांट्स के फायदों को मिलाकर एक मॉडल प्रणाली विकसित की गई है। इस मॉडल प्रणाली में एक सेल से लदी (कोलेजन -1) हाइड्रोजेल पूंछ कण्डरा explants84,85 के आसपास डाली के होते हैं. इस पत्र में, आवश्यक विनिर्माण कदम उपयोगी रीडआउट के साथ विस्तार से प्रदान किए जाते हैं जो एंडोथेलियल सेल-लेटे हुए टाइप -1 कोलेजन हाइड्रोजेल (बाहरी डिब्बे) के भीतर कोर एक्सप्लांट्स (आंतरिक डिब्बे) को सह-संवर्धन करके प्राप्त किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत असेंबल मॉडल सिस्टम में हाइलाइट करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, मॉडल प्रणाली केवल अपने घटकों की गुणवत्ता के रूप में अच्छी है। यह विधानसभा प्रक्रिया शुरू करने से पहले खुर्दबीन के तहत कोर संयंत्र और होने के लिए बीज सेल आबादी की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. फ्लो साइटोमेट्री के साथ कम से कम एक बार पृथक सेल आबादी के फेनोटाइप को सत्यापित करना भी उतना ही महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से जब कोलेजन -1 का एक नया बैच पहली बार उपयोग किया जाता है, तो इसमें कोशिकाओं को एम्बेड करने से पहले ट्रायल रन में क्रॉसलिंकिंग गति की जांच करना फायदेमंद होता है। असेंबल असेंबली को बहुत अधिक मैनुअल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जिससे संक्रमण का खतरा बढ़ जाता है। संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, लामिना वायु प्रवाह के साथ एक बाँझ जैव सुरक्षा हुड में काम करते हैं, अक्सर दस्ताने का आदान-प्रदान करते हैं, और दस्ताने के साथ-साथ 80% इथेनॉल के साथ काम करने की जगह को भी नष्ट कर देते हैं। समान कारणों से, 3D-प्रिंटेड क्लैंप होल्डर का एक से अधिक बार उपयोग न करें। एम्बेडिंग प्रक्रिया से पहले, समय से पहले क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए बर्फ पर सभी हाइड्रोजेल घटकों (क्रॉसलिंकिंग समाधान, कोलेजन -1 समाधान) को रखना महत्वपूर्ण है। नतीजतन, क्रॉसलिंकिंग समाधान के उच्च पीएच और कम तापमान के कारण कोशिका मृत्यु को सीमित करने के लिए कोशिकाओं को क्रॉसलिंकिंग समाधान में जोड़े जाने के बाद जल्दी से काम करना चाहिए। कोर एक्सप्लांट में सुखाने से संबंधित कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए, कोलेजन -1 समाधान के साथ क्रॉसलिंकिंग समाधान मिश्रण करने से तुरंत पहले क्लैंप किए गए कोर एक्सप्लांट्स को कवर करने वाले माध्यम को महाप्राण करें। हाइड्रोजेल के भीतर कोर एक्सप्लांट के केंद्रीय प्लेसमेंट की गारंटी के लिए, हाइड्रोजेल को एक क्लैंप्ड कोर एक्सप्लांट के चारों ओर डालना आदर्श है जो थोड़ा तनावपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, क्लैंप धारकों को उचित लंबाई पर छेद के साथ सेट (3 डी-प्रिंटेड) प्लेट में ठीक करने के लिए डॉवेल पिन और एम 3 x 16 मिमी बोल्ट स्क्रू का उपयोग करें। 50 मिनट पोलीमराइजेशन समय के बाद, एम्बेडेड कोर एक्सप्लांट को वांछित संस्कृति स्थितियों के आधार पर फिर से डिटेंशन किया जा सकता है। संस्कृति के दौरान संयोजन अनुभवों तनाव की मात्रा प्रयोगात्मक परिणामों पर गहरा प्रभाव पड़ता है और नमूने औरशर्तों 21 भर में एक समान रखा जा रहा है.
फिर भी, प्रयोगात्मक परिणामों पर यांत्रिक (संयुक्त राष्ट्र-) लोडिंग का बड़ा प्रभाव अधिकांश ऊतक-इंजीनियर विकल्पों पर संयोजन मॉडल का एक मुख्य लाभ है, खासकर जब से कोर एक्सप्लांट की बनाए रखा मैट्रिक्स संरचना को सेलुलर स्तर90 पर विवो लोडिंग पैटर्न में जटिल को फिर से बनाना चाहिए। व्यवहार में, केवल रैखिक लोचदार मापांक की माप, अधिकतम तन्यता तनाव, और assemblooids के अधिकतम तन्यता तनाव अब तक प्रदर्शन किया गया है, थकान शक्ति और तनाव छूट माप के लिए प्रोटोकॉल कहीं और कण्डरा कोर explants के लिए वर्णित किया गया है और assemblooids91,92 के लिए लागू किया जाना चाहिए. विवो जैसे लोडिंग पैटर्न के अलावा, असेंबल की मल्टी-लेवल मॉड्यूलरिटी इसका सबसे बड़ा फायदा है। व्यक्तिगत संस्कृति कक्षों के लिए धन्यवाद, प्रत्येक नमूने के लिए अलग से आला स्थितियों का एक नियंत्रणीय सेट सेट किया जा सकता है (यानी, तापमान, ऑक्सीजन तनाव, ग्लूकोज एकाग्रता, पूरक, उत्तेजक, अवरोधक, और एक प्लेट के साथ स्थिर खिंचाव)। अगला, मैट्रिक्स कठोरता और बाह्य डिब्बे की मैट्रिक्स संरचना हाइड्रोजेल संरचना के माध्यम से अनुकूलन योग्य हैं और उदाहरण के लिए, अधिक कोलेजन -3 और सेलुलर फाइब्रोनेक्टिन 93,94,95को शामिल करके तेजी से रोगग्रस्त ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देंगे। बाह्य डिब्बे में मूल्यांकन सेल आबादी बीज के लिए जो कोशिकाओं का चयन करके आसानी से अनुकूलनीय हैं, लेकिन यह भी स्थापित आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों और माउस लाइनों (यानी, ScxLin सेल की कमी)96का लाभ उठाने से कण्डरा कोर संयंत्र में संशोधित किया जा सकता है. दो डिब्बों की अलग-अलग मैट्रिक्स और सेल संरचना आगे एक अद्वितीय कंपार्टमेंटल 3 डी संरचना प्रदान करती है जो एक और केंद्रीय कण्डरा हॉलमार्क 1,30,46 है।
इस प्रणाली का उपयोग करते समय, परिणाम मापदंडों की ग्रैन्युलैरिटी के लिए सिस्टम की प्रतिरूपकता के परिणामों पर विचार करना महत्वपूर्ण है। जबकि सेल प्रसार और भर्ती का मूल्यांकन प्रत्येक डिब्बे के लिए अलग से किया जा सकता है, यांत्रिक गुण, स्रावी घटक, और गिरावट उत्पाद वर्तमान में केवल पूर्ण संयोजन के लिए औसत दर्जे का है। थ्रूपुट के संबंध में, एक ठीक से प्रशिक्षित व्यक्ति नियमित कार्यदिवस में 50 असेंबल तक तैयार कर सकता है, जिसमें मुख्य अड़चन क्लैंपिंग प्रक्रिया है। जबकि कुछ रीडआउट विधियां परस्पर अनन्य हैं, यांत्रिक गुणों और स्रावी घटकों का आकलन एक ही नमूने के साथ-साथ या तो सेल जनसंख्या संरचना (प्रवाह साइटोमेट्री), सेल ट्रांसक्रिप्टोम (आरटी-क्यूपीसीआर, आरएनए-अनुक्रमण), या मैट्रिक्स और सेल वितरण (इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री / प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) पर दोहराव से करना संभव है। पिछले प्रकाशनों में, इन तरीकों को बड़े पैमाने पर अंतरकोशिकीय, कोर में पार compartmental बातचीत चिह्नित करने के लिए तैनात किया गया है // fibroblast और कोर // मैक्रोफेज assmbloids एक घाव की तरहआला 84,85 के संपर्क में है. इस काम में, विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंटल उत्तेजनाओं के तहत कोर और बाह्य एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच क्रॉस-कम्पार्टमेंटल इंटरप्ले की जांच करने के लिए असेंबल मॉडल सिस्टम की क्षमता का पता लगाया गया है।
मॉडल प्रणाली की प्रतिरूपकता विधि के भविष्य के शोधन की अनुमति देती है, जो वर्तमान डिजाइन पुनरावृत्ति की निम्नलिखित सीमाओं को दूर करने के लिए आवश्यक है। इस काम में प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और हाल ही में प्रकाशित एकल-कोशिका आरएनए-अनुक्रमण डेटा से पता चला है कि कण्डरा कोर-निवासी टेनोसाइट्स और अकिलीज़ कण्डरा-व्युत्पन्न आबादी पहलेसे 24,34,59,84,97 की तुलना में अधिक विषम हैं। इसके अलावा, शुरू में कोर- या हाइड्रोजेल-निवासी सेल आबादी का प्रवासी व्यवहार संस्कृति के दौरान संयोजन को धुंधला करता है। दोनों कारक एक साथ विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक मतभेदों को विशेषता देना और प्रवासन-आधारित प्रक्रियाओं से प्रसार को अलग करना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इस सीमा को हाल ही में विवो अध्ययनों में विशेषता स्वस्थ या रोगग्रस्त tendons की सेलुलर संरचना के आधार पर प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ इनपुट आबादी को परिष्कृत करके दूर किया जा सकता है, एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण को लागू करके रीडआउट में सुधार, और माइक्रोस्कोपी के दौरान एक EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) धुंधला हो जाना जैसे प्रसार मार्करों को एकीकृत करना।
यहाँ प्रस्तुत संयोजन भी वर्तमान में उपलब्ध इन विट्रो सिस्टम है कि रोगग्रस्त अंगों शरीर98,99 के बाकी हिस्सों से काट दिया अनुकरण में के अधिकांश के साथ एक कमजोरी साझा. हालांकि, यहां उपयोग किए जाने वाले संस्कृति कक्ष-आधारित मंच मॉडल प्रणाली को एक बहु-अंग मंच में एकीकरण के लिए अच्छी तरह से रखता है जहां विभिन्न अंगों की नकल करने वाले संयोजन जुड़े हुए हैं और इंटरऑर्गन इंटरैक्शन का अध्ययन किया जा सकता है।
इसके मूल में, मॉडल प्रणाली स्थितीय कृंतक टेंडन पर आधारित है, जिसके परिणामस्वरूप कमियों का अपना अनूठा सेट होता है। सबसे पहले, परिणामों की अनुवाद क्षमता जंगली प्रकार के चूहों द्वारा बाधित है जो कण्डरा रोगों 8,100,101 से विकसित या पीड़ित नहीं है। मनुष्यों या नव विकसित माउस उपभेदों से ऊतकों और कोशिकाओं को एकीकृत करना जो कण्डरा रोग के पहलुओं को प्रदर्शित करते हैं, इस मुद्दे को कम कर सकते हैं102. मानव-आधारित संयोजन की ओर स्विच विशेष रूप से दिलचस्प है, क्योंकि यह अलग-अलग रोगग्रस्त टेंडन (यानी, टेंडिनिटिस, टेंडिनोसिस, या पेरिटेंडिनिटिस) और यहां तक कि उपचार-प्रतिरोधी दाताओं से रोगी-व्युत्पन्न ऊतकों के साथ अध्ययन को सक्षम करेगा जो अधिक व्यक्तिगत उपचार कार्यक्रमों को अनलॉक कर सकते हैं। दूसरा, murine पूंछ कण्डरा explants अधिभार-प्रेरित microdamage विशेष रूप से अच्छी तरह से संभाल नहीं है, जो तीव्र कण्डरा क्षति के अध्ययन के लिए मॉडल प्रणाली की प्रयोज्यता को सीमित करता है.
इन सभी कारणों से, एक्सप्लांट // हाइड्रोजेल असेंबलॉइड कण्डरा कोर जीव विज्ञान, मैट्रिक्स संरचना-फ़ंक्शन इंटरैक्शन, और आला-प्रेरित माइक्रोडैमेज के जवाब में विशिष्ट सेल आबादी के बीच क्रॉस-कम्पार्टमेंटल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख स्थिति में हैं। इन उच्च-थ्रूपुट अध्ययनों से एकत्रित अंतर्दृष्टि विवो अनुसंधान और उपचार विकास में दिशा दे सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ईटीएच ग्रांट 1-005733 द्वारा वित्त पोषित किया गया था
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27) | Sterican | 9186174 | |
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament | Prusa | NA | |
4% formaldehyde | Roti-Histofix | P087.4 | |
Accutase cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Amphotericin | VWR | L0009-100 | |
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2 | Motic | NA | |
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel | RS PRO | 1871235 | |
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel | RS PRO | 1871207 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CD146 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 134703 | |
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 141709 | |
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 102413 | |
CD86 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 105007 | |
Collagenase I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392-100ML | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 7000183 | |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
DMEM/F12 | Sigma | 7002211 | |
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel | Accu | HDP-3-16-A1 | |
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone | KauPO | 09301-004-000001 | |
Endopan 3 Kit | Pan-Biotech | P04-0010K | |
Endothelial cell growth supplement | Lonza | CC-3162 | |
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 30121023 | |
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO | Sigma-Aldrich | 46043-1MG-F | |
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse | BioLegend | 123151 | |
Falcon plastic tube (15 mL) | Corning | 352096 | |
Falcon plastic tube (50 mL) | Corning | 352070 | |
Flow cytometer: LSR II Fortessa | BD Bioscience | 23-11617-02 | |
Gelatin | Invitrogen | D12054 | |
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate | Sigma | Z805939-1EA | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
Hydroxyproline assay | Sigma-Aldrich | MAK008 | |
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML | Motic | NA | |
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate | Wako Chemicals | 013-19641 | |
LSE Low Speed Orbital Shaker | Corning | 6780-FP | |
MEM non-essential amino acids | Sigma | 7002231 | |
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF) | PeproTech | 315-02-50ug | |
MSD assay | Mesoscale Discovery | various | |
NucBlue | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nylon mesh strainer cap, 100 µm | Corning | 734-2761 | |
Original Prusa i3 MK3S 3D printer | Prusa | i3 MK3S | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L | Gibco | 10010001 | |
Puromycin | Gibco | A1113803 | |
RBC lysis buffer | VWR | 786-650 | |
recombinant m-CSF | PeproTech | 315-02 | |
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro | Qiagen | 74034 | |
Slicing software: PrusaSlicer | Prusa | NA | Version 2.6.0 or higher |
Sterile Cell Strainer 100 µm | Fisherbrand | 22363549 | |
Surgical scalpel blade No. 21 | Swann-Morton | 307 | |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Trypsin-EDTA (0.5 %) | Gibco | 15400054 |