Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Summary

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell’interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all’interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Abstract

Il cancro ovarico è il tumore maligno ginecologico più mortale. L’omento svolge un ruolo chiave nel fornire un microambiente di supporto alle cellule di carcinoma ovarico metastatico, nonché segnali immunomodulatori che consentono la tolleranza al tumore. Tuttavia, abbiamo modelli limitati che imitano da vicino l’interazione tra le cellule tumorali ovariche e i tessuti ricchi di adiposo. Per comprendere ulteriormente i meccanismi cellulari e molecolari attraverso i quali l’omento fornisce un microambiente pro-tumorale, abbiamo sviluppato un modello 3D ex vivo unico dell’interazione cellula tumorale-omento. Utilizzando l’omento umano, siamo in grado di far crescere cellule tumorali ovariche all’interno di questo microambiente ricco di adiposi e monitorare i fattori responsabili della crescita del tumore e della regolazione immunitaria. Oltre a fornire una piattaforma per lo studio di questo microambiente tumorale ricco di adiposi, il modello fornisce un’eccellente piattaforma per lo sviluppo e la valutazione di nuovi approcci terapeutici per colpire le cellule tumorali metastatiche in questa nicchia. Il modello proposto è facile da generare, poco costoso e applicabile alle indagini traslazionali.

Introduction

Il carcinoma ovarico è la neoplasia ginecologica più letale al mondo¹. Il rischio di sviluppare questo tumore nel corso della vita è di circa 1 su 70, con un’età mediana di diagnosi di 63 anni². Le neoplasie ovariche primarie sono classificate istologicamente come epiteliali o non epiteliali. I tumori ovarici epiteliali (EOC) rappresentano oltre il 90% dei tumori e il sottotipo più comune è il carcinoma sieroso di alto grado (HGSC), che rappresenta circa il 70%-80% degli EOC. Attualmente, non esistono metodi di screening efficaci per rilevare precocemente la malattia. Quindi la maggior parte dei pazienti viene diagnosticata in uno stadio avanzato (cioè Fédération Internationale de Gynécologie et d’Obstétrique [FIGO] stadio III o IV) dopo che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale².

Il trattamento standard di prima linea è la chirurgia citoriduttiva per rimuovere tutta la malattia macroscopica visibile, seguita da chemioterapia adiuvante a base di platino per distruggere qualsiasi malattia microscopica residua. Sebbene ci siano stati molti progressi nel trattamento del cancro ovarico negli ultimi due decenni, circa il 70% delle pazienti con malattia avanzata avrà una recidiva entro 3 anni dal trattamento³. Data la prognosi complessivamente sfavorevole di questi pazienti, gli sforzi di ricerca traslazionale in corso e futuri nell’EOC mirano a identificare biomarcatori per la diagnosi precoce, prevenire le metastasi, migliorare le terapie attuali per eludere la resistenza e sviluppare nuovi trattamenti personalizzati per il cancro.

Le metastasi generalizzate all’interno della cavità peritoneale e la chemioresistenza associata sono due delle principali limitazioni per il miglioramento del trattamento delle pazienti con carcinoma ovarico ^4,5. L’omento, una struttura grassa simile a un grembiule che pende dallo stomaco sopra l’intestino, è una delle principali sedi di metastasi del cancro ovarico ^6,7. Oltre alla sua funzione di barriera fisica, è stato dimostrato che l’omento ha capacità rigenerative e angiogeniche e possiede attività immunitarie, che insieme promuovono la vascolarizzazione, accelerano la guarigione delle ferite e limitano le infezioni⁸. Contiene un’alta concentrazione di cellule staminali che possono differenziarsi in vari tipi di cellule e possono aiutare a riparare i tessuti danneggiati. L’omento può infiammarsi in risposta a lesioni o infezioni, che innescano la migrazione delle cellule immunitarie verso il sito della lesione⁹. Queste cellule immunitarie rilasciano fattori di crescita e altre molecole che aiutano a promuovere la riparazione e la rigenerazione dei tessuti danneggiati. Le cellule immunitarie, come macrofagi, linfociti e plasmacellule, localizzate nell’omento sono strutture note come “macchie lattiginose”, responsabili del rilevamento e dell’attacco degli agenti patogeni e della regolazione dell’immunità peritoneale. È stato anche dimostrato che l’omento svolge un ruolo nell’indurre la tolleranza immunitaria¹⁰, che è la capacità del sistema immunitario di tollerare gli autoantigeni e non attaccare i tessuti sani. Tuttavia, le stesse attività immuno-correlate sono coinvolte anche nelle risposte patologiche, come la crescita di tumori omentali, le metastasi e la fuga dalla sorveglianza immunitaria ^9,11. Precedenti studi del nostro laboratorio e di altri hanno dimostrato un ruolo unico e attivo del microambiente adiposo nell’inibizione delle risposte immunitarie antitumorali e nell’acquisizione della chemioresistenza^12,13,14. Purtroppo, abbiamo informazioni limitate sui meccanismi cellulari e molecolari attraverso i quali l’omento fornisce un microambiente pro-tumorale.

Per comprendere meglio le interazioni tra le cellule tumorali e l’omento, è stato sviluppato un sistema di coltura 3D costituito da cellule di cancro ovarico umano ed espianti di omento derivati da pazienti. Il protocollo qui descritto rappresenta un nuovo modello ex vivo di carcinosi peritoneale. Questo modello imita la progressione naturale della tumorigenesi del cancro ovarico in questo tessuto ricco di adiposi. Il modello proposto è facile da generare, poco costoso e potenzialmente applicabile alle indagini traslazionali nella ricerca sul cancro ovarico.

Protocol

Il seguente protocollo di ricerca è stato esaminato e approvato dal Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti prima dell’intervento chirurgico. La Figura 1 illustra i tre passaggi generali di questo protocollo. 1. Preparazione del tessuto di omento umano Preparare il terreno di coltura dell’omento (DMEM/F12 + 10% siero fetale bovino + 1% penicillina-streptomicina…

Representative Results

L’insediamento riuscito delle cellule di carcinoma ovarico in campioni di omento è stato evidente intorno al giorno 14 (Figura 3A-C). Almeno 24 repliche sono state preparate e iniettate per ogni campione raccolto per consentire ulteriori esperimenti. La crescita del tumore è stata monitorata scattando immagini fluorescenti (Figura 3D,E). Le immagini dovevano essere attentamente interpretate poiché un monostra…

Discussion

Utilizzando questo protocollo, è stato sviluppato un modello preclinico di carcinosi peritoneale per il carcinoma ovarico utilizzando una combinazione di tecniche di base in vitro ed ex vivo. Una crescita progressiva del tumore è stata osservata in 50 giorni di co-coltura dopo aver seminato campioni di omento con cellule di carcinoma ovarico umano mCherry+ OCSC1-F2. Questo metodo è stato sviluppato e ottimizzato in diverse prove sperimentali utilizzando diversi campioni di omento. Il successo della c…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo