Summary
Forniamo un protocollo per un modello sperimentale di shock endotossiemico nei suini mediante infusione di lipopolisaccaride.
Abstract
La sepsi e lo shock settico sono frequentemente riscontrati nei pazienti trattati nelle unità di terapia intensiva (UTI) e sono tra le principali cause di morte in questi pazienti. È causata da una risposta immunitaria disregolata a un'infezione. Anche con un trattamento ottimizzato, i tassi di mortalità rimangono elevati, il che rende necessarie ulteriori informazioni sulla fisiopatologia e sulle nuove opzioni di trattamento. Il lipopolisaccaride (LPS) è un componente della membrana cellulare dei batteri gram-negativi, che sono spesso responsabili di infezioni che causano sepsi e shock settico.
La gravità e l'elevata mortalità della sepsi e dello shock settico rendono impossibili studi sperimentali standardizzati sull'uomo. Pertanto, è necessario un modello animale per ulteriori studi. Il maiale è particolarmente adatto a questo scopo in quanto assomiglia molto agli esseri umani nell'anatomia, nella fisiologia e nelle dimensioni.
Questo protocollo fornisce un modello sperimentale per lo shock endotossiemico nei suini mediante infusione di LPS. Siamo stati in grado di indurre in modo affidabile i cambiamenti frequentemente osservati nei pazienti con shock settico, tra cui l'instabilità emodinamica, l'insufficienza respiratoria e l'acidosi. Ciò consentirà ai ricercatori di ottenere preziose informazioni su questa condizione altamente rilevante e valutare nuovi approcci terapeutici in un contesto sperimentale.
Introduction
La sepsi e lo shock settico sono tra le principali cause di mortalità nei pazienti sottoposti a trattamento in terapia intensiva 1,2,3. La sepsi si verifica quando un'infezione innesca una risposta immunitaria disregolata con conseguente insufficienza multiorgano. È caratterizzata da sintomi potenzialmente letali, tra cui instabilità emodinamica, distress respiratorio, insufficienza epatica e renale, nonché deterioramento cognitivo 4,5. Lo shock settico rappresenta un sottogruppo di sepsi con sintomi particolarmente gravi che aumentano significativamente la mortalità. Questi sintomi includono ipotensione persistente che richiede una terapia vasopressore e un livello sierico di lattato superiore a 2 mmol∙L-1 4,5. I tassi di mortalità nei pazienti con shock settico sono stati stimati fino al 40%, anche con il trattamento ospedaliero 1,3,5.
I batteri Gram-negativi, come Pseudomonas ed Escherichia coli, spesso causano infezioni che innescano questa risposta immunitaria disregolata4. I meccanismi fisiopatologici sottostanti sono complessi e non ancora del tutto compresi. Un aspetto ben descritto riguarda l'attivazione dei recettori Toll-like sulle cellule immunitarie da parte di pattern molecolari associati ai patogeni (PAMPs), che portano al rilascio di citochine come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα) o l'interleuchina 1 (IL 1)4. Uno di questi PAMP è il lipopolisaccaride (LPS), che costituisce un componente della membrana cellulare nei batteri gram-negativi6. LPS è stato impiegato in modelli animali per indurre endotossiemia e shock endotossiemico 7,8.
I modelli animali forniscono un ambiente controllato e standardizzato per sviluppare e studiare nuove strategie di trattamento. Grazie alla sua anatomia simile, alla fisiologia immunologica e ai parametri emodinamici comparabili, il modello suino è particolarmente adatto per studiare gli effetti dello shock endotossiemico 9,10. Inoltre, le apparecchiature mediche standard comunemente utilizzate nei pazienti umani possono essere facilmente applicate nei suini grazie alle dimensioni simili delle loro vie aeree e dei loro vasi sanguigni, facilitando la strumentazione e il monitoraggio emodinamico.
Con questo protocollo, forniamo un modello sperimentale per lo shock endotossiemico nei suini mediante infusione endovenosa di LPS derivato da E. coli. Per monitorare gli effetti, sono stati misurati i parametri emodinamici e polmonari, tra cui la pressione arteriosa, la frequenza cardiaca, la saturazione periferica di ossigeno, la pressione arteriosa polmonare e la pressione delle vie aeree. Per valutare l'influenza dell'endotossiemia sull'apporto di ossigeno cerebrale, abbiamo utilizzato la spettrometria nel vicino infrarosso (NIRS). Con questo metodo, la saturazione di ossigeno cerebrale può essere valutata tramite un elettrodo adesivo applicato sulla fronte11.
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Protocol
Gli esperimenti di questo protocollo sono stati approvati dal Comitato statale e istituzionale per la cura degli animali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblenza, Germania, TVA G21-1-080). Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE. Per questo studio sono stati utilizzati sei suini sani maschi di razza autoctona tedesca di età compresa tra 2 e 3 mesi e del peso di 30-35 kg. La sequenza temporale sperimentale è riassunta nella Figura 1. I dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Figura 1: Cronologia sperimentale. Le misurazioni della salute al basale sono state effettuate dopo la preparazione dell'animale e un periodo di stabilizzazione di 30 minuti. L'endotossiemia è stata indotta dall'iniezione di LPS nell'arco di 30 minuti e sono state effettuate misurazioni di 0 ore dopo altri 30 minuti; Successivamente, le misurazioni orarie sono continuate per 4 ore. Abbreviazioni: BLH = basale sano; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Preparazione dell'animale
- Mantieni gli animali nel loro ambiente abituale il più a lungo possibile per ridurre al minimo lo stress. Sospendere il cibo per 6 ore prima della somministrazione dell'anestesia, consentendo il libero accesso all'acqua.
- Sedare gli animali con un'iniezione intramuscolare di azaperone (3 mg∙kg-1) e midazolam (0,5 mg kg-1) mentre sono ancora nel loro ambiente normale.
- Una volta che la sedazione ha effetto, che in genere avviene entro circa 15-20 minuti dalla somministrazione, trasportare i suini in laboratorio.
NOTA: È fondamentale assicurarsi che la sedazione continua sia mantenuta durante tutto il trasferimento; A seconda della legislatura regionale, ciò può richiedere la supervisione permanente di un veterinario. - Prestare molta attenzione al mantenimento della normale temperatura corporea dei suini (~38 °C) durante il trasporto. Ad esempio, prendi in considerazione la possibilità di coprire l'animale con una coperta per prevenire l'ipotermia.
NOTA: È importante limitare il tempo di trasporto per non superare la durata della sedazione, che di solito varia da 30 min a 60 min. - Dopo la disinfezione, stabilire un accesso endovenoso inserendo un catetere da 22 G nella vena auricolare. Prima di procedere con qualsiasi ulteriore movimento del suino o induzione dell'anestesia, assicurarsi che il catetere sia fissato saldamente per evitare lussazioni dovute a movimenti bruschi.
- Monitora continuamente la saturazione periferica di ossigeno utilizzando un sensore agganciato alla coda o all'orecchio.
2. Anestesia e ventilazione meccanica
- Somministrare fentanil per via endovenosa (4 μg kg-1) e propofol (3 mg kg-1) per indurre l'anestesia.
- Metti il maiale in posizione supina.
- Somministrare atracurio (0,5 mg kg-1) come miorilassante e avviare immediatamente la ventilazione non invasiva utilizzando una maschera di ventilazione per cani. Posizionare la maschera sul muso e applicare una pressione decisa con i pollici mentre si tira in avanti la mascella inferiore usando il medio/anulare. Impostare il ventilatore sui seguenti parametri: frazione inspiratoria di ossigeno (FiO2 ) = 100%, volume corrente = 6-8 mL kg-1, pressione espiratoria finale positiva (PEEP) = 5 mbar, pressione inspiratoria di picco ≤ 20 mbar, frequenza respiratoria = 18-20 min-1.
- Mantenere l'anestesia iniziando un'infusione continua di una soluzione elettrolitica bilanciata (5 mL kg-1 h-1), fentanil (10 μg kg-1 h-1) e propofol (6 mg kg-1 h-1).
- Eseguire l'intubazione endotracheale utilizzando un tubo endotracheale standard (ID 6-7 mm), un filo guida e un laringoscopio dotato di una lama Macintosh (misura 4).
- Chiedi a un assistente di aprire la bocca e tenere la lingua sul lato sinistro.
- Inserire la lama Macintosh fino a quando l'epiglottide non è visibile. Quindi, solleva il laringoscopio verso l'alto per muovere l'epiglottide ventralmente e visualizzare le corde vocali. Occasionalmente, l'epiglottide può attaccarsi al palato molle; In questo caso, mobilizzalo scorrendo delicatamente lateralmente con il tubo o un bougie.
- Inserire con cautela il tubo endotracheale attraverso le corde vocali e rimuovere l'induttore. In caso di difficoltà, provare a ruotare il tubo senza applicare una forza eccessiva. Se necessario, utilizzare un tubo più piccolo. Una volta che la provetta è in posizione, gonfiare il bracciale con 10 ml di aria.
- Collegare il tubo endotracheale al ventilatore e avviare la ventilazione. Confermare il corretto posizionamento del tubo rilevando la CO2 di fine espirazione ed eseguendo l'auscultazione bilaterale. Utilizzare le seguenti impostazioni di ventilazione: FiO2 = 40%, volume corrente = 6-8 mL kg-1, PEEP = 5 mbar, rapporto inspirazione/espirazione = 1:2, frequenza respiratoria = regolata per ottenere un livello di CO2 di fine espirazione di <45 mmHg, in genere 30-40 min-1 .
NOTA: Se il tubo è stato posizionato in modo errato nell'esofago, l'aria gonfierà lo stomaco, causando un rigonfiamento visibile. In questi casi, rimuovere immediatamente il tubo, somministrare una ventilazione non invasiva per 1-2 minuti e riposizionare correttamente il tubo. - Inserire un sondino gastrico per evitare reflusso o vomito. Se l'inserimento si rivela difficile, utilizzare il laringoscopio per ottenere una migliore visione dell'ingresso esofageo.
3. Strumentazione
- Posizionare una linea arteriosa e una venosa centrale rispettivamente nell'arteria e nella vena femorale per il monitoraggio emodinamico e la terapia volumetrica endovenosa.
- Usa bende per ritrarre e fissare le zampe posteriori, fornendo un migliore accesso ai vasi femorali.
- Preparare tutti i materiali necessari prima della strumentazione. Riempi tutti i cateteri con soluzione salina e assicurati un facile accesso a fili e cateteri per ridurre al minimo la necessità di più tentativi di cateterismo e inutili perdite di sangue.
- Applicare un disinfettante alcolico sulla zona inguinale e pulirla con un tampone sterile. Ripeti questo processo due volte. Applicare nuovamente il disinfettante senza strofinare e attendere 3 minuti. Posizionare un telo fenestrato sterile sulla zona inguinale.
- Utilizzare gli ultrasuoni per identificare i vasi sanguigni femorali. Utilizzare una tecnica di Seldinger guidata da ultrasuoni in piano per il cateterismo per ridurre al minimo il danno tissutale e la perdita di sangue.
- Visualizzare l'arteria femorale longitudinalmente. Perforare l'arteria con una siringa attaccata all'ago per l'aspirazione continua. Il sangue pulsante di colore rosso vivo conferma la puntura arteriosa. Rimuovere la siringa e inserire il filo preparato. Rimuovere l'ago lasciando il filo in posizione.
- Ripetere la stessa procedura per la vena femorale. La puntura venosa è confermata da sangue rosso scuro a flusso lento.
- Confermare il corretto posizionamento di entrambi i fili visualizzando entrambi i vasi femorali utilizzando gli ultrasuoni.
- Utilizzare la tecnica di Seldinger per inserire prima la guaina introduttrice arteriosa, seguita dalla guaina introduttrice venosa. Confermare il corretto posizionamento attraverso l'emogasanalisi dei campioni di sangue prelevati dalle due linee.
- Assicurarsi che il sangue possa essere aspirato da tutte le linee. Sciacquare tutte le linee con soluzione salina per evitare la formazione di coaguli.
- Fissare saldamente le linee alla pelle utilizzando suture chirurgiche per prevenire la lussazione.
- Collegare le linee arteriose e venose centrali ai trasduttori per la misurazione dei parametri emodinamici.
- Inserire un catetere per gittata cardiaca a contorno di impulsi (PiCCO) nella guaina dell'introduttore arterioso e collegarlo al trasduttore di pressione arteriosa e al cavo di interfaccia della temperatura del monitor PiCCO.
- Collegare un catetere Swan-Ganz a un trasduttore.
- Durante la misurazione continua della pressione, inserire il catetere nella guaina dell'introduttore venoso centrale. Gonfiare il palloncino dopo circa 30 cm, quando diventa visibile una curva di pressione venosa centrale.
- Far avanzare lentamente il catetere monitorando la curva di pressione. Quando il catetere entra nel ventricolo destro, cercare una curva del polso con un valore sistolico alto e diastolico basso. L'ulteriore avanzamento del catetere si tradurrà in un valore sistolico costante e in un aumento del valore diastolico, indicando il posizionamento nell'arteria polmonare.
- Fissare il catetere in questa posizione (di solito tra 50 e 70 cm). Collegare il sensore di temperatura iniettato del sistema PiCCO al lume prossimale del catetere Swan-Ganz.
- Radere la fronte del maiale e applicare l'elettrodo adesivo del sensore per misurare la saturazione di ossigeno regionale cerebrale.
- Dopo l'induzione dell'anestesia e la strumentazione, lasciare che l'animale si stabilizzi per 30 minuti o fino a quando i parametri emodinamici non si sono stabilizzati prima di eseguire le misurazioni di base e indurre lo shock endotossiemico.
4. Induzione d'urto
NOTA: Quando si lavora con LPS, indossare sempre guanti, occhiali protettivi, una maschera e un camice da laboratorio. Evitare il contatto diretto con l'LPS.
- Preparare una soluzione di LPS con una concentrazione di 100 μg mL-1 sciogliendo 5 mg di LPS in 50 mL di NaCl allo 0,9%.
- Ottenere misurazioni emodinamiche al basale immediatamente prima di iniziare l'infusione di LPS.
- Somministrare una dose di 150 μg kg-1 di LPS per 30 minuti (equivalente a una velocità di infusione continua di 300 μg kg-1∙h-1 per 30 minuti).
- Dopo 30 minuti, ridurre la velocità di infusione a 15 μg∙kg-1∙h-1 per il resto dell'esperimento.
- Monitora continuamente i parametri emodinamici, tra cui la pressione arteriosa arteriosa e polmonare, la frequenza cardiaca e i parametri di ventilazione. Monitorare continuamente la temperatura corporea per mantenere la normotermia.
5. Trattamento dell'instabilità emodinamica
- Quando la pressione arteriosa media scende al di sotto di 60 mmHg, utilizzare PiCCO per misurare l'indice cardiaco (CI), l'indice globale del volume telediastolico (GEDI) e l'indice di acqua polmonare extravascolare (ELWI). Trattare la pressione bassa secondo le raccomandazioni nel diagramma di flusso nella Figura 2.
- Sul monitor PiCCO, premere il pulsante di termodiluizione (TD).
- Premere il pulsante per l'ingresso della pressione venosa centrale (CVP) e inserire il valore CVP corrente.
- Premere il pulsante Start .
- Quando richiesto, iniettare 10 mL di soluzione salina fredda nel sensore di temperatura iniettato collegato al catetere Swan-Ganz.
NOTA: Non iniettare nient'altro direttamente prima o durante la misurazione di PiCCO in quanto ciò comprometterebbe la misurazione.
- Dopo aver ottenuto le misurazioni per CI, GEDI ed ELWI, trattare l'instabilità emodinamica secondo il diagramma di flusso nella Figura 2. Se si consiglia il carico volumetrico, infondere rapidamente 200 mL di soluzione elettrolitica bilanciata. Se si raccomanda la terapia con catecolamine, aumentare la velocità di infusione di noradrenalina di 1 μg kg-1 h-1.
- Ripetere questo processo ogni volta che la pressione arteriosa media scende al di sotto di 60 mmHg. In caso di grave instabilità emodinamica, optare per una rapida escalation della terapia.
Figura 2: Terapia dell'instabilità emodinamica guidata da PiCCO. Dopo aver ottenuto le misurazioni per CI, GEDI ed ELWI, applicare il trattamento secondo la tabella. Questa figura è stata adattata dal manuale d'usoPiCCO 12. Abbreviazioni: PiCCO = gittata cardiaca a contorno di pulsazioni; V+ = caricamento del volume; gatto = terapia con catecolamine; V- = riduzione del volume; CI = indice cardiaco; GEDI = indice globale del volume telediastolico; ELWI = indice di acqua polmonare extravascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Fine dell'esperimento ed eutanasia
- Iniettare 0,5 mg di fentanil per via endovenosa. Attendere 5 min. Iniettare 200 mg di propofol.
- Sopprimere il maiale con un'iniezione rapida di 40 ml di cloruro di potassio 1 M attraverso la linea venosa centrale.
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Representative Results
Per questo studio, sei suini maschi sani di età compresa tra 2 e 3 mesi e del peso di 30-35 kg sono stati anestetizzati e hanno ricevuto un'infusione di lipopolisaccaride (LPS) per indurre endotossiemia. Per determinare il dosaggio appropriato di LPS necessario per indurre costantemente i sintomi dello shock, ai suini sono state somministrate varie dosi di induzione di LPS che vanno da 100 μg kg-1 a 200 μg kg-1 per un periodo di 30 minuti, seguite da una dose di mantenimento di 1/10 della dose iniziale all'ora per il resto dell'esperimento. Tutti gli animali hanno mostrato segni di shock poco dopo l'infusione di LPS. I parametri emodinamici sono stati monitorati utilizzando il sistema PiCCO. Gli animali hanno dimostrato una diminuzione dell'indice cardiaco e un aumento della frequenza cardiaca, indicando instabilità emodinamica durante lo stato di shock. La pressione arteriosa media è diminuita dopo l'infusione di LPS, ma è stata mantenuta al di sopra di 60 mmHg attraverso la rianimazione con liquidi o l'infusione di noradrenalina, se necessario (Figura 3). Il danno polmonare è stato indicato da una diminuzione del rapporto PaO2 FiO 2-1 e da un aumento della pressione dell'arteria polmonare (Figura 4). L'ossigenazione cerebrale è stata misurata utilizzando la spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS) ed è diminuita in seguito all'induzione dello shock (Figura 5). Gli animali hanno anche mostrato acidosi e aumento dei livelli di lattato (Figura 6). Per determinare la significatività è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale con confronti multipli.
Figura 3: Sviluppo dei parametri emodinamici dopo l'infusione di LPS. (A) La pressione arteriosa media è diminuita dopo l'induzione dello shock, ma è stata mantenuta al di sopra di 60 mmHg utilizzando l'infusione di noradrenalina, se necessario. (B) L'indice cardiaco è diminuito e (C) la frequenza cardiaca è aumentata dopo l'infusione di LPS. Vengono mostrate la media e la deviazione standard. *p < 0,05 rispetto alle misurazioni basali. Abbreviazioni: BLH = integrità di base; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sviluppo dei parametri polmonari dopo l'infusione di LPS. (A) Il rapporto PaO2 FiO2-1 è diminuito poco dopo l'infusione di LPS. (B) La pressione di azionamento è aumentata dopo l'induzione dell'urto. (C) Anche la pressione arteriosa polmonare è aumentata durante lo shock. Vengono mostrate la media e la deviazione standard. *p < 0,05 rispetto alle misurazioni basali. Abbreviazioni: BLH = integrità di base; LPS = lipopolisaccaride; FiO2 = frazione inspiratoria di ossigeno; PaO2 = pressione parziale dell'ossigeno nel sangue arterioso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Ossigenazione cerebrale dopo l'infusione di LPS. L'ossigenazione cerebrale misurata tramite spettroscopia nel vicino infrarosso è diminuita dopo l'induzione dello shock con LPS. Vengono mostrate la media e la deviazione standard. *p < 0,05 rispetto alle misurazioni basali. Abbreviazioni: BLH = integrità di base; LPS = lipopolisaccaride; NIRS = spettroscopia nel vicino infrarosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Emogasanalisi arteriosa durante l'endotossiemia indotta da LPS. (A) Gli animali sono diventati più acidotici nel tempo e (B) i livelli di lattato sono aumentati dopo l'infusione di LPS. Vengono mostrate la media e la deviazione standard. *p < 0,05 rispetto alle misurazioni basali. Abbreviazioni: BLH = integrità di base; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo un protocollo per l'induzione dell'endotossiemia sperimentale nei suini attraverso l'infusione di LPS, con l'obiettivo di indurre in modo affidabile i cambiamenti comunemente osservati nella sepsi e nello shock settico. Diversi passaggi critici devono essere considerati in questo protocollo. Un'adeguata sedazione dei suini prima del trasporto è fondamentale per prevenire l'aumento dei livelli di catecolamine indotto dallo stress, che potrebbe potenzialmente compromettere i risultati. L'intubazione dei suini può rappresentare una sfida rispetto agli esseri umani a causa delle caratteristiche anatomiche del loro muso allungato. Per risolvere questo problema, si consiglia l'uso di una lama Macintosh per l'intubazione e il tubo endotracheale deve essere dotato di un induttore dritto. È comune che l'epiglottide aderisca al palato molle e, occasionalmente, può essere necessario un tubo endotracheale più piccolo a causa del restringimento sottoglottico della trachea dell'animale, quindi un tubo in grado di passare attraverso le corde vocali potrebbe essere ancora troppo grande.
Prima dell'infusione di LPS, è essenziale una preparazione precisa della concentrazione di LPS. La somministrazione di una dose più elevata di LPS può provocare una grave instabilità emodinamica e persino la morte, mentre una dose più bassa potrebbe non produrre gli effetti desiderati. Inoltre, va notato che diverse cariche LPS possono mostrare diversi livelli di efficacia. Si consiglia di utilizzare lo stesso addebito LPS per ogni versione di prova. Possono essere condotti studi di determinazione della dose per determinare il dosaggio appropriato per ogni studio. All'inizio dell'infusione di LPS, il monitoraggio continuo dei parametri emodinamici è fondamentale a causa del potenziale di rapida instabilità. Potrebbe essere necessario un intervento tempestivo per gestire eventuali effetti avversi.
PiCCO è stato utilizzato per misurazioni emodinamiche avanzate. Questa tecnologia è spesso utilizzata anche nei pazienti umani trattati in terapia intensiva. È stato sviluppato per gli esseri umani e il suo uso nei maiali può porre alcune sfide. L'area della superficie corporea (BSA) viene utilizzata per il calcolo dei parametri emodinamici. Questo viene calcolato automaticamente quando vengono inseriti l'altezza e il peso del paziente. Sebbene la formula utilizzata qui (per gli esseri umani) non sia ideale per calcolare la BSA dei suini, non c'è, purtroppo, altro modo per entrare nella BSA. Questo problema è stato risolto inserendo un'altezza di 130 cm per i suini in quanto nella nostra esperienza, questo dà i risultati più adeguati per la BSA. Tuttavia, questa limitazione deve essere tenuta presente quando si interpretano i risultati di PiCCO.
Studi precedenti hanno descritto l'uso di LPS per simulare lo shock settico nei suini. In questi studi, sono descritti cambiamenti frequentemente osservati nei pazienti settici come ipotensione, vasodilatazione periferica, aumento della pressione arteriosa polmonare e aumento dell'assorbimento sistemico di ossigeno 13,14,15. Sono stati inoltre descritti metodi alternativi per indurre la sepsi sperimentale e lo shock settico nei suini. Un modello prevede l'induzione di peritonite attraverso la somministrazione intraperitoneale delle feci 16,17,18,19. Un altro approccio è l'iniezione diretta di batteri vivi nel flusso sanguigno degli animali 19,20. Rispetto all'iniezione di LPS, i protocolli che utilizzano la peritonite o la batteriemia per indurre la sepsi sperimentale offrono il vantaggio di un maggiore realismo. Questi metodi inducono una vera e propria condizione settica attraverso l'infezione batterica, mentre l'iniezione di LPS rappresenta solo un singolo aspetto dei meccanismi patogenetici sottostanti.
Tuttavia, anche il metodo di infusione LPS ha i suoi meriti. Rispetto al modello di peritonite, questo protocollo richiede meno sforzo e competenza in quanto prevede solo l'iniezione endovenosa senza la necessità di accesso intraperitoneale. Inoltre, i sintomi dello shock si manifestano più rapidamente rispetto agli altri modelli, consentendo tempi di osservazione più brevi e un ridotto utilizzo delle risorse. Inoltre, i risultati sono altamente riproducibili poiché ogni suino riceve lo stesso dosaggio di LPS. Al contrario, la composizione delle feci somministrate può variare in modo significativo e la crescita batterica è influenzata da fattori incontrollabili19.
Nonostante alcune limitazioni, questo protocollo ha costantemente indotto uno shock endotossiemico, colpendo più sistemi di organi. Abbiamo osservato alterazioni caratteristiche nella funzione polmonare e nell'emodinamica, insieme a livelli elevati di lattato in tutti gli animali trattati con LPS. A causa della continua anestesia profonda durante l'esperimento, non siamo stati in grado di valutare la funzione cognitiva, che è incorporata nel punteggio SOFA utilizzando la scala del coma di Glasgow negli esseri umani. Tuttavia, abbiamo osservato una riduzione dell'ossigenazione cerebrale, suggerendo un potenziale impatto dello shock indotto da LPS sulla funzione cerebrale. Nelle fasi iniziali, la sepsi è spesso associata a una fase iperdinamica caratterizzata da un'elevata gittata cardiaca. A causa della rapida progressione dei sintomi in questo modello, i dati qui presentati non mostrano adeguatamente questa fase iperdinamica. Se questa fase è di particolare interesse, le misurazioni dovrebbero essere effettuate più regolarmente nella fase iniziale dell'esperimento. Un aggiustamento della dose di LPS può aiutare a rallentare lo sviluppo dei sintomi e rendere più facile l'osservazione della fase iperdinamica.
LPS e altre endotossine batteriche sono state precedentemente impiegate per simulare la sepsi in modelli animali di piccola taglia8. Tuttavia, l'utilizzo dei maiali in questo contesto pone alcune sfide rispetto ai modelli animali di piccole dimensioni come i topi. L'allevamento e il mantenimento dei suini richiedono molto più tempo e fatica e possono essere utilizzati meno animali per esperimento. Tuttavia, i modelli animali di grandi dimensioni, in particolare i maiali, forniscono una rappresentazione più realistica del corpo umano. I suini presentano somiglianze con gli esseri umani in termini di anatomia, genoma, dieta e reattività del sistema immunitario 9,10. Un altro vantaggio è la possibilità di ripetere l'analisi dei campioni di sangue. Mentre i modelli di piccoli animali spesso richiedono attrezzature specializzate, le apparecchiature mediche standard comunemente utilizzate nei pazienti umani possono essere applicate ai suini, assomigliando così alla strumentazione e al monitoraggio emodinamico in un ambiente clinico di terapia intensiva. In conclusione, questo protocollo stabilisce un modello sperimentale di endotossiemia nei suini attraverso l'infusione di LPS. Offre un metodo semplice e standardizzato per indurre in modo coerente i cambiamenti frequentemente osservati nei pazienti con shock settico.
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Disclosures
Il dispositivo NIRS è stato fornito incondizionatamente da Medtronic PLC, USA, per scopi di ricerca sperimentale. Alexander Ziebart ha ricevuto un compenso per le lezioni da Medtronic PLC. Nessuno degli autori segnala conflitti di interesse finanziari o di altro tipo. Il manoscritto è stato revisionato e revisionato da ChatGPT® (Python Software, Versione: 24 maggio 2023).
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Dagmar Dirvonskis per il suo eccellente supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atracurium Hikma 50 mg/5mL | Hikma Pharma GmbH, Martinsried | ||
| Azaperone (Stresnil) 40 mg/mL | Lilly Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL | Becton Dickinson S.A. Carretera, Mequinenza Fraga, Spain | syringe | |
| BD Luer Connecta | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB Helsingborg, Schweden | 3-way-stopcock | |
| Curafix i.v. classics | Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Rengsdorf, Germany | Cannula retention dressing | |
| Datex Ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | hemodynamic monitor | |
| Engström Carestation | GE Heathcare, Madison USA | ventilator | |
| Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL | Janssen-Cilag GmbH, Neuss | fentanyl | |
| Führungsstab, Durchmesser 4.3 | Rüsch | endotracheal tube introducer | |
| Incetomat-line 150 cm | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | perfusor line | |
| Intrafix Primeline | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | Infusion line | |
| Introducer sheath 5 Fr. | Terumo Healthcare | arterial introducer | |
| INVOS | Medtronic, Dublin, Ireland | near infrared spectrometry | |
| JOZA Einmal Nitril Untersuchungshandschuhe | JOZA, München, Germany | disposable gloves | |
| Laryngoscope, 45.48.50, KL 2000 | Medicon | Laryngoscope handle | |
| Littmann Classic III Stethoscope | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | stethoscope | |
| LPS (E. coli; Serotype O111:B4) | Sigma-Aldrich, Switzerland | ||
| MAC Two-Lumen Central venous access set | Arrow international inc. Reading, PA, USA | venous introducer | |
| Maimed Vlieskompresse | Maimed GmbH, Neuenkirchen, Germany | Fleece compress to fix the tongue | |
| Masimo LNCS Adtx SpO2 sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | saturation clip for the tail | |
| Masimo LNCS TC-I SpO2 ear clip sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | Saturation clip for the ear | |
| Masimo Radical 7 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | periphereal oxygen saturation | |
| Midazolam 15 mg/3 mL | B.Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Midmark Canine Mask Small Plastic with Diaphragm FRSCM-0005 | Midmark Corp., Dayton, Ohio, USA | dog ventilation mask | |
| Monocryl surgical suture | Johnson & Johnson, Belgium | ||
| B.Braun Melsungen AG, Germany | saline solution | ||
| NaCl 0.9 % | Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH | ||
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH, Nordenstedt, Germany | Alcoholic disinfectant | |
| Original Perfusor syringe 50 mL | B.Braun Melsungen AG, Germany | perfusor syringe | |
| PA-Katheter Swan Ganz 7.5 Fr 110 cm | Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA | Swan-Ganz catheter | |
| Perfusor FM Braun | B.Braun Melsungen AG, Germany | syringe pump | |
| PiCCO catheter | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Potassium chloride 1 M | Fresenius, Kabi Germany GmbH | ||
| Propofol 2% 20 mg/mL (50 mL flasks) | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | ||
| Pulse-contour continous cardiac output System PiCCO2 | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Rüschelit Super Safety Clear >ID 6/6.5 /7.0 mm | Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia | endotracheal tube | |
| Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem | Sonosite Bothell, WA, USA | ultrasound | |
| Stainless Macintosh Größe 4 | Welch Allyn69604 | blade for laryngoscope | |
| Sterofundin | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | Balanced electrolyte solution | |
| Vasco OP sensitive | B.Braun Melsungen AG, Germany | sterile gloves | |
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References
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