En ex vivo modell av eggstokkreft peritoneal metastase ved bruk av humant omentum

Summary

Denne protokollen beskriver etableringen av en tredimensjonal (3D) ex vivo-modell for kreftcelle-omentum-interaksjon. Modellen gir en plattform for å belyse protumormekanismer innenfor fettnisjen og for å teste nye terapier.

Abstract

Eggstokkreft er den dødeligste gynekologiske maligniteten. Omentum spiller en nøkkelrolle i å gi et støttende mikromiljø til metastatiske eggstokkreftceller, samt immunmodulerende signaler som tillater tumortoleranse. Vi har imidlertid begrensede modeller som tett etterligner samspillet mellom eggstokkreftceller og fettrikt vev. For ytterligere å forstå de cellulære og molekylære mekanismene som omentumet gir et protumoralt mikromiljø, utviklet vi en unik 3D ex vivo-modell for kreftcelle-omentum-interaksjon. Ved hjelp av humant omentum er vi i stand til å dyrke eggstokkreftceller i dette fettrike mikromiljøet og overvåke faktorene som er ansvarlige for tumorvekst og immunregulering. I tillegg til å gi en plattform for studiet av dette fettrike tumormikromiljøet, gir modellen en utmerket plattform for utvikling og evaluering av nye terapeutiske tilnærminger for å målrette metastatiske kreftceller i denne nisje. Den foreslåtte modellen er enkel å generere, billig og anvendelig for translasjonsundersøkelser.

Introduction

Eggstokkreft er den dødeligste gynekologiske maligniteten over hele verden¹. Livstidsrisikoen for å utvikle denne kreften er^{ca. 1} av 70, med median alder for diagnose ved 63 år 2. Primære maligniteter i eggstokkene klassifiseres histologisk som enten epitelial eller ikke-epitelial. Epitelial eggstokkreft (EOC) representerer over 90% av svulstene, og den vanligste subtypen er høyverdig serøs karsinom (HGSC), som står for omtrent 70% -80% av EOCs. For tiden finnes det ingen effektive screeningmetoder for å oppdage sykdom tidlig. Så de fleste pasienter diagnostiseres på et avansert stadium (dvs. Fédération Internationale de Gynécologie et d’Obstétrique [FIGO] stadium III eller IV) etter at kreften har spredt seg gjennom bukhulen².

Standard førstelinjebehandling er cytoreduktiv kirurgi for å fjerne all synlig makroskopisk sykdom, etterfulgt av adjuvant platinabasert kjemoterapi for å ødelegge eventuell gjenværende mikroskopisk sykdom. Mens det har vært mange fremskritt i eggstokkreftbehandling de siste to tiårene, vil ca 70% av pasientene med avansert sykdom komme tilbake innen 3 års behandling³. Gitt den generelle dårlige prognosen til disse pasientene, har pågående og fremtidig translasjonsforskningsinnsats i EOC som mål å identifisere biomarkører for tidlig deteksjon, forhindre metastase, forbedre nåværende terapier for å unngå resistens og utvikle nye personlige kreftbehandlinger.

Generalisert metastase i bukhulen og tilhørende kjemoresistens er to av de største begrensningene for forbedring av behandlingen av pasienter med eggstokkreft ^4,5. Omentum, en fettforklelignende struktur som henger ned fra magen over tarmene, er et hovedsted for eggstokkreftmetastase ^6,7. I tillegg til sin funksjon som en fysisk barriere, har omentumet vist seg å ha regenerativ og angiogen kapasitet og ha immunaktiviteter, som sammen fremmer vaskularisering, akselererer sårheling og begrenser infeksjon⁸. Den inneholder en høy konsentrasjon av stamceller som kan differensiere i forskjellige celletyper og kan bidra til å reparere skadet vev. Omentum kan bli betent som respons på skade eller infeksjon, noe som utløser migrasjon av immunceller til skadestedet⁹. Disse immuncellene frigjør vekstfaktorer og andre molekyler som bidrar til å fremme reparasjon og regenerering av skadet vev. Immunceller, som makrofager, lymfocytter og plasmaceller, lokalisert i omentumet, er strukturer kjent som “melkeflekker”, som er ansvarlige for å oppdage og angripe patogener og regulere peritoneal immunitet. Omentum har også vist seg å spille en rolle i å indusere immuntoleranse¹⁰, som er immunsystemets evne til å tolerere selvantigener og ikke angripe sunt vev. Imidlertid er de samme immunrelaterte aktivitetene også involvert i patologiske responser, for eksempel vekst av omental svulster, metastase og rømning av immunovervåking ^9,11. Tidligere studier fra vårt laboratorium og andre har vist en unik og aktiv rolle i fettmikromiljøet i inhiberingen av antitumorale immunresponser og i oppkjøpet av kjemoresistens^12,13,14. Dessverre har vi begrenset informasjon om de cellulære og molekylære mekanismene som omentumet gir et protumoralt mikromiljø.

For bedre å forstå interaksjonene mellom kreftceller og omentumet ble det utviklet et 3D-kultursystem bestående av humane eggstokkreftceller og pasientavledede omentumeksplanter. Protokollen beskrevet her representerer en ny ex vivo-modell for peritoneal karsinomatose. Denne modellen etterligner den naturlige utviklingen av eggstokkreft tumorigenesis i dette fettrike vevet. Den foreslåtte modellen er enkel å generere, billig og potensielt anvendelig for translasjonsundersøkelser i eggstokkreftforskning.

Protocol

Følgende forskningsprotokoll ble gjennomgått og godkjent av Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene før operasjonen. Figur 1 illustrerer de tre generelle trinnene i denne protokollen. 1. Fremstilling av humant omentumvev Tilberede omentumdyrkningsmedier (DMEM/F12 + 10 % fosterbovint serum + 1 % penicillin-streptomycin) og oppbevares ved 4 °C. Aliquot 30-40 ml av d…

Representative Results

Vellykket etablering av eggstokkreftceller i omentumprøver ble påvist ca. dag 14 (figur 3A-C). Minst 24 replikater ble fremstilt og injisert per innsamlet prøve for å tillate videre eksperimentering. Tumorvekst ble overvåket ved å ta fluorescerende bilder (figur 3D,E). Bilder måtte tolkes nøye, da det også vokste et monolag av kreftceller i bunnen av hver brønn som ikke var festet til omentumet. Vi for…

Discussion

Ved hjelp av denne protokollen ble en preklinisk modell av peritoneal karsinomatose for eggstokkreft utviklet ved hjelp av en kombinasjon av grunnleggende in vitro og ex vivo teknikker. En progressiv tumorvekst ble observert over 50 dager med samkultur etter såing av omentumprøver med mCherry+ OCSC1-F2 humane eggstokkreftceller. Denne metoden ble utviklet og optimalisert på tvers av flere eksperimentelle forsøk ved bruk av forskjellige omentumprøver. Vellykket tumorvekst var avhengig av kvaliteten …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle	BD	329652
10 mL Serological Pipets	CELLTREAT	229010B
100 mm Tissue Culture Dish	Fisherbrand	FB012924
15 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229411
24 Well Cell Culture Plate	Costar	3524
50 mL Centrifuge Tube	CELLTREAT	229421
75 cm2 Tissue Culture Flask	CELLTREAT	229341
Corning Cell Counter	Corning	9819000
Cytation 5 imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate	Gibco	11320033
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel	Integra-Miltex	4410
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve microscope	Echo