질병 및 복구에서 세포 누화를 조사하기 위한 힘줄 집합체 엔지니어링

Summary

여기에서는 하중을 견디는 힘줄 코어 조직과 질병 및 부상에 의해 활성화된 세포 집단을 포함하는 외인성 구획 사이의 힘줄 세포 누화를 모방하는 조립체 모델 시스템을 제시합니다. 중요한 사용 사례로, 외인성 내피 세포의 질병 관련 활성화를 조사하기 위해 시스템을 배포하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

힘줄은 근육의 힘을 뼈에 전달하여 운동을 가능하게 합니다. 그들은 콜라겐 섬유와 기질 세포 집단으로 구성된 단단한 힘줄 코어에 의존합니다. 이 하중을 견디는 코어는 외인성 힘줄 구획을 구성하는 활액과 같은 조직층에 의해 둘러싸이고, 영양이 공급되고, 복구됩니다. 이러한 정교한 설계에도 불구하고 힘줄 부상은 흔하며 임상 치료는 여전히 물리 치료와 수술에 의존합니다. 사용 가능한 실험 모델 시스템의 한계로 인해 새로운 질병 변형 치료법 및 재발 방지 임상 요법의 개발이 느려졌습니다.

생체 내 인간 연구는 건강한 힘줄과 복원 수술 중에 샘플링한 말기 질병 또는 파열 조직을 비교하는 것으로 제한되며 근본적인 힘줄 질환에 대한 종단 연구는 허용하지 않습니다. 생체 내 동물 모델은 또한 불투명한 생리학적 복잡성, 동물에 대한 윤리적 부담 및 사용과 관련된 큰 경제적 비용과 관련하여 중요한 한계를 제시합니다. 또한, 생체 내 동물 모델은 약물 및 다세포, 다중 조직 상호 작용 경로의 체계적인 탐색에 적합하지 않습니다. 더 간단한 in vitro 모델 시스템도 부족했습니다. 한 가지 주요 이유는 힘줄 세포와 그 기능을 의미 있게 연구하는 데 필요한 3차원 기계적 하중을 적절하게 복제하지 못했기 때문입니다.

여기에 제시된 새로운 3D 모델 시스템은 쥐 꼬리 힘줄 코어 외식을 활용하여 이러한 문제 중 일부를 완화합니다. 중요한 것은 이러한 외식은 단일 마우스에서 대량으로 쉽게 접근할 수 있고, 세포 수준에서 3D in situ 로딩 패턴을 유지하며, in vivo 유사 세포외 기질을 특징으로 한다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 외인성 힘줄 구획 내에서 질병 및 부상 활성화 세포 집단을 대체하기 위해 근육 유래 내피 세포, 힘줄 유래 섬유아세포 및 골수 유래 대식세포가 함유된 콜라겐 하이드로겔로 힘줄 코어 외식을 보강하는 방법에 대한 단계별 지침이 제공됩니다. 그 결과 힘줄 아셈블로이드가 기계적으로 또는 정의된 미세환경 자극을 통해 도전하여 질병 및 부상 중에 발생하는 다세포 누화를 조사할 수 있는 방법을 보여줍니다.

Introduction

근육의 힘을 뼈에 전달하여 움직일 수 있도록 하는 기능에서 힘줄은 인체에서 발생하는 가장 극심한 기계적 스트레스에 직면합니다 ^1,2,3. 고령화 사회, 비만 유병률 증가, 기계적으로 힘든 스포츠 활동의 인기 증가로 인해 선진국에서 힘줄 질환 및 부상의 유병률이 증가할 것으로 예상됩니다 ^4,5,6. 이러한 증가에 대처하기 위한 새로운 증거 기반 및 질병 수정 치료 요법의 개발은 현재 이용 가능한 모델 시스템의 한계로 인해 방해를 받고 있다 ^1,7,8.

이상적으로, 질병 및 부상 복구 모델은 표적 기관이 교란 요인을 통제하면서 정의된 입력 매개변수 세트(질병 유발 요인 모방, 표 1)를 측정 가능한 출력 매개변수(질병 특징 표시, 표 2)로 처리하는 방법을 연구할 수 있습니다. 이러한 모델 시스템을 사용하는 연구는 질병 및 부상 복구의 기저에 있는 (병리적) 생리학적 과정을 식별하고 클리닉에서 질병 및 부상 특징을 예방하거나 줄이는 데 활용할 수 있는 지식을 얻을 수 있습니다. 이 원리를 힘줄에 적용하면, 유용한 모델 시스템은 질병 및 부상에 대한 생체 내 힘줄 반응의 중심 부분을 요약해야 하며, 이는 다음과 같은 특징을 포함해야 합니다: 미세 손상, 염증, 신생혈관화, 과세포성, 가속화된 매트릭스 회전율 및 구획 제거(decompartmentalization) 9,10,11,12,13,14,15 . 이러한 특징을 기반으로 성공적인 힘줄 질환 및 부상 복구 모델 시스템을 위한 다음과 같은 요구 사항을 추론할 수 있습니다.

기계적 과부하는 힘줄 손상 및 질병 발병의 핵심 요인으로 가정되며, 따라서 미세 손상을 일으키기 위해 일반적으로 사용되는 실험적 접근 방식입니다¹⁶. 따라서 제어 가능한 기계적 하중 가능성은 힘줄 질환 및 부상 수리 모델의 주요 전제 조건입니다. 이상적으로 모델 시스템은 단일 신축-손상 하중, 피로 하중 및 언로딩 ^8,17,18의 세 가지 주요 모드를 사용할 수 있습니다. 기계적 변형 시, 조직-상주 세포는 인장력, 전단력(세포를 둘러싼 콜라겐 섬유의 슬라이딩으로 인해) 및 언로딩 중 또는 엔테시스 근처에서 발생하는 압축력의 복잡한 조합을 경험한다(^19,20). 모델 시스템은 이러한 복잡한 하중 패턴을 가능한 한 가깝게 재현해야 합니다.

매트릭스 미세 손상을 도입하는 또 다른 방법은 (전)염증성 사이토카인, 산화 스트레스 또는 높은 포도당 농도와 같은 힘줄 질환 및 부상에 대한 전신 소인을 모방하는 생화학적 스트레스 요인을 활용하는 것입니다 21,22,23. 결과적으로, 제어 가능한 틈새 미세환경은 힘줄 질환 및 부상 복구 모델 시스템에 유리합니다.

모델 시스템이 염증, 신생혈관 형성 및 과세포성을 재현할 수 있는 일반적인 전제 조건은 이러한 과정을 주도하는 세포 집단의 선택적 존재이다²⁴. 염증 과정의 경우 이러한 집단에는 호중구, T 세포 및 대식세포가 포함되며 신생혈관을 연구하려면 내피 세포와 주위 세포가 필요합니다 25,26,27,28,29. 힘줄 섬유아세포는 힘줄 복구에 필수적일 뿐만 아니라 증식 및 이동 세포로서 힘줄 질환에서 관찰되는 국소 과세포성(local hypercellularity)의 부분적인 원인이기도 하다 30,31,32,33,34,35,36.

상주 세포 집단의 변화 외에도 힘줄 기질 구성은 힘줄 질환 및 부상에서도 변경됩니다 7,37,38,39,40. 올바른 질병 관련 미세환경 단서를 제시하기 위해 모델 시스템은 예를 들어 콜라겐-1, 콜라겐-3 및 세포 피브로넥틴⁴¹의 관련 비례 조합을 가능하게 하여 표적 질병 또는 손상 단계와 일치하는 세포외 기질 조성을 통합할 수 있어야 합니다.

건강한 힘줄이 힘줄 코어와 외적 구획(즉, 엔도테논, 에피테논 및 파라테논)으로 구획화되는 것은 그 기능의 중심이며 병들거나 손상된 힘줄에서 종종 방해를 받습니다 1,42,43,44,45,46,47 . 따라서 3D 힘줄 구획화를 힘줄 모델 시스템에 통합하는 것은 탈구획화 및 재구획화의 기초가 되는 과정을 보다 면밀하게 시뮬레이션하는 데 필요할 뿐만 아니라 사이토카인 및 영양소^48,49의 정확한 시공간 구배를 설정하는 데 도움이 됩니다.

마지막으로, 모듈화는 모델 시스템의 또 다른 핵심 자산으로, 연구자들은 조사 프로세스 ^8,17 동안 앞서 설명한 스트레스 요인의 정확한 상대적 기여와 상호 작용을 결합할 수 있습니다.

최적의 입력 방식을 선택하는 것 외에도 중요한 단계는 결과 출력의 변화를 측정, 관찰 및 추적할 수 있는 능력입니다. 모델 시스템의 기계적 특성(즉, 발가락 영역 길이, 선형 탄성 계수, 최대 인장 변형률, 최대 인장 응력, 피로 강도 및 응력 완화)은 힘줄의 주요 기능(^50,51,52)을 특징짓기 때문에 여기에서 핵심입니다. 이러한 기능적 변화를 조직 수준의 변화와 연결시키려면 (콜라겐) 구조적 매트릭스 손상을 검출하고 질병 및 복구 관련 세포 집단 30,53,54,55,56,57,58,59,60의 증식 및 모집을 추적하는 방법을 활성화하는 것이 중요합니다.

새로운 세포-세포 및 세포-기질 누화를 연구하려면 정량화를 위해 적절한 양의 단백질을 분리하거나 표시할 수 있어야 합니다(예: ELISA, 단백질체학, 면역조직화학, 유세포 분석)14,21,61,62. 집단 또는 적어도 구획 특이적 유전자 발현 분석도 가능해야 합니다(즉, 형광 활성화 세포 분류[FACS], 단일 세포/벌크 RNA- 염기서열 분석 및 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR))21,24,27,63. 모델 시스템은 동일한 시편과 여러 시편에서 앞서 언급한 출력 파라미터를 고처리량 연구를 수행할 수 있을 만큼 충분히 빠른 방식으로 측정할 수 있어야 합니다.

현재 인간의 힘줄 질환 및 부상 회복을 연구하는 데 사용할 수 있는 모델 시스템 중 인체 자체가 가장 대표적인 시스템입니다. 또한 실험적 개입과 가장 호환되지 않습니다. 급성 힘줄 손상 환자는 임상 연구가 풍부하지만, 초기 건병증(가장 흔한 힘줄 질환)이 있는 환자는 대체로 증상이 없으며 더 심각한 변화가 나타날 때까지 임상적으로 발견되지 않는 경우가 많습니다 14,64,65. 이것은 힘줄 항상성이 탈선하는 결정적인 순간과 이 탈선의 배후에 있는 메커니즘을 정확히 지적하기 어렵게 만든다 16,66,67,68,69. 또한 건강한 힘줄에서 생검을 추출하는 것은 지속적인 손상을 초래할 수 있기 때문에 윤리적으로 어려운 일입니다. 전방십자인대 재건술로 인한 햄스트링 힘줄 잔여물은 건강한 대조군으로 자주 사용되지만, 힘줄 질환 및 부상에 의해 일반적으로 영향을 받는 회전근개, 아킬레스건, 슬개건에 비해 기능, 기계적 특성, 세포 집단 및 기질 구성이 다르다^70,71,72,73.

생체 내 동물 모델은 더 접근하기 쉽고 다루기 쉽지만 그 사용은 동물에게 상당한 윤리적 부담을 지우고 연구자에게 경제적 비용을 부과합니다. 또한, 대부분의 인기 있는 모델 동물은 자연적으로 건병증성 병변이 발생하지 않거나(즉, 쥐, 생쥐, 토끼) 관련된 다세포 통신 경로를 추적하는 데 필요한 프라이머 및 유전자 변형 균주가 부족합니다(즉, 말, 토끼).

간단한 2D in vitro 모델 시스템은 복잡성/다루기 쉬운 스펙트럼의 반대편에 있으며 보다 제어 가능한 트리거 세트에 대한 반응으로 특정 세포 간 통신 경로에 대한 제어되고 시간 효율적인 연구를 더 잘 가능하게 합니다 ^8,74. 그러나 이러한 단순화된 시스템은 일반적으로 힘줄 기능의 핵심인 다차원 기계적 하중(즉, 인장, 압축 및 전단)을 재현하지 못합니다. 또한, 조직 배양 플라스틱의 (너무) 높은 강성은 질병 관심 상태를 모방하기 위한 코팅에 의해 제공되는 모든 매트릭스 큐를 무시하는 경향이 있다^75,76.

이러한 단점을 극복하기 위해, 점점 더 정교해지는 조직-공학적 3D 모델 시스템들이 개발되어, 그 조성이 적어도 부분적으로 원하는 질병 상태^(77,78,79)와 일치할 수 있는 로딩 가능한 매트릭스를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 시스템들은 복잡한 생체 내 세포외 기질 조성물 및 세포 로딩 패턴을 정확하게 복제하는 데 어려움을 겪을 뿐만 아니라, 일반적으로 힘줄 질환 및 부상 복구를 조정하는 교차 구획 통신 경로를 연구하는 데 필요한 장기간의 로딩성 및 구획 인터페이스가 부족합니다 48,49,80.

체외 힘줄 이식 모델 시스템은 세포 주위 틈새, 교차 구획 장벽 및 시공간 사이토카인/영양 구배로 구성되고 늘어났을 때 복잡한 로딩 패턴을 재현하는 내장 생체 유사 매트릭스 구성의 뚜렷한 이점을 가지고 있습니다⁸. 크기에 따른 영양소 확산 제한의 결과로, 더 큰 동물 모델(즉, 말)로부터의 이식은 힘줄 질환 및 부상 복구에 대한 장기 연구를 위해 살아 있는 상태로 유지하기가 어렵다 81,82,83. 한편, 쥐 종의 작은 외식물(예: 아킬레스건, 슬개건)은 재현성 있게 클램핑하고 기계적으로 하중을 가하기가 어렵습니다. 또한 크기가 크기 때문에 세포, 단백질 및 유전자 수준 판독을 위해 수집할 수 있는 물질의 양이 제한되며, 샘플을 풀링하거나 처리량을 줄이지 않습니다. 이러한 의미에서 쥐꼬리 힘줄 근막은 단일 마우스에서 대량으로 쉽게 구할 수 있기 때문에 힘줄 질환 및 부상 복구에 대한 고처리량 연구를 가능하게 하고, 복잡한 생체 내 세포 주위 기질 구성을 보존하고, 세포 로딩 패턴을 재현할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나 추출 과정에서 그들은 외적 구획의 대부분을 잃고 그 안에는 현재 힘줄 질환을 유발하고 ^8,18을 복구하는 것으로 간주되는 혈관, 면역 및 섬유 아세포 집단이 포함되어 있습니다.

이러한 간극을 메우기 위해 쥐꼬리 힘줄 유래 코어 외식의 장점과 3D 하이드로겔 기반 모델 시스템의 장점을 결합한 모델 시스템이 개발되었습니다. 이 모델 시스템은 꼬리 힘줄 외엽 주위의 세포가 함유된(콜라겐-1) 하이드로겔(^84,85)로 구성됩니다. 이 논문에서는 내피 세포가 함유된 1형 콜라겐 하이드로겔(외인성 구획) 내에서 핵심 외식(내장 구획)을 공동 배양하여 얻을 수 있는 유용한 판독값과 함께 필요한 제조 단계를 자세히 제공합니다.

Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 담당 당국(취리히 주 면허 번호 ZH104-18 및 ZH058-21)의 승인을 받았습니다. 그림 1에 개요가 나와 있습니다. 1. 12-15주 된 마우스(즉, B6/J-Rj)에서 힘줄 조립체 성분의 분리 CO2 가스 유도 질식을 통해 마우스를 안락사시킨다. 수율을 최대화하기 위해서는 한 번에 3마리 이상의 마우스를 처리하지 말고 안락사 직후 세포 분리를 진행하십시오. 기흉의 양측 유도에 의한 사망을 보장합니다. 마우스 피부를 80% 에탄올로 멸균하고 마우스를 멸균된 생물 안전 후드로 옮깁니다. 꼬리 힘줄 코어 외식을 분리합니다.메스(21번)를 사용하여 꼬리를 바닥에서 잘라 쥐에서 꼬리를 분리합니다. 꼬리 끝에서 시작하여 핀셋으로 잡고 흔들어 피부를 찢습니다. 그런 다음 핀셋을 꼬리에서 부드럽게 당겨 힘줄 코어 외피가 노출되도록 합니다. 힘줄 코어 외엽을 표준 배양 배지(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 1% 비필수 아미노산)에 넣고 새 메스 칼날(21번)을 사용하여 당겨진 꼬리 부분에서 분리합니다. 1.4.2단계를 반복합니다. 및 1.4.3. 꼬리 전체가 처리되고 힘줄 외피가 25mm 미만이 될 때까지. 새 메스 칼날(25번)을 사용하여 격리된 코어 외엽을 21mm 길이의 조각으로 자릅니다. 부착 가능한 디지털 C-마운트 카메라를 통해 이미지 분석 소프트웨어에 연결된 광학 현미경으로 코어 외형물의 평균 직경을 측정합니다.포인트 앤 클릭을 사용하여 오른쪽에 있는 선 측정 도구를 선택합니다. 세 개의 다른 위치에서 외식 직경을 측정하고 평균 직경을 계산합니다. 나중에 클램핑 및 기계적 테스트를 용이하게 하려면 평균 직경이 100μm보다 큰 코어 외식만 진행하십시오. 표준 배양 조건(37°C, 20%O2, 혈청 보충)에 대한 노출과 결합된 언로딩은 분리 후 6시간 이내에 유전자 발현을 변화시키고 7일 이내에 분해를 초래한다21. 준항상성 상태로 시작하려면 힘줄 아셈블로이드를 생성하고 힘줄 코어 분리 직후에 실험을 시작합니다. 실험 설정에 따라 활력이 제거된 힘줄 코어 외식이 대조군으로 필요합니다. 힘줄 코어 외피에 활력을 불어넣으려면 핀셋을 사용하여 액체 질소로 채워진 작은 용기에 5초 동안 얼린 다음 실온(RT)에서 5초 동안 해동합니다. 이 동결-해동 주기를 3회 반복하고 4단계(“코어 외식을 클램핑”)를 진행합니다.주의 : 액체 질소는 냉간 화상, 질식을 유발할 수 있으며 많은 일반 재료를 부서지게 할 수 있습니다. 저온 액체용으로 설계된 용기만 사용하고 보호복(예: 안면 보호대, 적절한 장갑, 앞이 막힌 신발)을 착용하십시오. 힘줄 섬유아세포를 분리합니다.메스(21번)를 사용하여 쥐의 발 중앙을 가로로 절개합니다. 뒷다리 옆을 따라 발에 수직으로 이 절개 부위의 양쪽 끝에서 엉덩이까지 두 번 자릅니다. 핀셋을 사용하여 잘라낸 피부 플랩을 발에 고정하고 종아리 근육을 덮고 있는 피부를 벗겨냅니다. 동일한 마우스에서 내피 세포를 분리할 때는 대신 모든 피부를 제거하십시오. 새로운 메스 칼날(21번)로 종골에서 아킬레스건을 분리합니다. 아킬레스건의 느슨한 끝을 핀셋으로 고정하고 다른 쪽 끝을 비복근에서 분리합니다. PBS에서 아킬레스건을 한 번 씻고 메스(21번)를 사용하여 흰색 힘줄 조직만 남을 때까지 남아 있는 근육 조직을 모두 제거합니다. 내피 세포가 동일한 마우스에서 분리된 경우 아킬레스건을 PBS에 두고 1.6단계를 계속합니다. 첫. 한 마리의 아킬레스건을 10mL의 힘줄 분해 배지(DMEM/F12 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 2mg/mL 콜라겐분해효소 1)가 들어 있는 15mL 플라스틱 튜브에 모으고 15rpm의 저속 궤도 셰이커를 사용하여 37°C에서 6-8시간 동안 천천히 일정하게 교반합니다. 상온에서 5분 동안 500 x g 에서 분해된 힘줄 용액을 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 표준 배양 배지 8mL(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 1% 비필수 아미노산)에 재현탁시키고, 배지 교체 없이 표준 배양 조건(37°C, 20%O2)에서 7일 동안 T25 배양 플라스크에서 배양합니다. 그런 다음 일주일에 한 번 미디어를 교체하십시오. 80% 밀도로 세포를 T150 배양 플라스크(1:6)로 분할합니다. 2개의 1.5mL 극저온 튜브에 분배된 멸균 여과된 동결 배지(70% DMEM/F12 + 20% FBS + 10% DMSO)의 2mL 통로에서 세포를 동결하고 추가 사용이 있을 때까지 -80°C에서 유지합니다. 트립신을 사용하여 조직 배양 플라스틱에서 세포를 제거합니다. 근육 유래 내피 세포를 분리합니다.힘줄 섬유아세포가 동일한 마우스에서 분리되지 않은 경우 1.5.1 및 1.5.2 단계부터 시작합니다. 가위를 사용하여 고관절을 절단하여 뒷다리를 몸에서 분리합니다. 뒷다리를 차가운 PBS(~ 4°C)에서 한 번 씻고 메스(21번)로 근육(대퇴사두근, 장신근, 가자미, 비복근)을 제거하고 근육을 얼음 위의 페트리 접시에 담습니다. 새 메스 칼날(21번)을 사용하여 페트리 접시를 얼음 위에 유지하면서 근육 조직을1mm3 보다 작은 조각으로 다집니다. 양쪽 뒷다리의 다진 근육 조직을 12.5mL의 근육 소화 배지(PBS + 2mg/mL 콜라겐분해효소 IV + 2mg/mL dispase II + 2mM CaCl2)가 들어 있는 50mL 플라스틱 튜브에 모읍니다. 플라스틱 튜브를 37°C 수조에 10분 동안 넣습니다. 용액을 세게 흔들고 10분 더 다시 놓습니다. 용액이 균질한 것처럼 보이고 힘줄과 근막의 (흰색) 조각만 남을 때까지 반복합니다(약 4 x 10분). 한편, 힘줄 섬유아세포 분리 또는 대식세포 분리를 계속합니다. 12.5mL의 콜드 PBS + 10% FBS를 플라스틱 튜브에 넣어 소화를 멈춥니다. 50mL 피펫이 장착된 배터리 구동식 피펫 홀더를 사용하여 플라스틱 튜브에서 현탁액을 흡입합니다. 플라스틱 튜브에 400μm 셀 스트레이너를 장착하고 서스펜션을 필터링하여 이물질을 제거합니다. 100μm 셀 스트레이너로 이 과정을 반복합니다. 여과된 현탁액을 400 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 10mL의 차가운 PBS + 10% FBS에 재현탁하고 다시 원심분리합니다. 집단 선택을 위해 퓨로마이신(4mg/mL)을 보충한 8mL의 내피 배양 배지(DMEM/F12 및 엔도판 3 키트의 1:1 혼합물 + 10U/mL 헤파린 + 20% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 30mg/mL 내피 성장 보충제)에 재현탁합니다. 한 마우스의 세포를 이전에 멸균된 0.2% 젤라틴 용액 2mL로 37°C에서 2시간 동안 코팅한 하나의 T25 배양 플라스크에 시드한 다음 여분의 용액을 제거한 후 RT에서 밤새 건조시켰습니다. 격리 전날 플라스크를 준비합니다. 표준 배양 조건(37°C, 20%O2)에서 24시간 후, 퓨로마이신 보충 배지를 제거하고, 부착된 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 8mL의 내피 배양 배지에서 배양한다. 젤라틴 코팅 플라스크에 80% 밀도로 세포를 1:5로 통과시키고 P2까지 실험에 사용합니다. 트립신(Table of Materials) 이외의 세포 분리 용액을 사용하여 조직 배양 플라스틱에서 세포를 제거하고 동결하지 마십시오. 골수 유래 대식세포를 분리합니다.힘줄 섬유아세포 또는 내피세포가 동일한 마우스에서 분리되지 않은 경우 먼저 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 및 1.6.3단계를 수행합니다. 피부, 힘줄, 근육 조직을 제거한 후 남은 뼈(대퇴골 및 경골)를 차가운 PBS(~4°C)에서 한 번 세척합니다. 뼈를 신선하고 차가운 PBS(~4°C)에 넣고 메스(21번)를 사용하여 골수가 노출될 때까지 골단을 점차적으로 잘라냅니다. 뼈의 양쪽에 빨간색 점으로 나타납니다. 주사기에 0.4mm x 25mm(G27) 주사 바늘을 장착하고 10mL의 대식세포 배양 배지(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 1% 비필수 아미노산)를 채웁니다. 50mL의 플라스틱 튜브에 뼈를 하나씩 담아 노출된 골수에 1mm 정도 깊이로 주사 바늘을 삽입하고 주사기를 비워 골수를 씻어냅니다. 씻겨 나간 골수는 배지에 매달려 있을 때 붉은 관과 같은 구조로 나타납니다. 1mL 피펫 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 골수를 녹입니다. 50mL 피펫이 장착된 배터리 구동식 피펫 홀더를 사용하여 100μm 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 50mL 플라스틱 튜브로 다시 여과하고 RT에서 5분 동안 350 x g 으로 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 10mL 적혈구(RBC) 용해 완충액에 재현탁시킨 다음 실온에서 350 x g에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 펠릿을 5mL의 대식세포 배양 배지(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 1% 비필수 아미노산)에 재현탁시키고 직경 100mm(접시당 5-8 x 106 세포)의 처리되지 않은 페트리 접시에 파종합니다. 4시간 후 40ng/mL 대식세포 집락 자극 인자(m-CSF)가 보충된 대식세포 배양 배지 5mL를 m-CSF(1:1 혼합물)가 없는 세포 배양 배지에 추가하여 최종 농도 20ng/mL m-CSF를 만듭니다. 6일 후 세포를 실험에 사용하거나 추가 사용이 있을 때까지 동결합니다. 트립신(Table of Materials) 이외의 세포 분리 용액을 사용하여 조직 배양 플라스틱에서 세포를 제거합니다.참고: 분리되면 셀은 더 이상 확장되지 않습니다. 여기에 설명된 세포 분리 방법은 표시된 연령 범위를 벗어난 마우스 및 랫트에도 적용됩니다. 유세포 분석으로 분리된 세포 집단의 표현형을 확인하려면 6.3.4단계를 계속합니다. 2. Wistar 또는 Sprague-Dawley 쥐로부터 콜라겐 분리 다른 곳에서 자세히 설명된 격리 프로토콜86을 따르십시오. 그것은 또한 훨씬 낮은 수율로 쥐와 함께 작동합니다. 하이드록시프롤린 분석으로 생성된 용액의 농도를 결정하고, SDS-page로 순도를 평가하고, 실험에서 사용할 때까지 용액을 4°C에 보관합니다. 3. 배양 시스템 구성 요소 생산 클램프 홀더, 마운팅 스테이션 및 챔버 몰드를 3D 프린팅합니다.첨부된 .stl 로드file (보충 File 1) 클램프 홀더, 마운팅 스테이션 및 챔버 몰드를 슬라이싱 소프트웨어에 넣습니다. 필요에 따라 객체 번호를 조정하려면 포인트 앤 클릭을 사용하여 객체를 선택하고 복사하여 붙여넣어 곱합니다. G 코드 내보내기(Ctrl-R)를 눌러 G 코드를 생성한 다음 내보냅니다(Ctrl-G). G 코드를 3D 프린터에로드합니다. 인쇄 공정에는 착색되지 않은 생체 적합성 필라멘트(예: 폴리락트산)를 사용하십시오. 나사산 절단기를 사용하여 나사를 운반할 클램프 홀더의 구멍에 3mm 나사산을 자릅니다(보충 파일 2 및 보충 File 3, 구멍 1 및 3). 스테인리스 스틸 맞춤 핀을 클램프 홀더 뒷면의 구멍에 넣습니다(보충 파일 2 및 보충 파일 3, 구멍 4). CL을 소독하십시오.amp 사용하기 전에 최소 1시간 동안 UV 광선으로 홀더와 장착 스테이션을 사용하십시오. 3D 프린팅 클램프 홀더를 재사용하지 마십시오. 또는 첨부된 계획(보충 파일 2, 보충 파일 3 및 보충 파일 4)을 사용하여 폴리에테르이미드로 클램프 홀더와 장착 스테이션을 생산하면 비용이 더 많이 들지만 더 나은 멸균 방법(예: 오토클레이브)과 반복 사용이 가능합니다. 3D 프린팅된 금형을 사용하여 챔버를 주조합니다.챔버 몰드를 실리콘으로 채웁니다. 진공 챔버(90mbar)에서 30분 동안 실리콘의 가스를 제거합니다. 용액을 금형에 사용된 필라멘트의 내열성에 따라 상온에서 밤새 또는 70°C의 열판에서 1시간 동안 중합합니다. 금형에서 중합 챔버를 조심스럽게 제거하고 메스(21번)로 불필요한 실리콘을 잘라냅니다. 선택 사항: 조립체와 주변 챔버를 기계적으로 로드해야 하는 경우 스테인리스 스틸로 만든 속이 빈 튜브로 실리콘 챔버의 구멍을 보강합니다. 첨부된 도면을 사용하여 스테인리스 스틸에서 금속 클램프를 가공합니다(보충 파일 5). 매번 사용하기 전에 스테인리스 스틸 cl을 세척하십시오.amps, 폴리에테르이미드 clamp 홀더, 나사 및 실리콘 챔버.80 % 에탄올 (EtOH)과 20 % 역삼투압 물 (ROW)에서 10 분 동안 초음파 처리합니다. 50% EtOH와 50% 이소프로판올에서 10분 동안 초음파 처리합니다. ROW로 3번 헹굽니다. 0.5% 알칼리성 세척 농축액(즉, 600mL의 ROW에서 3mL)에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 0.5 % 알칼리성 세척 농축액에서 10 분 동안 초음파 처리합니다. 0.5% 알칼리성 세척 농축액을 넣고 1시간 50분 동안 흔들어 줍니다. ROW로 3번 헹굽니다. ROW에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 구성 요소를 자연 건조하고 오토클레이브합니다. 4. 코어 외피 클램핑 일치하는 cl 배치amp 하나의 금속 cl과 함께 홀더amp 각각 장착 스테이션에. 금속 cl 위에 젖은 고압멸균 종이 조각(4mm x 25mm)을 놓습니다.amps를 누른 다음 메스(21번)로 클램프의 내부 경계를 따라 종이를 자릅니다. 다른 종이 조각에서 더 작은 종이 조각(2개)(4mm x 1.5mm)을 잘라내고 젖은 상태로 유지합니다. 뾰족한 핀셋을 사용하여 금속 cl 사이의 종이에 8개의 코어 이식을 놓습니다.amps 끝점이 금속 cl에 있습니다.amps. 준비된 작은 종이 조각(4mm x 1.5mm)으로 코어 외식의 끝점을 덮은 다음 그 위에 금속 클램프를 놓습니다. 드라이버와 작은 나사(M3 x 6mm)를 사용하여 금속 cl 사이에 코어 이식을 고정합니다.amps와 clamp 홀더. 클램핑된 코어 이식물을 실리콘 배양 챔버로 조심스럽게 옮기고 이 챔버를 2mL의 표준 세포 배양 배지(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 1% 비필수 아미노산)로 채웁니다. 선택 사항: 조립/주변 챔버를 기계적으로 로드해야 하는 경우 구멍 3(보충 파일 및 보충 파일 3, 구멍 3)에 추가 나사(M16 x 3mm)로 고정합니다. 5. 콜라겐 하이드로겔 준비 및 주조 세포 분리 용액으로 조직 배양 플라스틱에서 표적 세포를 제거하고, 상온에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하고, 표준 배양 배지 1mL에 재현탁시킵니다. 하나의 아셈블로이드의 경우 10μL PBS(20x), 1M NaOH 1.28μL(125x), 8.72μL의 이중 증류수(ddH2O, 23x), 80μL의 콜라겐-1(2.5x 또는 1.6mg/mL final) 및 100μL(2x)의 표준 배양 배지(코어 // cell-free assembloid용) 또는 세포 현탁액이 필요합니다. 이러한 구성 요소를 두 개의 별도 용액으로 준비하고 주조 직전에만 혼합하십시오.가교 용액: PBS, NaOH, ddH20 및 최대 12개의 아셈블로이드(+10% 안전 마진)의 세포 현탁액을 가교 용액에 풀링하고 얼음 위의 15mL 플라스틱 튜브에 보관합니다. 두 용액을 혼합한 후 250,000 cells/mL 힘줄 섬유아세포, 500,000 cells/mL 근육 유래 내피 세포 또는 370,000 cells/mL 골수 유래 대식세포의 최종 농도를 얻기 위해 세포 현탁액의 농도를 조정합니다. 콜라겐-1 용액: 최대 12개의 아셈블로이드(+10% 안전 마진)에 필요한 콜라겐-1 용액을 다른 15mL 플라스틱 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 가교 용액과 콜라겐-1 용액이 얼음 위에서 준비되면 클램핑된 코어 외식이 들어 있는 배양 챔버에서 세포 배양 배지를 흡인합니다. 1000μL 피펫으로 가교 용액에 콜라겐-1 용액을 넣고 기포를 생성하지 않고 빠르게 위아래로 피펫팅하여 두 용액을 혼합합니다. 개별 힘줄 코어 외엽을 200μL의 혼합 용액으로 피펫팅하여 실리콘 챔버에서 제공하는 홈으로 덮습니다. 하이드로겔을 37°C에서 50분 동안 중합시킵니다. 실리콘 배양 챔버를 챔버 모서리에 피펫팅하여 각 공동 배양 배지 1.5mL를 조심스럽게 채웁니다.코어 // 섬유아세포 공동 배양의 경우 DMEM/F12, 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 암포테리신, 200μM L-아스코르브산, 20ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자를 채웁니다. 코어 // 대식세포 공동 배양의 경우 DMEM/F12, 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 암포테리신, 200μM L-아스코르브산, 20ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자를 채웁니다. 코어 // 내피 세포 공동 배양의 경우 DMEM/F12와 엔도판 3 키트의 1:1 혼합물 + 10U/mL 헤파린 + 20% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 암포테리신 + 30mg/mL 내피 성장 보충제를 채웁니다. 가설에 적합한 배양 조건의 집합체를 배양합니다. 예를 들어, 병변과 같은 틈새 환경을 모방하려면 37°C 및 20%O2에서 배양합니다. 배양 배지를 1주일에 두 번 교체합니다. 감염을 예방하려면 챔버를 인큐베이터에 넣기 전에 큰 페트리 접시 또는 멸균 상자에 넣으십시오.참고: 문화권 시간은 가설과 공동 문화권 설정에 따라 달라집니다. 예를 들어, 병변과 같은 틈새 환경의 코어 // 섬유아세포 아세포는 약 3주 후에 기계적으로 불안정해집니다. 6. 사용 가능한 판독 방법 생존도 및 형태 분석을 포함한 형광 현미경 검사를 수행합니다.일반적으로 어셈블로이드는 전체 마운트로 이미지화할 수 있습니다. 이렇게 하려면 클램프에 가까운 가위로 절단하여 클램프에서 어셈블리를 제거하고 12웰 플레이트로 옮깁니다. PBS로 assembloids를 한 번 씻으십시오. 생존도 분석이 수행되면 어두운 곳에서 37°C에서 20분 동안 PBS(EthD-1)에서 100μL의 4 x 10−6M ethidium homodimer로 각 조립체를 염색합니다. PBS로 아셈블로이드를 3배 세척한 다음 RT에서 각각 500μL의 4% 포름알데히드로 20분 동안 고정합니다.주의: 4% 포름알데히드는 알레르기, 발암성 및 돌연변이 유발 효과가 있으며 생식에 독성이 있으며 발달 독성(생식 독성) 또는 장기 손상을 유발할 수 있습니다. 보호복과 장갑, 보안경, 마스크 또는 기타 호흡 보호구를 착용하십시오. PBS로 아셈블로이드를 3번 세척하고 선택한 염색 프로토콜을 계속합니다. 염색의 선택은 이전에84,85에서 설명되었습니다.참고: 콜라겐 자가형광(약 480nm)에 가까운 방출 파장을 가진 형광단을 사용하는 염색은 피하십시오. 제조업체의 지침에 따라 RT-qPCR 또는 게놈 전체 RNA 염기서열 분석을 위해 구획 특이적 RNA 분리를 수행합니다.클램프에서 어셈블리를 가위로 제거합니다. 선택 사항: 핀셋을 사용하여 외인성 하이드로겔 구획에서 코어 외식을 분리합니다. 충분한 양의 RNA를 분리하기 위해 20-24개의 20mm 코어 외엽물 또는 2개의 세포가 함유된 콜라겐 하이드로겔을 풀링합니다. 1mL의 저온 트리졸 및 기계적 파괴(즉, 금속 비드 또는 극저온 분쇄)를 사용하여 풀링된 코어 외피 또는 풀링된 콜라겐 하이드로겔의 세포외 기질을 파괴합니다.주의 : 경구, 피부 및 흡입 독성. 피부와 눈에 자극을 일으킴. 장갑을 끼고 화학 안전 캐비닛에서만 다루십시오. 이전에 설명한 대로 또는 제조업체의 지침84,85에 설명된 대로 표준 RNA 추출 키트를 사용하여 세포 용해물에서 RNA 분리를 계속합니다. 구획 특이적 유세포 분석.클램프에서 어셈블리를 가위로 제거합니다. 선택 사항: 핀셋을 사용하여 외인성 하이드로겔 구획에서 코어 외식을 분리합니다. 일정한 교반 하에 37°C에서 4시간 동안 콜라겐분해효소 I(3mg/mL) 및 디스파제 II(4mg/mL)와 함께 PBS 1mL의 구획을 분해합니다. 분해된 용액을 500 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 선택한 형광단 접합 항체를 포함하는 100μL의 FACS 완충액(PBS의 1% FBS)에 펠릿을 재현탁시킵니다. 작용하는 형광단 접합 항체의 선택은 이전에84,85로 설명되었다. 상온에서 30분 동안 염색 용액을 배양합니다. 염색 용액을 1.4mL의 FACS 완충액으로 희석하고 RT에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 350μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 100μm 나일론 메쉬 스트레이너 캡을 통해 용액을 여과한 후 제조업체의 지침에 따라 선택한 유세포 분석기로 분석합니다. 상층액을 분석합니다.상층액 수집 3일 전에 공동 배양 배지를 무혈청 공동 배양 배지로 교체합니다. 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 중간 규모 발견(MSD) 분석 키트를 사용하여 농축된 희석되지 않은 상층액의 즉각적이고 지연된 분석을 수행합니다. 지연된 분석의 경우 상층액을 -80°C의 1.5mL 플라스틱 튜브에 보관합니다. 조립체의 기계적 특성을 평가합니다.맞춤형 스트레칭 장치를 사용하여 기계적 힘을 가하고 기계적 특성을 측정합니다22. 스테인리스 스틸 맞춤 핀과 스테인리스 스틸 나사를 사용하면 클램프를 다른 스트레칭 장치에도 부착할 수 있습니다. 어셈블로이드의 기계적 특성은 주로 내장된 코어 익스플랜트( 18)의 기계적 특성에 의해 결정되므로, 코어 익스플랜트를 하이드로겔에 매립하기 전에 코어 익스플랜트의 기계적 특성을 측정하여 측정 공정에서 갓 주조된 하이드로겔을 파괴할 위험을 줄여야 합니다.

Representative Results

부품 분리(그림 1 및 그림 2)조립체 공동 배양에서 핵심 외식과 세포 집단을 활용하기 전에 이러한 구성 요소를 현미경으로 확인해야 합니다(그림 1). 코어 외식은 직경이 균일해야 하며(100-200μm) 눈에 띄는 꼬임이나 주름이 없어야 합니다. 내피 세포는 다른 세포와 접촉할 때 길쭉한 모양을 나타내야 하며, 분리로 인한 초기 수율이 낮기 때문에 너무 낮은 밀도로 파종할 때는 그렇지 않습니다. 이 경우 내피 세포는 세포골격 확장으로 더 둥근 모양을 취하고 증식이 현저하게 느립니다. 7-10일 후에 1:5로 나눕니다. 아킬레스건에서 분리된 힘줄 섬유아세포는 1:6으로 쪼개졌을 때 1-2 통로(각각 10-14일) 내에 인간의 섬유아세포에 비해 더 둥근 형태를 취합니다. 대식세포는 섬유아세포나 내피세포보다 훨씬 작으며 분리 후 증식하지 않습니다. 배치에 따라 모양이 피라미드에서 원형까지 다양할 수 있습니다. 세포 성분의 표현형은 유세포 분석으로 검증하였다. 접합 CD31 항체를 내피 세포의 마커로 사용했습니다(그림 2A). 염색되지 않은 대조군 샘플(회색)을 기반으로 형광 임계값을 설정한 결과, 통로 1(P1)의 90.1%와 통로 2(P2) 내피 세포의 48.7%가 CD31 양성으로 확인되었습니다. 힘줄 섬유아세포를 특성화하기 위해 녹색 형광 단백질(ScxGFP) 및 복합 CD146 항체와 함께 힘줄 섬유아세포 마커 Scleraxis를 함께 발현하는 유전자 변형 마우스 라인을 사용했습니다(그림 2B)35,60. 1회 통과(P1) 후, 섬유아세포의 37.3%는 ScxGFP+CD146-, 0.2%는 ScxGFP+CD146+, 4.3%는 ScxGFP-CD146+, 58%는 ScxGFP-CD146-이었다. 두 번의 통과(P2) 후, ScxGFP+CD146- 세포의 비율은 27.6%로 감소하고, ScxGFP+CD146+ 세포의 비율은 6.9%로, ScxGFP-CD146+ 세포의 비율은 10.6%로 증가하고, ScxGFP-CD146- 세포의 비율은 54.9%로 감소하였다. 대식세포를 식별하고 특성화하기 위해 F4/80 항체를 CD86 및 CD206 항체와 함께 사용했습니다(그림 2C). 분리 및 배양 후 골수 유래 세포의 96.4%가 F4/80 양성이었습니다. 이들 F4/80 양성 세포 중 8.6%는 CD206+CD86-, 23.6%는 CD206+CD86+, 28.3%는 CD206-CD86+, 39.4%는 CD206-CD86-였다. 콜라겐 가교 속도는 배치마다 다를 수 있으며 실험을 시작하기 전에 테스트해야 합니다. 조립체 모양(그림 3)병변 유사 배양 조건(36°C, 20%O2)에서, 코어 외식은 기계적으로 신축성 있는 상태를 유지하고, 외관이 변하지 않았으며, 적어도 21일 동안 육안으로 구별할 수 있고 주변 하이드로겔과 물리적으로 분리할 수 있었습니다(그림 3A,B). 주변 하이드로겔은 시간이 지남에 따라 압축되었으며, 압축 속도는 파종된 세포 집단에 따라 달라졌습니다. 아킬레스건 유래 섬유아세포는 주변 하이드로겔을 가장 빨리 수축시켰으며, 코어 외식구 주위에 하이드로겔을 던졌을 때 방사상으로, 그렇지 않을 때는 모든 방향으로 수축했습니다(그림 3B, C). 초기에는 코어 외식구 주변에 배치된 cell-free 하이드로겔도 압축되었습니다. 이 수축은 코어 외식에서 세포를 이동시켜 발생했을 가능성이 높으며, 이는 동적 교차 구획 인터페이스를 나타냅니다. 코어 외식이 내장되어 있지 않은 무세포 하이드로겔은 검출할 수 있을 정도로 압축되지 않았기 때문에 수분 손실로 인한 수축의 기여도는 무시할 수 있는 것으로 보입니다(그림 3B 및 보충 파일 6). 따라서 하이드로겔 압축이 부족하면 조립체 어셈블리의 실수(즉, 낮은 셀 농도)를 감지하는 데 사용할 수 있으며 더 비싼 판독 방법을 계속하기 전에 확인해야 합니다. 이 방법을 확립하는 동안 세포 농도를 감소시키는 일반적인 실수로는 상대적으로 가혹한 가교 용액(높은 pH, 저온)에 너무 오래 방치되어 외인성 하이드로겔에서 세포가 죽어가는 것과 중간 흡인과 하이드로겔 주입 사이의 시간이 너무 길거나 코어 외식이 콜라겐에 삽입되기에는 너무 높게 고정되어 건조되는 것이 있습니다. 컨포칼 형광 현미경: 생존도 및 형태 분석(그림 3)가위로 클램프에서 제거한 후(그림 3B), 아셈블로이드를 고정, 염색 및 단면 없이 컨포칼 현미경으로 전체적으로 이미징할 수 있습니다. 여기에서 코어 // 내피 세포, 코어 // 대식세포 및 코어 // 섬유아세포 아셈블로이드를 DAPI(NucBlue) 및 Ethidium Homodimer(EthD-1)로 염색하여 생존율을 분석하고 DAPI 및 F-actin을 염색하여 3D 콜라겐 하이드로겔에서 형태 및 세포 확산을 분석했습니다(그림 3D). 코어 // 내피 세포 assembloids의 생존력(그림 3E)은 정량화되었고, 코어 // 대식세포 및 코어 // 섬유아세포 assembloids84에 대해 이전에 보고된 것보다 일반적으로 assembloid 조립 후에 더 낮은 것으로 나타났다. 그러나, 생존력은 적어도 7일째까지 집합체 배양 동안 안정적으로 유지되었다. 기계적으로 유도된 미세 손상 및 기계적 특성 측정(그림 4)클램프 홀더에 부착된 나사와 핀을 사용하면 클램핑된 어셈블리를 단축 스트레칭 장치에 고정할 수 있습니다. 여기에 사용된 맞춤형 스트레칭 장치에는 10N 로드셀이 장착되어 있으며 이전 간행물(그림 4A)22에 설명되어 있습니다. 모든 샘플은 측정 전에 1% 변형률로 5번의 스트레치 사이클로 사전 컨디셔닝되었습니다. 코어 외측 또는 접합부의 전체 응력-변형률 곡선을 기록하면(그림 4B) 선형 탄성률(α), 최대 응력(β) 및 최대 변형률(у)을 정량화할 수 있습니다. 그러나 코어 explant 또는 assembloid를 돌이킬 수 없을 정도로 손상시켜 동일한 샘플에 대한 최대 응력(β)과 최대 변형률(у)의 종적 전개를 평가할 수 없습니다(그림 4B). 여기서, 선형 탄성 계수는 힘을 견디는 샘플의 능력에 대한 척도로서 사용되었는데, 이 측정은 샘플을 단지 2%의 변형률로 늘려야 하기 때문이며, 이는 선형 탄성 계수(18)의 영구적인 감소를 유발하지 않는 것으로 이전에 나타난 바 있다. 특히, 코어 // 내피 세포 아셈블로이드는 클램핑 절차에 2% 변형률(대략 선형 탄성 영역의 말단부) 또는 6% 변형률(대략 최대 변형률)에 노출되었습니다. 결과적인 미세 손상은 시술 전후에 선형 탄성 계수를 측정하여 평가되었습니다(그림 4C). 단일-배양된 코어 외식을 이용하여 이전에 수행된 실험에 따라, 코어 // 내피 세포 assembloids는 준 항상성 틈새 조건(29°C, 3%O2)에서 배양하고 2% 이하의 균주에 노출되었을 때 최소 14일 동안 선형 탄성률을 유지했습니다18,21. 기계적 기준선 자극과 관련하여, 클램프를 통해 가해지는 정적 스트레치는 일반적으로 매트릭스 언로딩(87)과 관련된 이화 과정을 방지하기 위해 생체내에서 힘줄 코어 유닛이 경험하는 본래의 변형 수준을 충분히 모방하는 것으로 보였다. 실제로, 6% 변형률에 노출된 코어 // 내피 세포 아셈블로이드에서 관찰된 선형 탄성 계수의 점진적이고 통계적으로 유의한 감소는 기계적으로 유도된 매트릭스 미세 손상으로 인한 매트릭스 언로딩에 기인할 수 있습니다. 이러한 실험을 수행할 때 어셈블로이드의 건조를 방지하는 것이 중요합니다. 여기서는 고압 멸균 및 습식 종이에 싸여 있었지만 사용 된 스트레칭 장치와의 호환성에 따라 다른 방법도 실행 가능할 수 있습니다. 금속 클램프와 코어 외측 사이의 마찰이 제한되어 있으므로 클램핑 중에 금속과 코어 외측 사이에 작은 종이 조각을 추가하여 미끄러짐을 방지하고 스트레칭 과정을 면밀히 모니터링하여 미끄러진 코어 외식구 및 접합부를 감지하고 배제합니다. 구획 특이적 전사체 및 아셈블로이드 특이적 분비체 분석(그림 5 및 그림 6)여기에 제시된 첫 번째 핵심 단일 배양 실험 세트에서 외식물 분리 후 핵심 유전자 발현의 안정성을 평가하여 실험 효과에서 분리를 분리했습니다(그림 5A). 정확한 결론을 위해서는 더 높은 반복 횟수가 필요하지만, 병변과 같은 틈새 조건(37°C, 20%O2)에서 배양할 때 외식 분리 후 몇 시간 이내에 갓 분리된 코어 외식에서 Vegfa 및 Mmps의 발현이 강하게 증가했습니다. 신생혈관 형성은 힘줄 질환 및 복구의 중심적인 특징이며, 부분적으로는 저산소증88 하에서 힘줄 코어에서 분비되는 혈관 생성 인자(즉, 혈관 내피 성장 인자, Vegfa)에 의해 활성화된 내피 세포에 의해 유발될 수 있다. 이 잠재적 누화의 첫 번째 단계(그림 5B)를 조사한 결과, Vegfa 및 저산소증 마커 탄산 무수물 효소 9(Ca9)의 발현은 높은 산소 장력(20%O2) 하에서 단일 배양된 식물과 달리 낮은 산소 장력(3%O2) 하에서 단일 배양된 외식물에서 통계적으로 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다). 한편, 낮은 산소 장력은 경막(Scx) 및 콜라겐-1(Col1a1)과 같은 힘줄 섬유아세포 마커의 발현에 변화를 일으키지 않는 것으로 보였다. 이러한 결과는 코어-상주 세포가 저산소 틈새에서 혈관 신생 유발 신호전달에 대한 그럴듯한 기여자로 확인됩니다. 다음으로, pro-angiogenic core signaling에 의한 내피 세포의 활성화는 높은(20%O2) 및 낮은(3%O2) 산소 장력 하에서 core// endothelial cell assembloid co-culture에서 평가하였다. 다행히도 아셈블로이드의 모듈식 조성은 외인성 콜라겐 하이드로겔에서 코어 외식을 물리적으로 분리하여 배양 후 구획 특이적 전사체 분석을 가능하게 합니다(그림 6A). 코어 엑스플랜트(그림 6D)에서 Vegfa 발현은 낮은 산소 장력 하에서 증가하는 것으로 다시 확인되었지만, Fgf2 와 같은 다른 저산소 마커에 대한 효과는 덜 명확하고 정확한 결론을 위해서는 더 높은 반복 횟수가 필요합니다. 또한, Tnf-α 와 같은 전염증성 마커 및 Mmp3 와 같은 세포외 기질 분해 마커의 발현이 낮은 산소 장력 하에서 코어에서 감소되었습니다. 초기에 내피 세포로 파종된 외인성 하이드로겔(그림 6E)에서 살아있는 코어 외식(aC)의 존재는 낮은 산소 장력에서는 Vegfa 발현을 감소시켰지만 높은 산소 장력에서는 감소시키지 않았습니다. 또한, 낮은 산소 장력 하에서 활력이 제거된(dC) 코어 익스플랜트의 존재는 Vegfa 발현을 감소시키지 않았습니다. 낮은 산소 장력 하에서 외인성 하이드로겔의 Tnf-α 발현은 aC/dC 주변에서 비슷했지만 살아있는 코어 외식재 주변의 높은 산소 장력 하에서 증가했습니다. Fgf2 발현은 높은 산소 장력 하에서 활력이 제거된 코어 외식관 주위에서 배양된 외인성 내피 세포가 함유된 하이드로겔과 비교하여 모든 조건에서 감소했지만 대부분은 낮은 산소 장력 하에서 감소했습니다. Mmp3 발현은 높은 산소 장력 하에서 살아있는 코어 외식에서 가장 높았고 낮은 산소 장력 하에서 활력이 제거된 코어 외식에서 가장 낮았습니다. 전반적으로, 공동 배양된 내피 세포는 누화와 산소 수준의 변화를 시작할 수 있는 활성 코어 이식 모두에 반응하는 것으로 보입니다. 보다 포괄적인 전사체 분석은 각각의 기여도를 쉽게 설명할 수 있습니다. 어셈블로이드 시스템의 모듈화는 형광 리포터 유전자를 포함하는 유전자 변형 세포의 통합을 가능하게 합니다. 여기에서, Pdgfb-iCreER mG 마우스(89 )로부터 분리한 내피세포를 하이드로겔 격실에 파종하였다. 이 세포는 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)과 함께 내피 세포 마커 혈소판 유래 성장 인자 소단위 b(Pdgfb)를 함께 발현하여 Pdgfb 발현 내피 세포를 현미경 검사에서 녹색으로 보이게 합니다(그림 6C). 이 방법을 사용하여, Pdgfb-발현 내피 세포의 존재는 배양(37°C)에서 7일 이상 유지되는 것으로 확인되었고, 산소 장력(20%O2 대 3%O2)과 무관한 것으로 나타났다. 아셈블로이드의 분비체를 분석하기 위해, 코어 // cell-free 및 core // 섬유아세포, core // 대식세포 또는 core // 내피세포 co-culture에 각각 사용된 배양 배지를 이제 분비체가 농축된 상층액을 흡인 및 동결하기 3일 전에 혈청이 없는 배양 배지로 교체했습니다(그림 6A). 이 농축 시간은 병변과 같은 틈새 조건에서 배양된 코어 외식물 및 코어 // 섬유아세포 아셈블로이드에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 MSD 분석으로 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 사이토카인을 검출하기에 충분했습니다(그림 6B). 핵심 외식과 어셈블로이드의 분비체와 전사체를 분석할 때 중요한 고려 사항은 적절한 대조군의 사용과 관련이 있습니다. 갓 분리한 코어 외식은 특히 Vegfa 및 Mmps 의 발현이 분리 후 몇 시간 내에 크게 증가하기 때문에 가치가 제한적입니다(그림 5A). 초기에 cell-free 하이드로겔로 둘러싸인 시간 일치 외식은 코어 구획 유전자 발현을 위한 대조군으로 더 적합합니다. 외인성 하이드로겔의 경우, 코어 외식성 없이 배양된 세포가 함유된 하이드로겔은 활력이 제거된 코어 외식구 주변에서 배양된 세포가 함유된 하이드로겔에 비해 대조군이 열등한데(보충 파일 7), 주로 세포 형태를 크게 변화시키는 길쭉한 하이드로겔 대신 둥근 모양으로 압축되기 때문입니다(그림 3A). 그림 1: 생체 내 누화를 모델링하기 위한 조립체 구성 요소 분리 및 조립. 힘줄 코어 외식은 쥐 꼬리에서 추출하여 자르고 고정했습니다. 마우스 다리 근육(즉, 대퇴사두근(QF), 비복근(G) 및 전경골(TA))을 절단하여 내피 세포를 분리한 다음 조직 배양 플라스틱에서 배양했습니다. 아킬레스건(AT)도 소화하여 힘줄 섬유아세포를 분리한 다음 조직 배양 플라스틱에서 배양했습니다. 경골과 대퇴골의 골수가 뼈 밖으로 씻겨 나왔습니다. 그런 다음, 분리된 단핵구를 조직 배양 플라스틱에서 배양하고 순진한 대식세포로 분화시켰다. 광학 현미경 이미지(10x)는 코어 외피, 내피 세포, 힘줄 섬유아세포 및 대식세포가 아셈블로이드에 통합되기 직전의 모습을 보여줍니다. 조립하는 동안, 플라스틱상에서 배양된 세포를 현탁액에 넣은 다음 콜라겐-1 용액(1.6mg/mL)에 파종시켰다. 그런 다음, 세포-하이드로겔 혼합물을 클램핑된 코어 외식물 주위에 주조하고 배양 배지를 첨가하기 전에 37°C에서 50분 동안 중합하였다. 배양 조건은 클램프(기계적 장력)와 인큐베이터 설정(산소 농도, 온도)을 통해 제어되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 세포 집합체 성분의 특성화. (A) 1개 통로(P1, 윗줄)와 2개 통로(P2, 하단 행) 후 근육 유래 내피 세포의 대표적인 유세포 분석. 염색되지 않은(회색) 및 CD31-염색된(녹색) 세포에 대한 개수는 모달로 정규화되었습니다. 백분율은 CD31 염색 그룹에 대해 제공됩니다. (B) 1개 통로(P1, 윗줄)와 2개 통로(P2, 하단 줄) 후 아킬레스건 유래 섬유아세포의 대표 유세포 분석. 축은 염색되지 않은 세포(회색)와 ScxGFP를 발현하고 CD146 항체로 염색된 세포(무지개색)의 형광 강도를 보고합니다. (C) 배양 후 골수 유래 대식세포의 대표적인 유세포 분석. 맨 윗줄에서 염색되지 않은(회색) 및 F4/80 염색된(녹색) 세포의 개수를 모달로 정규화했습니다. 백분율은 F4/80 염색 그룹에 대해 제공됩니다. 맨 아래 줄의 그래프는 염색되지 않은 세포(회색)와 CD206 항체 및 CD86 항체(무지개색)로 염색된 세포의 F4/80+ 하위 집합의 형광 강도를 보고합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 조립체 이미징 및 외관. (A) 배양 0일(d0) 및 21일(d21)(37°C, 20%O2)에 촬영한 대표 사진은 코어 외식이 내장되어 있지 않은 외인성 섬유아세포를 포함하는 하이드로겔의 다차원 수축과 코어 외측 주위에 외인성 섬유아세포를 포함하는 하이드로겔의 강한 방사형 압축을 보여줍니다. (B) 배양 21일차(d21)(37°C, 20%O2)에 촬영한 대표 사진은 무세포 하이드로겔, 코어 외식구 주위에 주조된 무세포 하이드로겔 및 코어 외식제 주위에 주조된 힘줄 섬유아세포 함유 하이드로겔 간의 압축 속도 차이를 보여줍니다. (C) 배양 0일(d0) 및 21일(d21)(37°C, 20%O2)에 촬영한 대표적인 광학 현미경 이미지(10x)는 코어 // 무세포 및 코어 // 섬유아세포 조립체 공동 배양에서 코어 외식(E) 주변의 세포 집단의 존재 및 콜라겐 하이드로겔(HG)의 압축 속도의 종방향 변화를 나타냅니다. 개략적인 표현은 코어 // cell-free assembloid와 코어 // 섬유아세포 assembloid 공동 배양 사이의 하이드로겔 압축의 차이를 보여줍니다. (D) 코어 // 내피 세포, 코어 // 대식세포 및 코어 // 섬유아세포 조립체 공동 배양(37°C, 20% O2)의 7일(d7)에 촬영한 대표 컨포칼 현미경 이미지. 왼쪽 줄의 이미지는 세포핵이 파란색으로 염색된 집합체(DAPI)와 분홍색으로 염색된 죽은 세포(Ethidium homodimer-1)를 보여줍니다. 다른 두 줄은 세포핵이 파란색으로 염색된 집합체(DAPI)와 액틴 필라멘트가 녹색으로 염색된 집합체(F-actin)를 나타냅니다. (E) 공동 배양 1일(d1) 및 7일(d7)에서 코어 // 내피 세포 집합체의 정량화된 생존력을 나타내는 상자 그림. N = 5입니다. 위쪽 및 아래쪽 경첩은 첫 번째 및 세 번째 사분위수(25번째 및 75번째 백분위수)에 해당하고 중간 경첩은 중앙값에 해당합니다. 수염은 상부/하부 힌지에서 사분위수 범위의 1.5배 이하의 최대/최소 값까지 확장됩니다. P-값: n.s.p > 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 어셈블로이드의 기계적 자극 및 어셈블로이드의 기계적 특성 측정. (A) 클램프 홀더 플랫폼, 힘 센서 및 스테퍼 모터로 구성된 맞춤형 스트레칭 장치의 그래픽 묘사. 사진 이미지는 클램프가 있는 스트레칭 장치에 장착된 조립체를 보여줍니다. 스케일에 사용되는 15mL 플라스틱 튜브(Ø: 17mm)의 뚜껑. (B) 코어 외식(연한 파란색)과 접합부(연한 빨간색)에 대한 대표적인 응력/변형률 곡선을 나타내는 그래프. 선형 탄성 계수(α), 최대 응력(β) 및 최대 변형률(у)을 데이터에서 추출하여 코어 외측 또는 접합부를 기계적으로 특성화할 수 있습니다. (C) 실험 시작 시 클램핑(실선), 클램핑 및 2% L0 변형률(점선)로 클램핑 및 스트레칭 또는 6% L0 변형(점선)으로 클램핑 및 스트레칭된 후 14일 동안 공동 배양(29°C, 3% O2)된 코어 // 내피 세포 아셈블로이드의 선형 탄성 계수(Emod)를 보여주는 그래프. N = 5입니다. 데이터 포인트는 스트레칭 전에 초기 모듈러스 선형 탄성 모듈러스로 정규화되었으며 모두 평균(±sem)으로 표시됩니다. p-값: *p < 0.05, **p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 다양한 틈새 조건에서 분리 및 배양 후 핵심 전사체의 변화. (A) 꼬리에서 분리한 후 단일 배양(37°C, 20%O2) 쥐 코어 외엽 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간에서 Vegfa, Mmp13 및 Mmp3 유전자 발현의 접힘 변화를 나타내는 산점도. 각각의 시점에서의 접힘 변화는 분리 2시간 후에 유전자 발현으로 정규화하였다. N = 2입니다. (B) 낮은 산소 장력 (3 % O2) 하에서 단일 배양 된 코어 외식에서 Ca9, Vegfa, Scx 및 Col1a1 유전자 발현의 습곡 변화를 묘사하고 높은 산소 장력 (20 % O2)에서 단일 배양 된 것과 비교했습니다. N = 5-6입니다. 상자 그림의 위쪽 및 아래쪽 경첩은 첫 번째 및 세 번째 사분위수(25번째 및 75번째 백분위수)에 해당하고 중간 힌지는 중앙값에 해당합니다. 수염은 상부/하부 힌지에서 사분위수 범위의 1.5배 이하의 최대/최소 값까지 확장됩니다. 정규화에 사용되는 데이터 포인트는 검은색 점으로 표시되고 개별 데이터 포인트는 빨간색 점으로 표시됩니다. p-값: **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 집합체 특이적 분비체 및 구획 특이적 전사체 분석. (A) 분비체 및 전사체 샘플을 채취한 7일차(d7)의 집합체를 보여주는 대표 사진과 기본 워크플로우 묘사. (B) 상자 그림으로 묘사된 7일간의 공동 배양 후(37°C, 20%O2) 코어 // 무세포 및 코어 // 섬유아세포 아셈블로이드의 상층액에서 VEGF 농도(pg/mL). N = 6입니다. (C) 높은 산소 장력(20%O2) 및 낮은 산소 장력(3%O2)에서 공동 배양(37°C) 후 코어 // 내피 세포 아셈블로이드의 대표 컨포칼 현미경 이미지. 세포핵은 청색(DAPI)으로 염색되며, 내장된 내피 세포는 내피 세포 마커 혈소판 유래 성장 인자 소단위 b(Pdgfb)와 함께 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 함께 발현합니다. 점선은 코어 외식(E)과 내피 세포가 함유된 하이드로겔(HG) 사이의 구획 인터페이스를 나타냅니다. (D) 코어에서 코어 구획의 Vegfa, Tnf-α, Fgf2 및 Mmp3 유전자 발현의 습곡 변화를 나타내는 산점도 // 낮은 산소 장력 하에서 공동 배양된 내피 세포 assembloids(3%O2) 정규화 및 높은 산소 장력 하에서 배양된 세포와비교. N = 2입니다. (E) 코어의 외인성 구획에서 Vegfa, Tnf-α, Fgf2 및 Mmp3 유전자 발현의 습곡 변화를 나타내는 산점도 // 높은 산소 장력(20%O2) 및 낮은 산소 장력(3%O2) 하에서 공동 배양된 살아있는 코어(aC) 또는 활력이 없는 코어(dC)가 있는 내피 세포 assembloids). 각각의 조건에서의 접힘 변화는 높은 산소 장력(20%O2) 하에서 공동 배양된 활력이 제거된 코어(dC)와 함께 코어 // 내피 세포 집합체의 외인성 구획으로 정규화되었다. N = 3-4입니다. B에서 상자 그림의 위쪽 및 아래쪽 경첩은 첫 번째 및 세 번째 사분위수(25번째 및 75번째 백분위수)에 해당하고 중간 힌지는 중앙값에 해당합니다. 수염은 상부/하부 경첩에서 사분위수 범위의 1.5배를 넘지 않는 최대/최소 값까지 확장됩니다. 이상치는 검은색 점으로 표시됩니다. p-값: *p < 0.05. D 와 E에서 정규화에 사용되는 데이터 포인트는 검은색 점으로 표시되고 개별 데이터 포인트는 빨간색 점으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표 1: 힘줄 질환 및 부상 모델 시스템에 대한 입력 요구 사항. 1차 힘줄 질환 유발 요인 및 2차 동인 목록은 힘줄 질환 및 부상 모델링의 핵심인 다루기 쉬운 입력 매개변수 선택과 일치합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 표 2: 힘줄 질환 및 부상 모델 시스템에 대한 출력 요구 사항. 힘줄 질환 특징의 선택은 힘줄 질환 및 부상 모델 행동의 해석에 정량화가 중요한 출력 매개변수의 선택과 일치합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 1: 클램프 홀더, 마운팅 스테이션 및 챔버 몰드용 .stl 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 2: 오른쪽 클램프 홀더 계획. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 3: 왼쪽 클램프 홀더 계획. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 4: 장착 플랫폼 계획 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 5: 금속 클램프 계획. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 6: cell-free 하이드로겔 수축을 보여주는 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 7: 활력이 제거된 코어 이식을 보여주는 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

전반적으로 여기에 제시된 조립체 모델 시스템에는 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 모델 시스템은 구성 요소의 품질만큼만 우수합니다. 조립 공정을 시작하기 전에 현미경으로 코어 explant와 seed-to-seeded cell population을 확인하는 것이 중요합니다. 유세포 분석으로 분리된 세포 집단의 표현형을 한 번 이상 확인하는 것도 마찬가지로 중요합니다. 특히 콜라겐-1의 새로운 배치를 처음 사용하는 경우 세포를 삽입하기 전에 시험 실행에서 가교 속도를 확인하는 것이 유리합니다. 조립체 어셈블리는 많은 수동 취급이 필요하므로 감염 위험이 높아집니다. 감염 위험을 최소화하려면 층류 공기 흐름이 있는 멸균 생물 안전 후드에서 작업하고, 장갑을 자주 교체하고, 장갑과 작업 공간을 80% 에탄올로 오염 제거하십시오. 비슷한 이유로 3D 프린팅 클램프 홀더를 두 번 이상 사용하지 마십시오. 임베딩 공정 자체에 앞서 모든 하이드로겔 성분(가교 용액, 콜라겐-1 용액)을 얼음 위에 보관하여 조기 가교를 방지하는 것이 중요합니다. 결과적으로, 가교 용액의 높은 pH와 낮은 온도로 인한 세포 사멸을 제한하기 위해 세포가 가교 용액에 첨가되면 신속하게 작업해야 합니다. 코어 외식에서 건조 관련 세포 사멸을 방지하려면 가교 용액을 콜라겐-1 용액과 혼합하기 직전에 클램핑된 코어 외식을 덮고 있는 배지를 흡인합니다. 하이드로겔 내에서 코어 외식의 중앙 배치를 보장하려면 약간 장력이 가해진 클램핑된 코어 외식구 주위에 하이드로겔을 주조하는 것이 이상적입니다. 이렇게 하려면 맞춤 핀과 M3 x 16mm 볼트 나사를 사용하여 클램프 홀더를 적절한 길이의 구멍이 있는 (3D 프린팅) 플레이트 세트에 고정합니다. 50분의 중합 시간 후, 내장된 코어 explant는 원하는 배양 조건에 따라 다시 디텐션될 수 있습니다. 배양 중 집합체가 경험하는 긴장의 양은 실험 결과에 지대한 영향을 미치며 샘플과 조건 전반에 걸쳐 균일하게 유지되어야 한다²¹.

그럼에도 불구하고, 실험 결과에 대한 기계적 (비)로딩의 큰 영향은 대부분의 조직 공학적 대안에 비해 조립체 모델의 주요 이점이며, 특히 코어 이식물의 유지된 매트릭스 조성이 세포 수준(⁹⁰)에서 복잡한 생체 내 로딩 패턴을 재현해야 하기 때문입니다. 실제로, 지금까지 선형탄성률, 최대 인장 변형률 및 어셈블로이드의 최대 인장 응력의 측정만이 입증되었지만, 피로 강도 및 응력 완화 측정에 대한 프로토콜은 다른 곳에서 힘줄 코어 외식에 대해 설명되었으며 어셈블로이드(^91,92)에 적용할 수 있어야 한다. in vivo와 같은 로딩 패턴 외에도 어셈블리의 다단계 모듈화가 가장 큰 장점일 것입니다. 개별 배양 챔버 덕분에 각 샘플에 대해 제어 가능한 틈새 조건 세트(예: 온도, 산소 장력, 포도당 농도, 보충제, 자극제, 억제제 및 플레이트를 사용한 정적 스트레치)를 개별적으로 설정할 수 있습니다. 다음으로, 외인성 구획의 매트릭스 강성 및 매트릭스 조성은 하이드로겔 조성물을 통해 맞춤화할 수 있으며, 예를 들어, 더 많은 콜라겐-3 및 세포 피브로넥틴 93,94,95를 통합함으로써 점점 더 병든 조직 미세환경의 영향을 연구할 수 있습니다. 외인성 구획에서 평가된 세포 집단은 파종할 세포를 선택하여 쉽게 적응할 수 있지만 확립된 유전자 변형 세포주 및 마우스 세포주(즉, ScxLin 세포 고갈)를 활용하여 힘줄 코어 이식에서 변형될 수도 있습니다(즉, ScxLin 세포 고갈)⁹⁶. 두 구획의 상이한 매트릭스 및 세포 조성은 또 다른 중앙 힘줄의 특징인 고유한 구획화된 3D 구조를 추가로 제공합니다(^1,30,46).

이 시스템을 사용할 때 결과 매개변수의 세분성에 대한 시스템의 모듈성의 결과를 고려하는 것이 중요합니다. 세포 증식 및 모집은 각 구획에 대해 개별적으로 평가할 수 있지만 기계적 특성, 세크레톰(secretome) 성분 및 분해 산물은 현재 전체 집합체에 대해서만 측정할 수 있습니다. 처리량과 관련하여, 적절한 교육을 받은 한 사람이 정규 근무일에 최대 50개의 어셈블로이드를 준비할 수 있으며, 주요 병목 현상은 클램핑 절차입니다. 일부 판독 방법은 상호 배타적이지만, 종점에서 세포 집단 구성(유세포 분석), 세포 전사체(RT-qPCR, RNA 염기서열 분석) 또는 매트릭스 및 세포 분포(면역세포화학/형광 현미경)뿐만 아니라 동일한 샘플에서 기계적 특성 및 분비체 성분을 반복적으로 평가할 수 있습니다. 이전 간행물에서, 이러한 방법들은 병변과 같은 틈새에 노출된 코어 // 섬유아세포 및 코어 // 대식세포 집합체에서 세포간, 교차 구획 상호작용을 광범위하게 특성화하기 위해 배치되었다^84,85. 이 연구에서는 서로 다른 미세환경 자극 하에서 코어 세포와 외인성 내피 세포 간의 교차 구획 상호 작용을 조사하는 조립체 모델 시스템의 기능을 탐구했습니다.

모델 시스템의 모듈화는 현재 설계 반복의 다음과 같은 한계를 극복하는 데 필요한 방법의 향후 개선을 허용합니다. 이 연구에서 제시된 유세포 분석과 최근 발표된 단일 세포 RNA 염기서열 분석 데이터는 힘줄 코어 상주 건세포와 아킬레스건 유래 집단이 이전에 가정했던 것보다 더 이질적이라는 것을 보여주었습니다 24,34,59,84,97. 또한, 초기 코어 또는 하이드로겔 상주 세포 집단의 이동 행동은 배양 중에 집합체 구획화를 흐리게 합니다. 두 가지 요인 모두 전사체의 차이를 특정 세포 유형에 기인하고 증식과 이동 기반 과정을 분리하는 것을 어렵게 만듭니다. 이러한 한계는 최근 in vivo 연구에서 특성화된 건강한 힘줄이나 병든 힘줄의 세포 조성을 기반으로 하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 입력 모집단을 정제하고, 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 구현하여 판독을 개선하고, 현미경 검사 중 EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine) 염색과 같은 증식 마커를 통합함으로써 극복할 수 있습니다.

여기에 제시된 아셈블로이드는 또한 신체의 나머지 부분과 분리된 병든 장기를 시뮬레이션하는 현재 사용 가능한 대부분의 시험관 내 시스템과 약점을 공유합니다^98,99. 그러나 여기에 사용된 배양 챔버 기반 플랫폼은 서로 다른 장기를 모방한 집합체가 연결되고 장기 간 상호 작용을 연구할 수 있는 다중 장기 플랫폼에 통합하기 위해 모델 시스템을 잘 포지셔닝합니다.

기본적으로 모델 시스템은 위치 설치류 힘줄을 기반으로 하며, 이로 인해 고유한 단점이 있습니다. 첫째, 결과의 번역 가능성은 힘줄 질환을 앓지 않거나 고통받는 야생형 마우스에 의해 방해를 받는다 ^8,100,101. 힘줄 질환의 양상을 보이는 인간 또는 새로 개발된 쥐 균주의 조직과 세포를 통합하면 이 문제를 완화할 수 있다¹⁰². 인간 기반 집합체로의 전환은 다양한 질병을 앓고 있는 힘줄(예: 건염, 건증 또는 주위건염)에서 환자 유래 조직과 치료 저항성 기증자를 대상으로 보다 개인화된 치료 프로그램을 제공할 수 있는 연구를 가능하게 하기 때문에 특히 흥미롭습니다. 둘째, 쥐꼬리 힘줄 외피는 과부하로 인한 미세 손상을 특히 잘 처리하지 못하기 때문에 급성 힘줄 손상 연구를 위한 모델 시스템의 적용 가능성이 제한적입니다.

이러한 모든 이유로, explant // 하이드로겔 아셈블로이드는 틈새 유도 미세 손상에 대한 반응으로 힘줄 코어 생물학, 매트릭스 구조-기능 상호 작용 및 특정 세포 집단 간의 교차 구획 상호 작용을 연구할 수 있는 최고의 위치에 있습니다. 이러한 다소 높은 처리량의 연구에서 수집된 통찰력은 생체 내 연구 및 치료법 개발에 대한 방향을 제시할 수 있습니다.

Materials

0.4 mm x 25 mm injection needle (G27)	Sterican	9186174
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament	Prusa	NA
4% formaldehyde	Roti-Histofix	P087.4
Accutase cell detachment solution	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Amphotericin	VWR	L0009-100
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2	Motic	NA
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel	RS PRO	1871235
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel	RS PRO	1871207
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CD146 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	134703
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	141709
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	102413
CD86 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	105007
Collagenase I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392-100ML
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	7000183
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
DMEM/F12	Sigma	7002211
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel	Accu	HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone	KauPO	09301-004-000001
Endopan 3 Kit	Pan-Biotech	P04-0010K
Endothelial cell growth supplement	Lonza	CC-3162
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30121023
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO	Sigma-Aldrich	46043-1MG-F
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse	BioLegend	123151
Falcon plastic tube (15 mL)	Corning	352096
Falcon plastic tube (50 mL)	Corning	352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa	BD Bioscience	23-11617-02
Gelatin	Invitrogen	D12054
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate	Sigma	Z805939-1EA
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Hydroxyproline assay	Sigma-Aldrich	MAK008
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML	Motic	NA
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate	Wako Chemicals	013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker	Corning	6780-FP
MEM non-essential amino acids	Sigma	7002231
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF)	PeproTech	315-02-50ug
MSD assay	Mesoscale Discovery	various
NucBlue	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nylon mesh strainer cap, 100 µm	Corning	734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer	Prusa	i3 MK3S
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L	Gibco	10010001
Puromycin	Gibco	A1113803
RBC lysis buffer	VWR	786-650
recombinant m-CSF	PeproTech	315-02
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro	Qiagen	74034
Slicing software: PrusaSlicer	Prusa	NA	Version 2.6.0 or higher
Sterile Cell Strainer 100 µm	Fisherbrand	22363549
Surgical scalpel blade No. 21	Swann-Morton	307
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsin-EDTA (0.5 %)	Gibco	15400054