腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

Summary

ここでは、荷重を支える腱コア組織と、病気や損傷によって活性化された細胞集団を含む外因性区画との間の腱細胞のクロストークを模倣する集合体モデルシステムを紹介します。重要なユースケースとして、外因性内皮細胞の疾患関連活性化を調査するためにシステムをどのように展開できるかを示します。

Abstract

腱は、筋肉の力を骨に伝達することで移動を可能にします。それらは、コラーゲン線維と間質細胞集団からなる丈夫な腱コアに依存しています。この耐荷重コアは、外因性腱区画を含む滑膜様組織層によって包含され、栄養され、修復される。この洗練されたデザインにもかかわらず、腱の損傷は一般的であり、臨床治療は依然として理学療法と手術に依存しています。利用可能な実験モデルシステムの限界は、新しい疾患修飾治療法と再発予防臨床レジメンの開発を遅らせてきました。

in vivo ヒト研究は、健康な腱と修復手術中にサンプリングされた末期の病変または破裂組織との比較に限定されており、根本的な腱疾患の縦断的研究は許可されていません。 また、in vivo 動物モデルには、不透明な生理学的複雑性、動物の倫理的負担、およびそれらの使用に関連する大きな経済的コストに関する重要な限界があります。さらに、 in vivo 動物モデルは、薬物の系統的プロービングや多細胞、多組織相互作用経路にはあまり適していません。また、よりシンプルな in vitro モデルシステムも不十分です。主な理由の1つは、腱細胞とその機能を有意義に研究するために必要な3次元の機械的負荷を適切に再現できないことです。

ここで紹介する新しい3Dモデルシステムは、マウス尾腱コア外植片を利用することで、これらの問題のいくつかを軽減します。重要なことは、これらの外植片は1匹のマウスから大量に容易にアクセスでき、細胞レベルで3D のin situ ローディングパターンを保持し、 in vivoのような細胞外マトリックスを特徴としていることです。このプロトコルでは、筋由来のendothelialセル、腱由来の線維芽細胞および骨髄得られたマクロファージと荷を積んだコラーゲンのhydrogelsが付いている腱の中心の外植片を外因性の腱コンパートメント内の病気および傷害活動化させたセル集団を取り替える方法のステップバイステップの指示与えられる。結果として生じる腱の集合体が、病気や傷害の際に出現する多細胞クロストークを調査するために、機械的に、または定義された微小環境刺激を介してどのように挑戦できるかが実証されています。

Introduction

筋力を骨に伝達して動きを可能にする機能において、腱は人体で発生する最も極端な機械的ストレスのいくつかに直面します^1,2,3。高齢化社会、肥満の有病率の増加、機械的に要求の厳しいスポーツ活動の人気の高まりにより、先進国では腱の病気や怪我の有病率が上昇すると予測されています^4,5,6。この増加に対抗するための新しい証拠に基づく疾患修飾治療レジメンの開発は、現在利用可能なモデルシステムの限界によって妨げられてきました^1,7,8。

理想的には、疾患および損傷修復モデルにより、標的臓器が、交絡因子を制御しながら、定義された一連の入力パラメータ(疾患のトリガーを模倣する、表1)を測定可能な出力パラメータ(疾患の特徴を表す、表2)に処理する方法を研究できます。このようなモデルシステムを使用した研究は、疾患や傷害の修復の根底にある(病理的な)生理学的プロセスを特定し、診療所における疾病や傷害の特徴を予防または軽減するために利用できる知識を得ることができます。この原理を腱に適用すると、有用なモデルシステムは、微小損傷、炎症、血管新生、細胞過多、マトリックス代謝回転の加速、および区画解除の特徴を含む、病気や損傷に対する生体内の腱応答の中央部分を要約する必要があります^{9,10,11,12,13,14,15}.これらの特徴をベースとして、腱疾患および損傷修復モデルシステムを成功させるための次の要件を推測できます。

機械的過負荷は、腱損傷および疾患の病因の中心的な要因であると仮定されており、したがって、微小損傷を引き起こすために一般的に使用される実験的アプローチである¹⁶。したがって、制御可能な機械的負荷性は、腱疾患および損傷修復モデルの主要な前提条件です。理想的には、モデルシステムは、単一の伸張損傷荷重、疲労荷重、および^{除荷8、17、18}の3つの主要なモードを可能にします。機械的変形時に、組織常在細胞は、引張力、せん断力(細胞を取り巻くコラーゲン繊維の滑りによる)、およびアンロード中またはエンテーゼの近くで発生する圧縮力の複雑な組み合わせを経験する^19,20。モデルシステムは、これらの複雑な荷重パターンを可能な限り忠実に再現する必要があります。

マトリックス微小損傷を導入する別の方法は、(誘発性)炎症性サイトカイン、酸化ストレス、または高グルコース濃度21,22,23など、腱疾患および損傷の全身素因を模倣する生化学的ストレッサーを活用することです。したがって、制御可能なニッチ微小環境は、腱疾患および損傷修復モデルシステムに有利です。

炎症、血管新生、および細胞性亢進を再現できるモデルシステムの一般的な前提条件は、これらのプロセスを駆動する細胞集団の選択的存在です²⁴。炎症過程の場合、これらの集団には好中球、T細胞、およびマクロファージが含まれますが、血管新生を研究するには内皮細胞と周皮細胞が必要になります25,26,27,28,29。腱線維芽細胞は、腱の修復に不可欠であるだけでなく、増殖性および遊走性細胞として、腱疾患で観察される局所的な超細胞性にも部分的に関与しています30,31,32,33,34,35,36。

常在細胞集団の変化に加えて、腱マトリックス組成は腱疾患や損傷でも変化します^{7,37,38,39,40}。適切な疾患関連の微小環境の手がかりを提示するために、モデルシステムは、例えば、コラーゲン-1、コラーゲン-3、および細胞フィブロネクチンの適切な比例的組み合わせを可能にすることによって、標的とする疾患または損傷の段階に一致する細胞外マトリックス組成を統合できる必要があります⁴¹。

健康な腱を腱の中心と外因性区画(すなわち、エンドテノン、エピテノン、パラテノン)に区画化することは、それらの機能の中心であり、病気や損傷した腱ではしばしば乱されます1,42,43,44,45,46,47 .したがって、3D腱区画化を腱モデルシステムに組み込むことは、脱区画化と再区画化の根底にあるプロセスをより詳細にシミュレートするために必要であるだけでなく、サイトカインと栄養素の正しい時空間勾配を確立するのにも役立ちます^48,49。

最後に、モジュール性はモデルシステムのもう一つの中心的な資産であり、研究者は、調査されたプロセス中に、前述のストレッサーの正しい相対的な寄与と相互作用を組み合わせることができます^8,17。

最適な入力モダリティを選択することに加えて、重要なステップは、結果として得られる出力の変化を測定、観察、追跡できることです。モデルシステムの機械的特性(すなわち、トウ領域の長さ、線形弾性率、最大引張ひずみ、最大引張応力、疲労強度、および応力緩和)は、腱の主な機能を特徴付けるため、ここでは中心的です^50,51,52。これらの機能的変化を組織レベルの変化に結びつけるためには、(コラーゲン)構造マトリックスの損傷を検出し、疾患および修復に関連する細胞集団の増殖と動員を追跡する方法を可能にすることが重要です30,53,54,55,56,57,58,59,60。

新しい細胞間および細胞マトリックスのクロストークを研究するには、定量化に十分な量のタンパク質を単離またはマーキングできる必要があります(すなわち、ELISA、プロテオミクス、免疫組織化学、フローサイトメトリー)14,21,61,62。集団特異的または少なくともコンパートメント特異的な遺伝子発現解析も可能である必要があります(すなわち、蛍光活性化セルソーティング[FACS]、シングルセル/バルクRNAシーケンシング、およびリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR))21,24,27,63。モデルシステムは、同じ試験片および複数の試験片で、前述の出力パラメータをできるだけ多く測定し、ハイスループット研究を可能にするのに十分な速度で測定できる必要があります。

ヒトの腱疾患や損傷の修復を研究するために現在利用可能なモデルシステムの中で、人体自体は、もちろん最も代表的なものです。また、実験的介入との相性も最も低くなります。急性腱損傷の患者は臨床研究に豊富に利用できますが、早期腱鞘炎(最も一般的な腱疾患)の患者はほとんど症状がなく、より深刻な変化が現れるまで臨床的に検出されないことがよくあります^14,64,65。これにより、腱の恒常性が脱線する決定的な瞬間と、この脱線の背後にあるメカニズムを特定することは困難です16,66,67,68,69。さらに、健康な腱から生検を抽出することは、損傷が持続する可能性があるため、倫理的に困難です。前十字靭帯再建手術によるハムストリングス腱の残骸は、健康な対照としてよく使用されますが、腱の病気や損傷に一般的に影響を受ける回旋筋腱板、アキレス腱、および膝蓋腱と比較して、機能、機械的特性、細胞集団、およびマトリックス組成が間違いなく異なります70,71,72,73。

in vivo 動物モデルは、よりアクセスしやすく扱いやすいものですが、その使用は動物に大きな倫理的負担を課し、研究者には経済的コストを課します。さらに、一般的なモデル動物のほとんどは、腱鞘炎病変を自発的に発症しないか(すなわち、ラット、マウス、ウサギ)、またはそれに関与する多細胞伝達経路を追跡するために必要なプライマーおよび遺伝子改変株を欠いている(すなわち、ウマ、ウサギ)。

単純な2D in vitroモデルシステムは、複雑さ/扱いやすさのスペクトルの反対側にあり、より制御可能なトリガーのセットに応答して、特定の細胞間コミュニケーション経路の制御された時間効率の高い研究をより適切に行うことができます^8,74。しかし、これらの単純化されたシステムは、腱の機能の中心となる多次元の機械的負荷(引張、圧縮、せん断など)を再現できないのが一般的です。さらに、組織培養プラスチックの(余りにも)高い剛性は、関心のある病態を模倣することを意図したコーティングによって提供されるマトリックスの手がかりを上書きする傾向がある^75,76。

この欠点を克服するために、ますます洗練された組織工学的3Dモデルシステムが開発され、その組成が少なくとも部分的に所望の病態に一致させることができるロード可能なマトリックスを提供する^77,78,79。しかし、これらの系は、複雑なin vivo細胞外マトリックス組成と細胞負荷パターンを正確に再現するのに苦労しているだけでなく、一般的に、腱疾患と損傷修復を調整する区画間コミュニケーション経路を研究するために必要な長期的な負荷性と区画インターフェースを欠いています48,49,80。

Ex vivo腱外植片モデル系は、細胞周囲ニッチ、クロスコンパートメントバリア、時空間サイトカイン/栄養素勾配、伸長時に複雑なローディングパターンを再現するin vivo様マトリックス組成物が組み込まれているという明確な利点があります⁸。サイズ依存の栄養素拡散限界の結果として、より大きな動物モデル(すなわち、馬)からの外植片は、腱の病気と損傷の修復の長期的な研究のために生き続けることが困難です^81,82,83。一方、マウス種(アキレス腱、膝蓋腱など)の小さな外植片は、再現性のあるクランプと機械的負荷が困難です。また、そのサイズは、サンプルをプールしたりスループットを低下させたりすることなく、細胞、タンパク質、および遺伝子レベルの読み出しのために収集できる材料の量を制限します。この意味で、マウス尾腱束は、1匹のマウスから大量に入手でき、複雑なin vivo細胞周囲マトリックス組成を保存し、細胞負荷パターンを再現するため、腱疾患や損傷修復のハイスループット研究を可能にする可能性を秘めています。しかし、抽出プロセス中に、それらは外因性コンパートメントのほとんどを失い、そこには血管、免疫、および線維芽細胞の集団が含まれており、これらは現在、腱疾患を引き起こし、修復すると考えられています^8,18。

このギャップを埋めるために、マウス尾腱由来のコア外植片の利点と3Dハイドロゲルベースのモデルシステムの利点を組み合わせたモデルシステムが開発されました。このモデル系は、尾腱外植片の周囲にキャストされた細胞を含む(コラーゲン-1)ヒドロゲルからなる^84,85。この論文では、内皮細胞を含む1型コラーゲンヒドロゲル(外因性コンパートメント)内でコア外植片(内因性コンパートメント)を共培養することによって得られる有用な読み出しとともに、必要な製造ステップを詳細に説明します。

Protocol

ここに記載されているすべての方法は、管轄当局(チューリッヒ州のライセンス番号ZH104-18およびZH058-21)によって承認されています。概要を 図 1 に示します。 1. 12-15週齢マウス(B6/J-Rj)の腱群集体成分の単離 CO2ガス誘発窒息によりマウスを安楽死させる。収量を最大化するには、一度に3匹以上のマウスを処理せず、安楽死後すぐに細胞の分離を進めてください。 気胸の両側性誘発による死亡を確実にする。 マウスの皮膚を80%エタノールで滅菌し、マウスを滅菌バイオセーフティフードに移します。 腱線維芽細胞を分離します。メス(No.21)を使用して、マウスの足の真ん中を横方向に切開します。この切開部の両端から、後ろ足の側面に沿って、腰まで足に垂直に2つの切り込みを入れます。 ピンセットを使って足の切り取られた皮膚フラップを固定し、ふくらはぎの筋肉を覆っている皮膚をはがします。同じマウスから内皮細胞を単離する場合は、代わりにすべての皮膚を取り除きます。 アキレス腱を踵骨から新しいメスの刃(No.21)で分離します。アキレス腱の緩い端をピンセットで固定し、もう一方の端を腓腹筋から分離します。 アキレス腱をPBSで一度洗浄し、メス(No.21)を使用して、白い腱組織だけが残るまで残りの筋肉組織をすべて除去します。同じマウスから内皮細胞を単離する場合は、アキレス腱をPBSに残し、ステップ1.6に進みます。まずは。 1匹の動物のアキレス腱を、10 mLの腱消化培地(DMEM / F12 + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン+ 1%アムホテリシン+ 2 mg / mLコラゲナーゼ1)を含む15 mLのプラスチックチューブにプールし、15 rpmの低速オービタルシェーカーを使用して、ゆっくりと一定の攪拌下で37°Cで6〜8時間消化します。 消化した腱溶液を500 x g で5分間室温で遠心分離し、上清を吸引し、8 mLの標準培地(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン + 1% アムホテリシン + 1% 非必須アミノ酸)に再懸濁し、T25 培養フラスコで標準培養条件(37 °C、20 % O2)で培地を交換せずに 7 日間培養します。その後、週に一度メディアを交換してください。 細胞を80%のコンフルエントでT150培養フラスコ(1:6)に分割します。2つの1.5 mLクライオチューブに分配した滅菌ろ過凍結培地(70% DMEM/F12 + 20% FBS + 10% DMSO)の2 mL中の継代2で細胞を凍結し、さらに使用するまで-80°Cに保ちます。トリプシンを使用して、組織培養プラスチックから細胞を除去します。 筋肉由来の内皮細胞を単離します。腱線維芽細胞が同じマウスから単離されない場合は、ステップ1.5.1および1.5.2から開始します。 ハサミを使用して、股関節を切断することにより、後ろ足を体から分離します。 後肢を冷たいPBS(~4°C)で一度洗浄し、筋肉(大腿四頭筋、長指伸筋、ヒラメ筋、腓腹筋)をメス(No.21)で除去し、氷上のペトリ皿に入れます。 新鮮なメスの刃(No.21)を使用して、ペトリ皿を氷上に置きながら、筋肉組織を1mm3 未満の小片に細かく刻みます。 両後脚からミンチにした筋肉組織を、12.5 mLの筋消化培地(PBS + 2 mg/mLコラゲナーゼIV + 2 mg/mLディスパーゼII + 2 mM CaCl2)を含む50 mLのプラスチックチューブにプールします。 プラスチックチューブを37°Cのウォーターバスに10分間入れます。溶液を激しく振とうし、さらに10分間戻します。溶液が均質になり、腱と筋膜の(白い)部分のみが残るまで繰り返します(約4 x 10分)。その間、腱線維芽細胞の単離またはマクロファージの単離を続けます。 12.5 mLのコールドPBS + 10% FBSをプラスチックチューブに加え、消化を停止します。 50 mLピペットを備えたバッテリー駆動のピペットホルダーを使用して、プラスチックチューブから懸濁液を吸引します。プラスチックチューブに400μmのセルストレーナーを装着し、懸濁液をろ過して破片を取り除きます。100 μmのセルストレーナーでこのプロセスを繰り返します。 ろ過した懸濁液を 400 x g で 5 分間室温で遠心分離し、10 mL の冷たい PBS + 10% FBS に再懸濁し、再度遠心分離します。 集団選択のためにピューロマイシン(4 mg/mL)を添加した8 mLの内皮培養培地(DMEM/F12とエンドパン3キットの1:1混合物+10 U/mLヘパリン+20S + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン+1%アムホテリシン+30 mg/mL内皮増殖サプリメント)に再懸濁します。 1匹のマウスの細胞を、2 mLの滅菌0.2%ゼラチン溶液で37°Cで2時間コーティングした1つのT25培養フラスコに播種し、余分な溶液を除去した後、室温で一晩乾燥しました。隔離の前日にフラスコを準備します。 標準培養条件(37°C、20%O2)で24時間後、ピューロマイシンサプリメント培地を除去し、付着した細胞をPBSで1回洗浄し、8mLの内皮培養培地で培養する。 細胞をゼラチンでコーティングしたフラスコに80%のコンフルエントで1:5継代し、P2まで実験に使用します。トリプシン以外の細胞剥離液(材料表)を使用して、組織培養プラスチックから細胞を除去し、凍結しないでください。 骨髄由来のマクロファージを単離します。腱線維芽細胞または内皮細胞が同じマウスから単離されていない場合は、最初に手順1.5.1、1.5.2、1.6.2、および1.6.3を実行します。 皮膚、腱、筋肉組織を除去した後、残った骨(大腿骨と脛骨)を冷たいPBS(~4°C)で一度洗います。 骨を新鮮で冷たいPBS(~4°C)に入れ、メス(No.21)を使用して骨髄が露出するまで骨端を徐々に切り取ります。骨の両側に赤い点として現れます。 シリンジに0.4 mm x 25 mm(G27)の注射針を装着し、10 mLのマクロファージ培養培地(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン + 1% アムホテリシン + 1% 非必須アミノ酸)を充填します。 50mLのプラスチックチューブに骨を次々と挟み、上部の露出した骨髄に約1mmの深さの注射針を挿入し、注射器を空にして骨髄を洗い流します。洗い流された骨髄は、培地に懸濁すると赤みを帯びた管状の構造として現れます。 骨髄を1 mLのピペットチップでゆっくりと上下に繰り返しピペッティングして溶解します。50 mLピペットを装備したバッテリー駆動のピペットホルダーを使用して、細胞懸濁液を100 μmのセルストレーナーでろ過し、50 mLのプラスチックチューブに戻し、室温で350 x g で5分間遠心分離します。 上清を除去し、ペレットを10 mLの赤血球(RBC)溶解緩衝液に再懸濁し、室温で10分間、350 x gで再度遠心分離します。 ペレットを5 mLのマクロファージ培養培地(DMEM / F12 + 10S + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン+ 1%アムホテリシン+ 1%非必須アミノ酸)に再懸濁し、直径100 mmの未処理のペトリ皿に播種します(皿あたり5-8 x 106 細胞)。 4時間後、40 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(m-CSF)を添加したマクロファージ培養培地5 mLを、m-CSFを含まない細胞培養培地(1:1混合物)に添加し、最終濃度が20 ng/mL m-CSFになるようにします。 6日後、細胞を実験に使用するか、さらに使用するまで凍結します。トリプシン以外の細胞剥離液(材料表)を使用して、組織培養プラスチックから細胞を除去します。注:単離すると、セルは膨張しなくなります。ここで説明する細胞単離法は、示された年齢範囲外のマウスおよびラットでも機能します。 単離した細胞集団の表現型をフローサイトメトリーで確認するには、ステップ 6.3.4 に進みます。 2. WistarまたはSprague-Dawleyラットからのコラーゲン単離 他の場所で詳細に説明されている分離プロトコルに従ってください86.また、マウスでも機能しますが、収量ははるかに低くなります。 得られた溶液の濃度をヒドロキシプロリンアッセイで測定し、SDSページで純度を評価し、実験で使用するまで溶液を4°Cで保存します。 3. 培養系部品の製造 クランプホルダー、取り付けステーション、チャンバー金型を3Dプリントします。クランプホルダー、取り付けステーション、およびチャンバー金型の添付の.stlファイル(補足ファイル1)をスライシングソフトウェアにロードします。必要に応じてオブジェクト番号を調整するには、ポイント アンド クリックを使用してオブジェクトを選択し、コピー アンド ペーストして乗算します。 Gコードのエクスポート(Ctrl-R)を押してGコードを生成し、エクスポート(Ctrl-G)します。 Gコードを3Dプリンターにロードします。 印刷プロセスには、無着色の生体適合性フィラメント(ポリ乳酸など)を使用してください。 ねじ切り機を使用して、ネジを運ぶクランプホルダーの穴に3mmのネジを切ります(補足ファイル2 および 補足ファイル3、穴1および3)。 ステンレス鋼のダウエルピンをクランプホルダーの背面にある穴に入れます(補足ファイル2 および 補足ファイル3、穴4)。 クランプホルダーと取り付けステーションは、使用前に少なくとも1時間UVライトで滅菌してください。3Dプリントされたクランプホルダーを再利用しないでください。 あるいは、添付の図面(補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4)を使用して、クランプホルダーと取り付けステーションをポリエーテルイミドで製造すると、より高価になりますが、より良い滅菌方法(オートクレーブ滅菌など)と繰り返しの使用が可能になります。 3Dプリントされた金型を使用してチャンバーを鋳造します。チャンバーモールドにシリコンを充填します。 真空チャンバー(90 mbar)で30分間シリコーンを脱気します。 金型に使用するフィラメントの耐熱性に応じて、溶液を室温で一晩重合するか、70°Cのホットプレートで1時間重合させます。 重合チャンバーを金型から慎重に取り外し、メス(No.21)で余分なシリコーンを切り取ります。 オプション:アッセンブロイド、つまり周囲のチャンバーに機械的に負荷をかける場合は、シリコンチャンバーの穴をステンレス鋼製の中空チューブで補強します。 添付のプラン(補足ファイル5)を使用して、ステンレス鋼から金属クランプを機械加工します。 毎回使用する前に、ステンレス鋼クランプ、ポリエーテルイミドクランプホルダー、ネジ、およびシリコンチャンバーを洗浄してください。80%エタノール(EtOH)と20%逆浸透水(ROW)で10分間超音波処理します。 50% EtOH および 50% イソプロパノールで 10 分間超音波処理します。 ROWで3回すすぎます。 0.5%アルカリ性洗浄濃縮液で10分間超音波処理します(すなわち、600 mLのROW中に3 mL)。 0.5%アルカリ性洗浄濃縮液で10分間超音波処理します。 0.5%アルカリ性洗浄濃縮液を1時間50分間振とうしながら放置します。 ROWで3回すすぎます。 行で10分間超音波処理します。 コンポーネントを風乾させ、オートクレーブします。 4. 中心のexplantsを締め金で止めること 対応するクランプホルダーとそれぞれ1つの金属クランプを取り付けステーションに配置します。 濡れたオートクレーブ処理した紙片(4 mm x 25 mm)を金属クランプの上に置き、メス(No.21)でクランプの内側の縁に沿って紙を切ります。別の紙片から2つの追加の小さな紙片(4 mm x 1.5 mm)を切り取り、濡らしたままにします。 先のとがったピンセットを使用して、金属クランプの間の紙の上に8つのコア外植片を配置し、その端点を金属クランプに置きます。 コアエクスプラントの端点を、準備した小さな紙片(4 mm x 1.5 mm)で覆い、その上に金属クランプを置きます。ドライバーと小さなネジ(M3 x 6 mm)を使用して、金属クランプとクランプホルダーの間にコア外植片を固定します。 クランプしたコア外植片をシリコーン培養チャンバーに慎重に移し、これらのチャンバーに2 mLの標準細胞培養培地(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン + 1% アムホテリシン + 1% 非必須アミノ酸)を充填します。 オプション:アッセンブリド/周囲のチャンバーを機械的に装填する場合は、追加のネジ(M3 x 16 mm)で穴3(補足ファイル2および補足ファイル3、穴3)に固定します。 5.コラーゲンヒドロゲルの調製とキャスティング 細胞剥離液で組織培養プラスチックから目的細胞を取り出し、室温で400 x g で5分間遠心分離し、1 mLの標準培地に再懸濁します。 1つの集合体に対して、10 μLのPBS(20倍)、1.28 μLの1 M NaOH(125倍)、8.72 μLの二重蒸留水(ddH2O、23倍)、80 μLのコラーゲン-1(2.5倍または1.6 mg/mLの最終)、および100 μL(2倍)の標準培地(コア//無細胞集合体の場合)または細胞懸濁液が必要です。これらの成分を2つの別々の溶液に調製し、鋳造の直前にのみ混合します。架橋溶液:PBS、NaOH、ddH20、および最大12個の集合体(+10%安全マージン)の細胞懸濁液を架橋溶液にプールし、氷上の15 mLプラスチックチューブに保管します。2つの溶液を混合した後、250,000細胞/mLの腱線維芽細胞、500,000細胞/mLの筋肉由来内皮細胞、または370,000細胞/mLの骨髄由来マクロファージの最終濃度になるように細胞懸濁液の濃度を調整します。 コラーゲン-1溶液:最大12個の集合体に必要なコラーゲン-1溶液(+10%安全マージン)を別の15 mLプラスチックチューブにプールし、氷上に保管します。 架橋溶液とコラーゲン-1溶液が氷上で準備ができたら、クランプされたコア外植片を含む培養チャンバーから細胞培養培地を吸引します。 コラーゲン-1溶液を1000μLのピペットで架橋溶液に加え、気泡を発生させずにピペッティングで素早く上下させて2つの溶液を混合します。個々の腱芯外植片を200 μLの混合溶液で覆い、シリコンチャンバーから設けられた果樹園にピペッティングします。 ハイドロゲルを37°Cで50分間重合させます。 シリコーン培養チャンバーの隅にピペッティングして、各共培養培地1.5 mLを慎重に充填します。コア//線維芽細胞の共培養には、DMEM/F12、10% FBS、1% 非必須アミノ酸、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1% アムホテリシン、200 μM L-アスコルビン酸、20 ng/mL マクロファージコロニー刺激因子を充填します。 コア//マクロファージ共培養の場合は、DMEM/F12、10% FBS、1% 非必須アミノ酸、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1% アムホテリシン、200 μM L-アスコルビン酸、20 ng/mL マクロファージコロニー刺激因子を充填します。 コア//内皮細胞の共培養には、DMEM/F12とエンドパン3キットの1:1混合物+10 U/mLヘパリン+20S+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+1%アムホテリシン+30 mg/mL内皮増殖サプリメントを充填します。 仮説に適した培養条件で集合体を培養します。例えば、病変様ニッチ環境を模倣するには、37°Cおよび20%O2で培養する。培地を1週間で2回交換してください。感染を防ぐために、チャンバーをインキュベーターに入れる前に、チャンバーを大きなペトリ皿または滅菌ボックスに入れます。注:培養時間は、仮説と共培養のセットアップによって異なります。例えば、病変様ニッチ環境におけるコア//線維芽細胞群集体は、約3週間後に機械的に不安定になる。 6. 利用可能な読み出し方法 生存率や形態アッセイを含む蛍光顕微鏡検査を実施します。一般に、アッセンブロイドはフルマウントとしてイメージ化できます。これを行うには、クランプの近くでハサミで切断し、12ウェルプレートに移すことにより、クランプから集合体を取り外します。 アッセンブロイドをPBSで一度洗浄します。 生存率分析を行う場合は、各集合体を100 μLの4 x 10-6 Mエチジウムホモ二量体PBS(EthD-1)で暗所で37°Cで20分間染色します。 集合体をPBSで3回洗浄し、500 μLの4%ホルムアルデヒドでそれぞれ室温で20分間固定します。注意: 4%ホルムアルデヒドには、アレルギー、発がん性、変異原性があり、生殖に毒性があり、発生毒性(生殖毒性)または臓器の損傷を引き起こす可能性があります。防護服と手袋、目の保護具、マスクまたはその他の呼吸用保護具を着用してください。 アッセンブロイドをPBSで3回洗浄し、選択した染色プロトコルを続行します。染色の選択は以前に説明されています84,85。注:コラーゲン自家蛍光に近い発光波長(約480 nm)の蛍光色素を使用した染色は避けてください。 メーカーの指示に従って、RT-qPCRまたはゲノムワイドRNAシーケンシング用のコンパートメント特異的RNA単離を実行します。はさみでクランプから集合体を取り外します。 オプション:ピンセットを使用して、コア外植片を外因性ハイドロゲルコンパートメントから分離します。 十分な量のRNAを単離するために、20〜24個の20mmコア外植片または2つの細胞を含むコラーゲンハイドロゲルをプールします。 1 mLのコールドトリゾールと機械的破壊(すなわち、金属ビーズまたは極低温粉砕)を使用して、プールされたコア外植片またはプールされたコラーゲンハイドロゲルの細胞外マトリックスを破壊します。注意:経口、経皮、および吸入毒性。皮膚や目の炎症を引き起こします。手袋を着用し、化学安全キャビネット内でのみ取り扱ってください。 前述のように、または製造元の説明書84、85に記載されているように、標準的なRNA抽出キットを使用して、細胞ライセートからのRNA単離を続行します。 コンパートメント特異的フローサイトメトリー。はさみでクランプから集合体を取り外します。 オプション:ピンセットを使用して、コア外植片を外因性ハイドロゲルコンパートメントから分離します。 コラゲナーゼI(3 mg/mL)およびディスパーゼII(4 mg/mL)を含む1 mLのPBSにコンパートメントを消化し、37°Cで4時間、常時撹拌します。 消化した溶液を500 x g で5分間室温で遠心分離し、上清を吸引します。 選択した蛍光色素標識抗体を含む100 μLのFACSバッファー(PBS中の1S)にペレットを再懸濁します。蛍光色素標識抗体の選択は、以前に説明されています84,85。 染色液を室温で30分間インキュベートします。 染色液を1.4 mLのFACSバッファーで希釈し、室温で500 x g で5分間遠心分離します。 ペレットを350 μLのFACSバッファーに再懸濁し、100 μmのナイロンメッシュストレーナーキャップで溶液をろ過してから、メーカーの指示に従って選択したフローサイトメーターで分析します。 上澄みを分析します。上清採取の3日前に共培養培地を無血清共培養培地に交換してください。 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびメソスケールディスカバリー(MSD)アッセイキットを用いて、濃縮された希釈されていない上清の即時分析および遅延分析を実施します。遅延分析の場合は、上清を -80 °C の 1.5 mL プラスチックチューブに保存します。 集合体の機械的特性を評価します。カスタムメイドのストレッチ装置を使用して、機械的な力を加え、機械的特性を測定します22。ステンレス鋼の合せ釘ピンおよびステンレス鋼ねじはクランプを他の伸張装置にまた取付け可能にさせる。 集合体の機械的特性は、埋め込まれたコア外植片 18の機械的特性によって大きく決定されるので、コア外植片をヒドロゲルに埋め込む前に、コア外植片の機械的特性を測定して、測定プロセスで新たに鋳造されたハイドロゲルを破壊するリスクを低減する。

Representative Results

コンポーネントの絶縁(図1 および 図2)集合体共培養でコア外植片と細胞集団を利用する前に、これらの成分を顕微鏡でチェックします(図1)。コア外植片は均一な直径(100〜200μm)で、目に見えるねじれやしわがあってはなりません。内皮細胞は、他の細胞と接触して細長い形状を示すはずですが、単離による初期収量が低いため、密度が低すぎると播種されません。この場合、内皮細胞は細胞骨格の伸長を伴うより丸みを帯びた形状を呈し、増殖は著しく遅くなります。7〜10日後に1:5で分割します。アキレス腱から単離された腱線維芽細胞は、1:6に分割した場合、1〜2継代(各10〜14日)以内のヒトの線維芽細胞と比較して、より丸みを帯びた形態をとっています。マクロファージは線維芽細胞や内皮細胞よりもはるかに小さく、単離後に増殖しません。バッチに応じて、その形状はピラミッド型から円形までさまざまです。 細胞成分の表現型をフローサイトメトリーで検証しました。結合CD31抗体を内皮細胞のマーカーとして使用しました(図2A)。未染色のコントロールサンプル(灰色)に基づいて蛍光閾値を設定すると、継代1(P1)の90.1%および継代2(P2)の48.7%の内皮細胞がCD31陽性と同定されました。腱線維芽細胞マーカーScleraxisを緑色蛍光タンパク質(ScxGFP)および結合CD146抗体とともに共発現する遺伝子改変マウス系統を用いて、腱線維芽細胞の特性を解析した(図2B)35,60。1継代後(P1)、線維芽細胞の37.3%がScxGFP+CD146-、0.2%がScxGFP+CD146+、4.3%がScxGFP-CD146+、58%がScxGFP-CD146-であった。2継代(P2)後、ScxGFP+CD146-細胞の割合は27.6%に減少し、ScxGFP+CD146+細胞の割合は6.9%に増加し、ScxGFP-CD146+細胞の割合は10.6%に増加し、ScxGFP-CD146-細胞の割合は54.9%に減少した。マクロファージの同定と特性評価のために、F4/80抗体をCD86抗体およびCD206抗体と組み合わせて使用しました(図2C)。単離・培養後、骨髄由来細胞の96.4%がF4/80陽性であった。これらのF4/80陽性細胞のうち、8.6%がCD206+CD86-、23.6%がCD206+CD86+、28.3%がCD206-CD86+、39.4%がCD206-CD86-であった。コラーゲンの架橋速度はバッチごとに異なる場合があり、実験を開始する前にテストする必要があります。 集合体の外観(図3)病変様培養条件(36°C、20%O2)では、コア外植片は機械的に伸縮性を保ち、外観は変化せず、少なくとも21日間にわたって周囲のハイドロゲルと視覚的に区別でき、物理的に分離可能であり続けました(図3A、B)。周囲のハイドロゲルは時間の経過とともに圧縮され、圧縮速度はそれに播種された細胞集団に依存します。アキレス腱由来の線維芽細胞は、周囲のハイドロゲルを最も速く収縮させ、コア外植片の周囲にキャストされたハイドロゲルでは放射状に収縮し、そうでない場合は全方向に収縮しました(図3B、C)。当初は、コア外植片の周囲に配置された無細胞ハイドロゲルも圧縮されました。この収縮は、コア外植片からの細胞の移動によって引き起こされた可能性が高く、動的なクロスコンパートメント界面を示しています。コア外植片が埋め込まれていない無細胞ハイドロゲルは検出できるほど圧縮しなかったため、水分損失による収縮の寄与は無視できるようです(図3B および 補足ファイル6)。 したがって、ハイドロゲルの圧縮の欠如は、集合体アセンブリの誤り(すなわち、低細胞濃度)を検出するために使用でき、より高価な読み出し法に進む前にチェックする必要があります。この方法を確立する一方で、細胞濃度を低下させる一般的な間違いには、細胞を比較的過酷な架橋溶液(高pH、低温)に長時間放置したために外因性ハイドロゲルで細胞を死滅させてしまったことや、中程度吸引からヒドロゲル注入までの時間が長すぎたためにコア外植片を乾燥させてしまったこと、またはコア外植片のクランプが高すぎてコラーゲンに包埋できなかったことなどがありました。 共焦点蛍光顕微鏡:生存率と形態解析(図3)ハサミでクランプから取り外すと(図3B)、集合体を固定し、染色し、切片化せずに共焦点顕微鏡で全体をイメージングできます。ここでは、コア//内皮細胞、コア//マクロファージ、およびコア//線維芽細胞群集をDAPI(NucBlue)およびエチジウムホモ二量体(EthD-1)で染色して生存率を分析し、DAPIおよびF-アクチンで3Dコラーゲンハイドロゲル内の形態および細胞拡散を解析しました(図3D)。コア//内皮細胞集合体(図3E)の生存率を定量化し、コア//マクロファージおよびコア//線維芽細胞集合体について以前に報告されたよりも、集合体形成後の方が一般的に低いことがわかった84。しかし、生存率は少なくとも7日目まで集合体培養中に安定していた。 機械的に誘起された微小損傷と機械的特性の測定(図4)クランプホルダーに取り付けられたネジとピンにより、クランプされた集合体を一軸延伸装置に固定することができます。ここで使用されるカスタムメイドの延伸装置は、10Nのロードセルを装備しており、以前の出版物(図4A)22に記載されている。すべてのサンプルは、測定前に1%ひずみまでの5回のストレッチサイクルで前処理されました。 コア外植片または集合体の完全な応力-ひずみ曲線を記録すると(図4B)、線形弾性率(α)、最大応力(β)、および最大ひずみ(у)を定量化できます。しかし、コア外植片や集合体に不可逆的な損傷を与えるため、同じサンプルの最大応力(β)と最大ひずみ(у)の縦方向の進展を評価することは不可能です(図4B)。ここでは、線形弾性率を力に耐えるサンプルの能力の尺度として使用したが、この測定では、線形弾性率の恒久的な減少を引き起こさないことが以前に示されている2%のひずみまで引き伸ばす必要があるため、線形弾性率18。特に、コア//内皮細胞集合体を、2%ひずみ(線弾性領域のほぼ端部)または6%ひずみ(ほぼ最大ひずみ)にクランプ手順に曝露した。結果として生じる微小損傷は、手順の前後に線形弾性率を測定することによって評価されました(図4C)。 単培養のコア外植片を利用して以前に実施された実験に沿って、コア//内皮細胞集合体は、準恒常性ニッチ条件(29°C、3%O2)で培養し、2%以下の菌株に曝露した場合、少なくとも14日間線形弾性率を保持しました18,21。機械的ベースライン刺激に関しては、クランプを通して適用される静的伸張は、生体内の腱コアユニットが経験する天然のひずみレベルを十分に模倣し、マトリックスの荷降ろしに一般的に関連する異化プロセスを防ぐように思われた87。実際、6%のひずみに曝露されたコア//内皮細胞集合体で観察された線形弾性率の漸進的かつ統計的に有意な低下は、機械的に誘発されたマトリックスの微小損傷に起因するマトリックスのアンロードに起因する可能性があります。 これらの実験を行う際には、集合体の乾燥を防ぐことが重要です。ここでは、オートクレーブ処理して湿らせた紙で包んだが、使用する延伸装置との相性によっては、他の方法も実行可能である可能性がある。金属クランプとコア外植片の間の摩擦は限られているため、クランプ中に金属とコア外植片の間に小さな紙片を追加して滑りを防ぎ、伸張プロセスを注意深く監視して、滑り落ちたコア外植片と集合体を検出して除外します。 コンパートメント特異的トランスクリプトームおよび集合体特異的セクレトーム解析(図5 および 図6)ここで紹介する最初のコア単培養実験では、外植片単離後のコア遺伝子発現の安定性を評価して、単離を実験効果から切り離しました(図5A)。正確な結論を出すには、より高い反復数が必要ですが、病変様ニッチ条件(37°C、20%O2)で培養した場合、新たに単離されたコア外植片では、外植片の単離後数時間以内にVegfaおよびNmpsの発現が強く増加しました。 血管新生は、腱疾患と修復の中心的な特徴であり、部分的には、低酸素下で腱コアから分泌される血管新生促進因子(すなわち、血管内皮増殖因子、Vegfa)によって活性化された内皮細胞によって引き起こされる可能性があります88。この潜在的なクロストークの最初のステップ(図5B)を調べると、Vegfaと低酸素マーカー炭酸脱水酵素9(Ca9)の両方の発現が、高酸素濃度(20%O2)下で単培養された外植片とは対照的に、低酸素圧(3%O2)で単培養された外植片で統計的に有意に増加していることがわかりました).一方、酸素濃度の低下は、強膜(Scx)やコラーゲン-1(Col1a1)などの腱線維芽細胞マーカーの発現に変化をもたらさなかったようです。これらの結果を総合すると、コア常在細胞が低酸素ニッチにおける血管新生促進性シグナル伝達に寄与する可能性が高いことが特定された。 次に、高酸素濃度(20%O2)および低酸素(3%O2)下でのコア//内皮細胞集合体共培養において、血管新生促進性コアシグナル伝達による内皮細胞の活性化を評価した。幸いなことに、集合体のモジュラー組成により、コア外植片を外因性コラーゲンハイドロゲルから物理的に分離することにより、培養後にコンパートメント特異的なトランスクリプトーム解析が可能になります(図6A)。コア外植片(図6D)では、低酸素圧下で ベグファ の発現が再び増加することが確認されましたが、 Fgf2 などの他の低酸素マーカーへの影響はあまり明確ではなく、正確な結論を得るにはより高い反復数が必要です。さらに、 Tnf-α などの炎症誘発性マーカーや Mmp3 などの細胞外マトリックス分解マーカーの発現は、低酸素血圧下でコアで減少しました。最初に内皮細胞を播種した外因性ハイドロゲル(図6E)では、生きたコア外植片(aC)の存在により、低酸素圧下で はVegfa の発現が低下しましたが、高酸素圧下では減少しませんでした。さらに、低酸素圧下での失活(dC)コア外植片の存在も、 ベグファ の発現を減少させませんでした。低酸素圧下では、外因性ハイドロゲル中の Tnf-α 発現はaC/dC付近で同等であったが、生きたコア外植片周辺の高酸素張下では増加した。 Fgf2 の発現は、高酸素圧下で失活したコア外植片の周囲で培養した外因性内皮細胞を含むハイドロゲルと比較して、すべての条件で減少しましたが、ほとんどは低酸素圧下で減少しました。 Mmp3 の発現は、高酸素圧下では生きたコア外植片の周辺で最も高く、低酸素圧下では失活したコア外植片の周辺で最も低かった。全体として、共培養された内皮細胞は、クロストークを開始できる活性コア外植片と酸素レベルの変動の両方に応答するようです。より包括的なトランスクリプトーム解析は、それぞれの寄与の解明を容易にするでしょう。 集合体システムのモジュール性により、蛍光レポーター遺伝子を含む遺伝子改変細胞の統合が可能になります。ここで、Pdgfb−iCreER mGマウス89から単離された内皮細胞をヒドロゲル区画に播種した。これらの細胞は、内皮細胞マーカーである血小板由来成長因子サブユニットb(Pdgfb)と増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を共発現するため、Pdgfbを発現する内皮細胞は顕微鏡下で緑色に見えます(図6C)。この方法を用いて、Pdgfbを発現する内皮細胞の存在は、培養(37°C)中で7日間にわたって維持され、酸素張力とは無関係であるように見えた(3%O2に対して20%O2)。 集合体のセクレトームを分析するために、コア//無細胞およびコア//線維芽細胞、コア//マクロファージ、またはコア//内皮細胞共培養にそれぞれ使用した培地を無血清培地に交換し、セクレトームで濃縮した上清を吸引および凍結する3日前に、無血清培地と交換しました(図6A)。この濃縮時間は、病変様ニッチ条件で培養したコア外植片およびコア//線維芽細胞群集体について、MSDアッセイで血管内皮増殖因子(VEGF)などのサイトカインを検出するのに十分でした(図6B)。 コア外植片および集合体のセクレトームおよびトランスクリプトームを解析する際の重要な考慮事項は、適切なコントロールの使用に関するものです。単離したばかりのコア外植片は、特にVegfaとMmpsの発現が単離後数時間以内に強く増加するため、その価値は限られています(図5A)。初期無細胞のハイドロゲルで囲まれた時間一致外植片は、コアコンパートメント遺伝子発現のコントロールとしてより適しています。外因性ハイドロゲルについては、コア外植片なしで培養した細胞含有ハイドロゲルは、主に細胞形態を大きく変化させる細長いハイドロゲルではなく、丸みを帯びた形状に圧縮するため、コア外植片なしで培養した細胞含有ハイドロゲルと比較して劣った対照です(補足ファイル7)。 図1: in vivo クロストークをモデル化するためのアッセンブロイド成分の単離と組み立て。 マウスの尾部から腱芯外植片を抽出し、切断し、クランプした。マウスの脚の筋肉(大腿四頭筋(QF)、腓腹筋(G)、前脛骨筋(TA))を消化して内皮細胞を単離し、組織培養プラスチック上で培養しました。アキレス腱(AT)も消化して腱線維芽細胞を単離し、組織培養プラスチック上で培養しました。脛骨と大腿骨の骨髄が骨から洗い流されました。次に、単離された単球を組織培養プラスチック上で培養し、ナイーブマクロファージに分化させました。光学顕微鏡画像(10倍)は、コア外植片、内皮細胞、腱線維芽細胞、およびマクロファージが集合体に組み込まれる直前の外観を示しています。組み立て中、プラスチック上で培養した細胞を懸濁液に入れ、コラーゲン-1溶液(1.6 mg/mL)に播種しました。次に、細胞-ヒドロゲル混合物をクランプしたコア外植片の周囲にキャストし、37°Cで50分間重合させてから培地を添加しました。培養条件は、クランプ(機械的張力)とインキュベーターの設定(酸素濃度、温度)によって制御しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:細胞集合体成分の特性評価。 (A)1継代(P1、上段)および2継代(P2、下段)後の筋肉由来内皮細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。未染色(灰色)およびCD31染色(緑色)細胞のカウントは、モダール細胞に正規化しました。パーセンテージは、CD31染色されたグループについて示されています。(B)アキレス腱由来線維芽細胞の1継代(P1、上段)および2継代(P2、下段)後の代表的なフローサイトメトリー解析。軸は、未染色の細胞(灰色)と、ScxGFPを発現しCD146抗体で染色された細胞(虹色)の両方の蛍光強度を報告します。(C)培養後の骨髄由来マクロファージの代表的なフローサイトメトリー解析。一番上の行では、未染色(灰色)およびF4/80染色(緑)の細胞の数をモダール細胞に正規化しました。パーセンテージは、F4/80染色群について示されています。下段のグラフは、未染色細胞(灰色)とCD206抗体およびCD86抗体で染色された細胞のF4/80+ サブセット(虹色)の蛍光強度を報告しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:集合体のイメージングと外観。 (A)培養の0日目(d0)および21日目(d21)に撮影された代表的な写真(37°C、20%O2)は、コア外植片が埋め込まれていない外因性線維芽細胞を含むヒドロゲルの多次元収縮と、コア外植片の周りの外因性線維芽細胞を含むヒドロゲルの強い半径方向の圧縮を示しています。(B)培養21日目(d21)に撮影された代表的な写真(37°C、20%O2)は、無細胞ハイドロゲル、コア外植片の周囲にキャストされた無細胞ハイドロゲル、およびコア外植片の周りにキャストされた腱線維芽細胞を含むハイドロゲルの間の圧縮速度の違いを示しています。(C)培養(37°C、20%O2)の0日目(d0)および21日目(d21)に撮影された代表的な光学顕微鏡画像(10倍)は、コア//無細胞およびコア//線維芽細胞集合体共培養におけるコア外植片(E)の周りのコラーゲンヒドロゲル(HG)の細胞集団の存在および圧縮速度の縦方向の変化を示しています。模式図は、コア//無細胞集合体とコア//線維芽細胞集合体共培養との間のヒドロゲル圧縮の違いを描写する。(D)コア//内皮細胞、コア//マクロファージ、およびコア//線維芽細胞群生体共培養(37°C、20%O2)の7日目(d7)に撮影された代表的な共焦点顕微鏡画像。左段の画像は、青色に染色された細胞核(DAPI)とピンク色に染色された死細胞(エチジウムホモ二量体-1)の集合体を示しています。他の2つの行は、青色(DAPI)で染色された細胞核と緑色(F-アクチン)で染色されたアクチンフィラメントを持つ集合体を示しています。(E)共培養の1日目(d1)および7日目(d7)におけるコア//内皮細胞集合体の定量的生存率を示す箱ひげ図。N = 5 です。上部と下部のヒンジは第1四分位数と第3四分位数(25パーセンタイルと75パーセンタイル)に対応し、中央のヒンジは中央値に対応します。ひげは、上下のヒンジから四分位範囲の1.5倍以内の最大値/最小値まで伸びます。p値:n.s.p>0.05。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:集合体の機械的刺激と集合体の機械的特性の測定。 (A)クランプホルダープラットフォーム、力センサー、ステッピングモーターで構成されるカスタムメイドの延伸装置のグラフィカルな描写。写真画像は、クランプで延伸装置に取り付けられた集合体を示しています。スケールに使用した15mLプラスチックチューブ(Ø:17mm)の蓋。(B)コア外植片(水色)と集合体(薄赤)の代表的な応力/ひずみ曲線を示すグラフ。線形弾性率(α)、最大応力(β)、および最大ひずみ(у)をデータから抽出して、コア外植片または集合体を機械的に特徴付けることができます。(c)実験開始時にクランプ(実線)、クランプして2%L0ひずみ(点線)、またはクランプして6%L0ひずみ(破線)にクランプして伸ばした後、14日間の経時経過にわたってコア//内皮細胞集合体の線弾性率(Emod)を示すグラフ。N = 5 です。データポイントは、ストレッチ前の初期弾性率線弾性率に正規化され、すべて平均(±sem)として表示されます。p値: *p < 0.05, **p < 0.01.この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:異なるニッチ条件下での単離および培養後のコアトランスクリプトームの変化。 (A)単離(37°C、20%O2)マウスコアエクスプラントを尾部から単離した後の2時間、4時間、6時間、8時間後のVegfa、Mmp13、およびMmp3遺伝子発現の倍率変化を示す散布図。それぞれの時点でのフォールド変化は、単離の2時間後に遺伝子発現に正規化されました。N = 2 です。(B)低酸素圧(3%O2)下で単培養したコア外植片のCa9、Vegfa、Scx、およびCol1a1遺伝子発現の倍率変化を正規化し、高酸素圧(20%O2)で単培養したものと比較した箱ひげ図。N = 5-6です。箱ひげ図の上側と下側のヒンジは、第1四分位数と第3四分位数(25パーセンタイルと75パーセンタイル)に対応し、中央のヒンジは中央値に対応します。ひげは、上下のヒンジから四分位範囲の1.5倍以内の最大値/最小値まで伸びます。正規化に使用されるデータポイントは黒い点で示され、個々のデータポイントは赤い点で表されます。p値: **p < 0.01、***p < 0.001。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:集合体特異的セクレトームおよびコンパートメント特異的トランスクリプトーム解析。 (A)セクレトームおよびトランスクリプトームサンプルを採取した7日目(d7)の集合体を示す代表的な写真と、その基礎となるワークフローの描写。(B)箱ひげ図として描かれた7日間の共培養(37°C、20%O2)後のコア//無細胞およびコア//線維芽細胞群集の上清中のVEGF濃度(pg / mL)。N = 6 です。(C)高酸素圧(20%O2)および低酸素圧(3%O2)下での7日間の共培養(37°C)後のコア//内皮細胞集合体の代表的な共焦点顕微鏡画像。細胞核は青色(DAPI)で染色され、包埋された内皮細胞は、内皮細胞マーカーである血小板由来成長因子サブユニットb(Pdgfb)とともに増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を共発現します。点線は、コア外植片(E)と内皮細胞を含有するヒドロゲル(HG)との間の区画界面を示す。(D)低酸素圧(3%O2)下で共培養したコア//内皮細胞集合体からコアコンパートメントにおけるVegfa、Tnf-α、Fgf2、およびMmp3遺伝子発現の倍率変化を標準化し、高酸素濃度(20%O2)で培養したものと比較した散布図。N = 2 です。(E)高酸素濃度(20%O2)および低酸素血圧(3%O2)下で共培養された生きたコア(aC)または活力除去されたコア(dC)を有するコア//内皮細胞集合体の外因性区画におけるVegfa、Tnf-α、Fgf2、およびMmp3遺伝子発現の倍率変化を示す散布図).それぞれの条件におけるフォールド変化は、高酸素張力(20%O2)下で共培養された失活コア(dC)を有するコア//内皮細胞集合体の外因性区画に正規化された。N = 3-4 です。Bでは、箱ひげ図の上側と下側のヒンジは第1四分位数と第3四分位数(25パーセンタイルと75パーセンタイル)に対応し、中央のヒンジは中央値に対応します。ひげは、上下のヒンジから最大値/最小値まで伸びており、四分位範囲の1.5倍を超えません。外れ値は黒い点で表されます。p値: *p < 0.05。DとEでは、正規化に使用されるデータポイントは黒い点で表され、個々のデータポイントは赤い点で表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 表1:腱疾患および損傷モデルシステムの入力要件。 一次腱疾患のトリガーと二次ドライバーのリストは、腱疾患と損傷のモデリングの中心となる扱いやすさが中心となる入力パラメータの選択と一致します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表2:腱疾患および損傷モデルシステムの出力要件。 腱疾患の特徴の選択は、定量化可能性が腱疾患および損傷モデルの挙動の解釈の中心となる出力パラメータの選択と一致します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル1:クランプホルダー、取り付けステーション、およびチャンバー金型の.stlファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル2:右クランプホルダーの平面図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル3:左クランプホルダーの平面図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル4:取り付けプラットフォームの平面図 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル5:金属クランプの平面図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル6:無細胞ハイドロゲルの収縮を示す画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル7:活力を失ったコア外植片を示す画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

全体として、ここで紹介するアセンブリー モデル システムには、強調すべきいくつかの重要なステップがあります。第一に、モデルシステムの良し悪しは、そのコンポーネントの品質にかかっています。組み立てプロセスを開始する前に、コア外植片と播種する細胞集団を顕微鏡で確認することが重要です。同様に、単離された細胞集団の表現型をフローサイトメトリーで少なくとも1回確認することも重要です。特に、コラーゲン-1の新しいバッチを初めて使用する場合は、細胞を包埋する前に試運転で架橋速度を確認することが有利です。集合体アセンブリには多くの手作業が必要であり、感染のリスクが高まります。感染のリスクを最小限に抑えるために、層流のある滅菌バイオセーフティフードで作業し、手袋を頻繁に交換し、手袋と作業スペースを80%エタノールで除染します。同様の理由で、3Dプリントされたクランプホルダーを複数回使用しないでください。包埋プロセス自体の前に、早期の架橋を防ぐために、すべてのハイドロゲル成分(架橋溶液、コラーゲン-1溶液)を氷上に保持することが重要です。したがって、架橋溶液のpHが高く、温度が低いため、細胞を架橋溶液に添加したら、迅速に作業する必要があります。コア外植片の乾燥による細胞死を防ぐため、架橋溶液とコラーゲン-1溶液を混合する直前に、クランプしたコア外植片を覆う培地を吸引します。ヒドロゲル内のコア外植片の中央配置を保証するには、わずかに張力がかけられたクランプされたコア外植片の周囲にヒドロゲルをキャストすることが理想的です。これを行うには、ダウエルピンとM3 x 16 mmボルトネジを使用して、クランプホルダーを適切な長さの穴が開いた(3Dプリントされた)プレートセットに固定します。50分の重合時間の後、埋め込まれたコア外植片は、所望の培養条件に応じて再び張力を抜くことができる。培養中に集合体が経験する張力の量は、実験結果に大きな影響を与え、サンプルと条件全体で均一に保たれる必要があります²¹。

それにもかかわらず、実験結果に対する機械的(非)負荷の大きな影響は、特にコア外植片の維持されたマトリックス組成が細胞レベルで複雑なin vivo負荷パターンを再現するはずであるため、ほとんどの組織工学的代替手段に対する集合体モデルの主な利点です⁹⁰。実際には、集合体の線弾性率、最大引張ひずみ、および最大引張応力の測定のみがこれまでに実証されていますが、疲労強度と応力緩和測定のプロトコルは、他の場所で腱コア外植片について説明されており、集合体に適用できるはずです^91,92。生体内のようなローディングパターンに加えて、アッセンブロイドのマルチレベルのモジュール性が最大の利点である可能性があります。個々の培養チャンバーにより、制御可能なニッチ条件(温度、酸素濃度、グルコース濃度、補給、刺激剤、阻害剤、プレートによる静的ストレッチなど)をサンプルごとに個別に設定できます。次に、外因性コンパートメントのマトリックス剛性およびマトリックス組成は、ヒドロゲル組成物を介してカスタマイズ可能であり、例えば、より多くのコラーゲン−3および細胞フィブロネクチンを組み込むことによって、ますます病変する組織微小環境の影響を研究することを可能にするであろう93,94,95。外因性区画で評価された細胞集団は、播種する細胞を選択することで容易に適応可能であるが、確立された遺伝子改変細胞株およびマウス株を活用することにより、腱コア外植片で改変することもできる(すなわち、ScxLin細胞の枯渇)⁹⁶。2つのコンパートメントの異なるマトリックスと細胞組成は、さらに、別の中央腱の特徴であるユニークな区画化された3D構造を提供します1,30,46。

このシステムを使用するときは、結果パラメータの粒度に対するシステムのモジュール性の影響を考慮することが重要です。細胞の増殖とリクルートメントはコンパートメントごとに個別に評価できますが、機械的特性、セクレトーム成分、分解生成物は、現在のところ完全な集合体についてのみ測定可能です。スループットに関しては、適切な訓練を受けた1人で通常の作業日に最大50個の集合体を準備できますが、主なボトルネックはクランプ手順です。読み出し方法の中には相互に排他的なものもありますが、エンドポイントでの細胞集団組成(フローサイトメトリー)、細胞トランスクリプトーム(RT-qPCR、RNAシーケンシング)、またはマトリックスと細胞の分布(免疫細胞化学/蛍光顕微鏡法)のいずれかと同様に、同じサンプルで機械的特性とセクレトーム成分を繰り返し評価することが可能です。以前の出版物では、これらの方法は、病変様ニッチに曝露されたコア//線維芽細胞およびコア//マクロファージ集合体における細胞間、クロスコンパートメント相互作用を広範囲に特徴付けるために展開されています^84,85。この研究では、異なる微小環境刺激下でコア細胞と外因性内皮細胞の間のクロスコンパートメント相互作用を調査する集合体モデルシステムの能力が調査されました。

モデルシステムのモジュール性により、現在の設計反復の次の制限を克服するために必要な、メソッドの将来の改良が可能になります。この研究で発表されたフローサイトメトリー解析と最近発表されたシングルセルRNAシーケンシングデータにより、腱コアに常在する腱細胞とアキレス腱由来の集団は、以前に想定されていたよりも不均一であることが明らかになりました24,34,59,84,97。さらに、最初にコアまたはハイドロゲルに常駐する細胞集団の遊走挙動は、培養中の集合体区画化を曖昧にします。この2つの要因が組み合わさることで、トランスクリプトームの違いを特定の細胞タイプに帰属させ、増殖と遊走ベースのプロセスを分離することは困難です。この制限は、最近のin vivo研究で特徴付けられた健康な腱または病気の腱の細胞組成に基づいて蛍光活性化細胞選別(FACS)でインプット集団を精製し、シングルセルRNAシーケンシングを実施することで読み出しを改善し、顕微鏡検査中にEdU(5-エチニル-2′-デオキシウリジン)染色などの増殖マーカーを統合することで克服できます。

ここで紹介する集合体は、体の他の部分から切り離された病気の臓器をシミュレートする現在利用可能なin vitroシステムのほとんどと弱点を共有しています^98,99。しかし、ここで使用されている培養室ベースのプラットフォームは、異なる臓器を模倣した集合体が接続され、臓器間の相互作用を研究できる多臓器プラットフォームへの統合に適したモデルシステムです。

モデルシステムは、その中核をなす位置齧歯類の腱に基づいており、その結果、独自の欠点があります。第一に、結果の翻訳可能性は、野生型マウスが^腱疾患を発症していないか、または腱疾患に罹患していないことによって妨げられる^8,100,101。腱疾患の側面を示すヒトまたは新たに開発されたマウス系統の組織と細胞を統合することで、この問題を軽減できる可能性がある¹⁰²。ヒトベースの集合体への切り替えは、異なる病変の腱(すなわち、腱炎、腱鞘炎、または腱周囲炎)の患者由来組織を用いた研究を可能にし、よりパーソナライズされた治療プログラムを可能にする治療抵抗性ドナーでさえも可能になるため、特に興味深いものです。第二に、マウス尾腱外植片は過負荷による微小損傷を特にうまく処理しないため、急性腱損傷の研究に対するモデルシステムの適用性が制限されます。

これらすべての理由から、外植片//ハイドロゲル集合体は、ニッチ誘発性微小損傷に応答して、腱コア生物学、マトリックス構造-機能相互作用、および特定の細胞集団間のクロスコンパートメント相互作用を研究するための主要な位置にあります。これらのややハイスループットな研究から得られた知見は、 in vivo 研究と治療法開発に方向性を与える可能性があります。

Materials

0.4 mm x 25 mm injection needle (G27)	Sterican	9186174
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament	Prusa	NA
4% formaldehyde	Roti-Histofix	P087.4
Accutase cell detachment solution	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Amphotericin	VWR	L0009-100
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2	Motic	NA
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel	RS PRO	1871235
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel	RS PRO	1871207
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CD146 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	134703
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	141709
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	102413
CD86 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	105007
Collagenase I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392-100ML
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	7000183
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
DMEM/F12	Sigma	7002211
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel	Accu	HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone	KauPO	09301-004-000001
Endopan 3 Kit	Pan-Biotech	P04-0010K
Endothelial cell growth supplement	Lonza	CC-3162
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30121023
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO	Sigma-Aldrich	46043-1MG-F
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse	BioLegend	123151
Falcon plastic tube (15 mL)	Corning	352096
Falcon plastic tube (50 mL)	Corning	352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa	BD Bioscience	23-11617-02
Gelatin	Invitrogen	D12054
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate	Sigma	Z805939-1EA
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Hydroxyproline assay	Sigma-Aldrich	MAK008
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML	Motic	NA
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate	Wako Chemicals	013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker	Corning	6780-FP
MEM non-essential amino acids	Sigma	7002231
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF)	PeproTech	315-02-50ug
MSD assay	Mesoscale Discovery	various
NucBlue	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nylon mesh strainer cap, 100 µm	Corning	734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer	Prusa	i3 MK3S
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L	Gibco	10010001
Puromycin	Gibco	A1113803
RBC lysis buffer	VWR	786-650
recombinant m-CSF	PeproTech	315-02
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro	Qiagen	74034
Slicing software: PrusaSlicer	Prusa	NA	Version 2.6.0 or higher
Sterile Cell Strainer 100 µm	Fisherbrand	22363549
Surgical scalpel blade No. 21	Swann-Morton	307
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsin-EDTA (0.5 %)	Gibco	15400054