Summary
患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。
Abstract
がんの患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、がん細胞株と比較してヒトの疾患をよりよく再現する多機能研究システムです。PDOモデルは、細胞外基底膜抽出物(BME)で患者の腫瘍細胞を培養し、それらを3次元ドームとしてプレーティングすることによって生成できます。しかし、単層培養における表現型アッセイ用に最適化された市販の試薬は、多くの場合、BMEに適合しません。本稿では、PDOモデルをプレーティングし、自動生細胞イメージングシステムを用いて薬物効果を評価する方法について説明する。さらに、速度論的測定と互換性のある蛍光色素を塗布して、細胞の健康状態とアポトーシスを同時に定量化します。イメージ キャプチャは、数日間にわたって一定の時間間隔で行われるようにカスタマイズできます。ユーザーは、個々のZ平面画像または複数の焦点面からの連続画像のZ投影で薬物効果を分析できます。 マスキングを使用して、PDO番号、面積、蛍光強度など、関心のある特定のパラメータが計算されます。細胞毒性物質が細胞の健康、アポトーシス、生存率に及ぼす影響を示す概念実証データを提供しています。この自動キネティックイメージングプラットフォームは、がんのPDOモデルにおける多様な治療効果を理解するために、他の表現型読み出しに拡張することができます。
Introduction
患者由来腫瘍オルガノイド(PDO)は、がんの発生と治療反応を研究するための堅牢なモデルシステムとして急速に浮上しています。PDOは、原発腫瘍の複雑なゲノムプロファイルと構造を再現する3次元(3D)細胞培養システムです1,2。不死化がん細胞株の従来の2次元(2D)培養とは異なり、PDOは腫瘍内の不均一性を捕捉して維持するため3,4、機構研究とトランスレーショナル研究の両方にとって貴重なツールとなります。PDOはますます普及しているモデルシステムになりつつありますが、PDO培養に適合する細胞効果の市販の試薬や分析法は限られています。
治療反応の微妙な変化を解析する頑健な方法がないため、臨床翻訳が妨げられています。3D培養におけるゴールドスタンダードの細胞健康試薬であるCellTiter-Glo 3Dは、細胞生存率の決定要因としてATPレベルを利用しています5,6。この試薬はエンドポイントアッセイに有用ですが、いくつかの注意点があり、最も顕著なのは、アッセイの完了後にサンプルを他の目的に使用できないことです。
生細胞イメージングは、蛍光試薬と組み合わせることで、アポトーシス7,8,9や細胞毒性10など、PDOモデル内のさまざまな細胞の健康状態を定量化できる高度な速度論顕微鏡です。実際、生細胞イメージングは、2Dプラットフォームにおける化合物のハイスループットスクリーニングに不可欠である11,12。Incucyteなどのシステムにより、この技術は手頃な価格になり、さまざまな環境で研究グループが利用できるようになりました。しかし、これらのシステムを3D培養の分析に応用することは、まだ初期段階にあります。
本稿では、マルチプレックス生細胞イメージングを用いて、がんのPDOモデルにおける薬物反応を評価する方法について述べる(図1)。明視野画像の解析により、PDOのサイズと形態の変化を動力学的に監視できます。さらに、アポトーシス用のAnnexin V Red Dyeや細胞毒性用のCytotox Green Dyeなどの蛍光試薬を使用して、細胞プロセスを経時的に同時に定量することができます。ここで紹介する方法は、Cytation 5生細胞イメージングシステム用に最適化されていますが、このプロトコルは、異なる生細胞イメージングプラットフォームに適合させることができます。
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Protocol
ヒト腫瘍標本を用いた研究は、アイオワ大学治験審査委員会(IRB)のプロトコル#201809807によって審査および承認され、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改訂で定められた倫理基準に従って実施された。インフォームドコンセントは、研究に参加したすべての被験者から得られました。選択基準には、がんの診断と腫瘍標本の利用可能性が含まれます。
1. 無傷のPDOを96ウェルプレートにめっきする
- 試薬を調製します。
- 96ウェルプレートを37°Cで一晩予熱し、BMEを4°Cで一晩解凍します。
- 目的のがん種を培養するために最適化された完全なオルガノイド培養培地を調製します。本明細書に示す実験に用いる具体的な培地は、 付表1に記載する。
注:培地成分は、腫瘍の種類によって異なる場合に変更する必要がある場合があります。例えば、オルガノイド培養培地には、婦人科腫瘍に対する100nMのエストラジオールが添加されている13。調製した培地は4°Cで1ヶ月間安定です。長期保存の場合は、培地を50 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。
- オルガノイド培養培地のアリコートを4°Cと37°Cで2つに分けて調製します。 例えば、60ウェルを96ウェルプレートに播種する場合は、6 mLの温かいオルガノイド培養培地と150 μLの氷冷オルガノイド培養培地を使用します。
- オルガノイド洗浄バッファーの調製:1x PBSに10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA、および10 μM Y-27632を添加します。4°Cで保存
- 24ウェルプレートで培養したPDOを回収します。特に断りのない限り、すべてのステップを氷上または4°Cで実行してください。
- 真空ラインシステムを使用して各ウェルから培地を吸引します。
- 500 μLの氷冷オルガノイド洗浄バッファーを加え、1000 μLのピペッターを使用して2〜3回静かにピペットします。プレートを氷上で10分間インキュベートします。
- 各ウェルの内容物を50 mLのコニカルチューブに移します。すべてのPDOが懸濁状態にあることを確認するには、さらに300 μLのオルガノイド洗浄バッファーで各ウェルをすすぎ、50 mLのコニカルチューブに移します。4°C、350 x g で5分間遠心分離します
- 真空ラインシステムを使用してBME/オルガノイドペレットから上清を吸引し、チューブ内に~5 mLを残します。20 mLのオルガノイド洗浄バッファーを加え、10 mLの血清ピペットを使用してペレットを静かに再懸濁します。氷上で10分間インキュベートします。
- 4°C、350 x g で5分間遠心分離します。 PDOペレットを破壊しないように注意しながら、真空ラインシステムで上清を吸引します。
- 96ウェルプレートへのPDOのプレーティング:特に断りのない限り、すべてのステップを氷上で実行してください。
- PDOペレットを適量の氷冷オルガノイド培養培地に再懸濁し、PDO懸濁液を作成します。PDO懸濁液を氷冷した1.5 mL微量遠心チューブに移します。
注:オルガノイド培養培地の量を計算するには、PDOがオルガノイド培養培地とBMEの比率が1:1の比率で5 μLドームに播種されることを考慮して、96ウェルプレートに播種するウェルの数を決定します。例えば、1枚の96ウェルプレートをめっきし、内側の60ウェルのみを使用する場合、必要なPDO懸濁液の総量は300μLになります:150μLのオルガノイド培養培地と150μLのBMEです。BMEの異なる割合で最適な増殖を示すモデルの場合、このステップでBME:培地の比率を変更することができますが、特定のモデルごとにすべてのアッセイで比率を標準化することが重要です。ピペッティングエラーを考慮するには、各成分に10%の量を追加します。 - PDO の数を数えます。
- 2.5 μL の PDO 懸濁液を氷冷した 1.5 mL 微量遠心チューブに移し、2.5 μL の BME と混合します。5 μLの混合物を清潔なガラス顕微鏡スライドに移します。スライドをカバースリップしないでください。混合物はドーム状に固まります。
- 明視野顕微鏡を使用して4倍で可視化します。5 μLの混合物中のPDOの数を数えます。目標は、5μLドームあたり約25〜50個のPDOを持つことです。
注:試験混合物で所望の密度が得られない場合は、オルガノイド培養培地をさらに添加するか、PDO懸濁液を遠心分離し、PDOペレットを少量の氷冷オルガノイド培養培地に再懸濁することにより、PDO懸濁液の最終容量を調整します。このステップでPDOサスペンションがどのように変更されるかに関係なく、ステップ1.5.3のBMEの最終的な比率:PDOサスペンション。1:1 にする必要があります。
- ボアチップの広い200 μLピペッターを使用して、PDO懸濁液を同量のBMEと慎重に混合し、オルガノイド培養培地とBMEの比率が1:1になるようにします。ドームの完全性を損なう気泡は避けてください。
- 20 μL のピペッターを使用して、予熱した 96 ウェルプレートの各ウェルの中央に 5 μL のドームを播種し、内側の 60 ウェルのみに播種します。PDOを均等に分配するために、1.5 mLチューブの内容物をワイドボアチップの200 μLピペッターで定期的にピペッティングします。
- すべてのウェルが播種されたら、プレートに蓋をして静かに反転させます。倒さしたプレートを組織培養インキュベーターで37°Cで20分間インキュベートし、ドームを固化させます。
注:プレートを反転させることで、BME/オルガノイド培養培地ドームが3D構造を保持し、PDO形成に十分なスペースを確保することができます。 - 蓋を立てた状態でプレートをひっくり返し、37°Cで5分間インキュベートします。
- PDOペレットを適量の氷冷オルガノイド培養培地に再懸濁し、PDO懸濁液を作成します。PDO懸濁液を氷冷した1.5 mL微量遠心チューブに移します。
2. マルチプレックス化のための処理と蛍光色素の添加
- BMEドームが96ウェルプレートで固化している間に、蛍光生細胞イメージング試薬の希釈液を調製します。アネキシンV赤色素およびサイトトックス緑色色素をマルチプレックス化するための特異的パラメータを本明細書に記載する。
- 蛍光試薬の調製(-1日目):各ウェルを100 μLの色素投与培地で処理すると仮定して、処理するウェルの数に基づいてオルガノイド培養培地の適切な量を計算します。予め温めたオルガノイド培養培地で色素を所望の濃度に希釈します。
注:必要な培地の総量は、実験によって異なります。ピペッティングエラーを考慮して、最終容量に10%を追加します。例えば、96ウェルプレートの内側の60ウェルを処理するには、6.6 mLの色素を添加した培地を調製します(表1)。 - 各ウェルを100 μLの2x色素投与オルガノイド培養培地で処理します。200 μL の滅菌済み 1x PBS をプレートの外側の空のウェルに加えます。37°Cで一晩インキュベートします。
注:ペリフェラルウェル内のPBSは、内側ウェルからの培地の蒸発を減少させます。 - 薬剤/治療薬の追加(0日目):予熱したオルガノイド培養培地で、ウェルあたり100μLの容量で2倍の濃度で薬剤を調製します。
注:DMSOは、高濃度の細胞に対して毒性を持つ可能性があります。この研究で実施された実験では、0.1%DMSOの濃度を超えていません。薬物に加えて、一部の蛍光試薬はDMSO溶液として配布されています。このような試薬を扱う際には、DMSOの総濃度を考慮することが重要です。 - 100 μLの2x色素添加培地を各ウェルに加えます。泡の作成は避けてください。
3. イメージングパラメータの設定
- プレートをCytation 5に入れます。開ける Gen5 ソフトウェア。[New Task > Imager Manual Mode] をクリックします。[今すぐキャプチャ]を選択し、次の設定を入力します。 フィルター(マイクロプレートを選択)。マイクロプレートフォーマット(ウェル数を選択)。と容器タイプ(プレートタイプを選択)。[Use Lid] と [Use slower carrier speed] をクリックします。[OK] をクリックします。
注:容器の種類:ソフトウェアは、プラスチックのプレートの種類と厚さごとに対物レンズからプレートの底部までの特定の距離に校正されるため、プレートに関する情報を選択するときはできるだけ具体的にしてください。
Slower Carrier Speed: プレートの積み下ろし時にドームが乱れないようにするには、このボックスを選択します。 - BMEドーム全体をイメージ化するZスタックを作成します。
- 表示するウェルを選択します(左パネル、ヒストグラムの下)。
- 明視野チャンネル(左パネル、上)を選択します。[自動公開] をクリックし、必要に応じて [設定] を調整します。
- Zスタックの下部と上部を設定します:[ イメージングモード ]タブ(左側のパネル、中央)を展開します。[ Z-Stack ] チェックボックスをオンにします。コース調整矢印(左パネル、中央)を使用して、すべてのPDOがピントが合わず、ぼやけるまで下方向の調整をクリックします。これをZスタックの一番下に設定します。コース調整矢印を使用して反対方向に繰り返し、Zスタックの上部を設定します。
- Zスタックの設定が他の対象ウェルに適していることを確認するには、別のウェル(左パネル、ヒストグラムの下)を選択し、Zスタックの上部と下部を視覚化します。
- 焦点位置を手動で入力するには、微調整の横にある 3 つのドット (左パネル、上) をクリックします。ウィンドウが開きます。一番上のZスタック値を入力します(左側のパネル中央の [イメージングモード]の下にあります)。一番下のZスタック値についても繰り返します。必要に応じて調整し、手順3.2.3を繰り返して目的のZ範囲をキャプチャします。調整が必要な場合は、別のウェルを選択して設定を確認します。
- 蛍光チャンネルの露出設定を行います。設定は、2つの蛍光チャンネル(GFPおよびTRITC)について記述されています。蛍光チャンネルの具体的な数は、実験と、生細胞イメージングシステムにどの蛍光キューブが設置されているかによって異なります。
注:実験の最後に信号強度が大幅に高くなると予想される場合は、テスト実験を実行して、実験の最後に最適な露出設定を決定し、初期パラメータの設定時に適用できるようにすることを検討する必要があります。- [ イメージングモード ]タブ(左側のパネル、中央)を展開し、[ イメージングの編集]ステップを開きます。ポップアップウィンドウが表示されます。
- [チャネル] で、目的のチャネル数のバブルをクリックします。明視野用に1つのチャンネルを指定し、蛍光チャンネルごとに追加のチャンネルを指定します。この例では、チャンネル 1 = 明視野。チャネル 2 = GFP;チャネル 3 = TRITC。ドロップダウンのカラーメニューを使用して、各チャンネルに適切な設定を選択します。[OK] をクリックして編集ウィンドウを閉じます。
- 各蛍光チャンネルを設定します。
- チャンネルをGFPに切り替えます(左パネル、上)。
- [ 自動露出](左パネル上)をクリックします。[ 露出 ]タブ(左パネル、中央)を展開し、露出設定を調整してバックグラウンド信号を最小限に抑えます。
- 手順3.3.3.3-3.3.3.6に従って、露出設定を [画像モード ]タブにコピーします。
- [Edit Imaging Step]ボックスの横にある[Copy]アイコンをクリックします。[イメージングステップの編集]をクリックすると、別のウィンドウが開きます。
- GFP チャンネルで、露出ラインのクリップボード アイコンをクリックして、イルミネーション、積分時間、カメラ ゲインの設定をチャンネルに追加します。
- TRITCチャネルに対して手順3.3.3.4-3.3.3.5を繰り返します。「 OK 」をクリックしてウィンドウを閉じます。
- イメージの前処理と Z 投影のステップを設定して、イメージの前処理を自動化します。
- カメラアイコン(左パネル、下隅)をクリックします。新しいウィンドウが開きます。
- [処理ステップの追加](左側のパネル、下部)で、[画像の前処理]をクリックします。新しいウィンドウが開きます。
- 「明視野」タブで、「画像前処理を適用」の選択を解除します。
- 「 蛍光チャンネル 」タブごとに、「 画像前処理を適用 」が選択されていることを確認します。「 チャンネル 1 と同じオプションを使用 」の選択を解除し、「 OK」をクリックします。ウィンドウが閉じます。
- [ Add Processing Step] で [Z Projection] をクリックします。新しいウィンドウが開きます。必要に応じて、スライス範囲を調整します(たとえば、Z範囲を狭くします)。[ OK] を選択してウィンドウを閉じます。
- プロトコルを作成します。
- ツールバーの 「画像セット 」をクリックします。プルダウン メニューで、[ この画像セットから実験を作成] をクリックします。 イメージングウィンドウ が閉じ、 手順ウィンドウ が開きます。
注: イメージャー手動モードで 選択したパラメータは、自動的に新しいウィンドウにロードされ、実験的なプロトコルを作成できます。 - 温度と勾配を設定する: 「アクション」見出し(左)の下にある「温度を設定」をクリックします。新しいウィンドウが開きます。Incubator Onを選択し、Temperature(温度)に希望の温度を手動で入力します。次に、[グラデーション]に手動で「1」と入力します。[OK] を選択してウィンドウを閉じます。
注意: 1°Cのグラジエントを作成すると、プレートの蓋に結露が発生するのを防ぐことができます。 - イメージにウェルを指定します。
- [説明]の下の[画像]ステップをダブルクリックします。フルプレート(右隅、上)をクリックします。これにより、[プレート レイアウト] ウィンドウが開きます。
- カーソルを使用して目的の井戸をハイライトします。[ OK] をクリックします。必要に応じて、[ オートフォーカスビニング ]ボックスと [キャプチャビニング ]ボックスをオンにします。「 OK 」をクリックしてウィンドウを閉じます。
注意: ビニングには、上記の手順3.3.3.2で説明したように、露出調整が必要です。この機能が使用される可能性のある特定のシナリオについては、「ディスカッション」セクションを参照してください。
- キネティックイメージングの間隔を設定します。
- [その他]見出し(左)の下にある[オプション]をクリックします。Discontinuous Kinetic Procedureにチェックを入れます。
- [推定合計時間] で、テストの実行時間を入力します(例: 5 日間)。推定間隔(Estimated Interval)で、プレートを画像化する間隔(例:6時間ごと)を入力します。
- 各分析後にPause(一時停止)をクリックし、プレートがインキュベーターに移される時間を確保します。[OK] を選択してウィンドウを閉じます。
- データ削減手順を更新します。
- 「 OK 」をクリックして「 プロシージャー」ウィンドウを閉じます。タブが開き、データ削減手順を更新できます。[ はい] を選択します。 [画像の前処理] をダブルクリックします。さまざまなチャネルをクリックして設定を確認し、[ OK]をクリックします。
- Z Projectionをダブルクリックします。さまざまなチャネルをクリックして、設定を確認します。[OK] をクリックします。次に、もう一度 [OK] をクリックして [データ削減] ウィンドウを閉じます。
- プレート レイアウトを書式設定します。
- プレート レイアウト ウィザードを開き、手順 3.6.2-3.6.3 に従って井戸タイプを指定します。
- ツールバーの[ プレート レイアウト ]アイコン(左隅、上部)をクリックして、 プレート レイアウト ウィザードを開きます。
- 実験で使用した井戸タイプの横にあるチェックボックスをオンにします。 Assay Controls(アッセイコントロール)で、矢印を使用して異なるコントロールタイプの数を入力します。 Next をクリックして、 Assay Control #1 ウィンドウを開きます。
- ステップ3.6.5-3.6.8に従ってアッセイコントロールウェル条件を設定します。
- Assay Control #1 ウィンドウで、Plate Layout ID ボックスにコントロールラベルを入力します。必要に応じて、横のボックスにフルネームを入力します。矢印を使用して、それぞれの制御条件の反復数を選択します。
- コントロール内で複数の濃度または希釈系列を使用する場合は、 希釈/濃度の定義 をクリックし、ドロップダウンメニューを使用して タイプを選択します。各濃度/希釈率の値を表に入力します。
注意: 自動機能は、濃度が一定の増分で変化する場合に使用できます。 - ツールバーの「 色 」タブを選択します。ドロップダウンメニューで、コントロールするテキストの色と背景色を選択します。「 次へ」をクリックします。
- 必要に応じて、追加のコントロールで繰り返します。
- 3.6.10-3.6.12に従ってサンプルウェル条件を設定します。
- [サンプル設定]ページで、サンプルのIDプレフィックス(例:SPL)を入力します。矢印を使用して反復数を選択します。処理濃度の異なるサンプルを使用する場合は、[タイプ]ドロップダウンメニューで[濃度]または[希釈]を選択します。表に希釈率/濃度を入力し、[単位]ボックスに単位を入力します。
- ツールバーの [識別フィールド ] を選択します。目的の カテゴリ名 (サンプルID、薬剤など)を表に入力します。
- ツールバーの「 色 」タブを選択します。治療グループ/サンプルごとに異なる色を選択します。「 終了」をクリックします。これにより、[プレート レイアウト] ページが開きます。
注:左側の数字は、さまざまなサンプル番号と相関しています。 - 手順 3.6.14-3.6.16 に従ってサンプル ID を割り当てます。
- 選ぶ 左パネルからSPL1。カーソルを使用してウェルを選択します。
メモ: 自動選択ツールは、シリアル割り当てボックスで調整できます。反復数とレイアウトの向きを事前に指定することができます。 - 他のサンプルで繰り返して、プレートレイアウトを完成させます。満足したら 、[OK]をクリックします 。
- ファイルツールバーで、サンプルIDを選択します。サンプルID列に、各サンプルの適切な情報(薬剤の種類など)を入力します。OKを押します。
- プロトコルを保存します。
- ツールバーで、[File] > [ Save Protocol as] をクリックします。ファイルを保存する場所を選択します。ファイル名を入力します。「保存」をクリックしてウィンドウを閉じます。
- ツールバーの 「ファイル」>「終了 」をクリックします。 イメージャー手動モード への変更を保存するためのタブが開きます。[ いいえ] を選択します。
- 実験 1 への変更を保存するためのタブが開きます。[ いいえ] を選択します。プロトコル定義を更新するためのタブが開きます。[ 更新] を選択します。ソフトウェアを閉じます。
- ツールバーの 「画像セット 」をクリックします。プルダウン メニューで、[ この画像セットから実験を作成] をクリックします。 イメージングウィンドウ が閉じ、 手順ウィンドウ が開きます。
- プロトコルをBioSpa OnDemandにインポートし、実験のセットアップを完了します。
- BioSpa OnDemand(スケジューリングソフトウェア)ソフトウェアを開きます。
- ソフトウェアで使用可能なスロットを選択します。
- プレートを生細胞イメージングシステムから取り外します。 [引き出しを開く ]をクリックして、スケジューリング ソフトウェアの適切なスロットにアクセスし、プレートを挿入します。[ Close Drawer] をクリックします。
注:この手順は、上記の手順3.5.7でプロトコルを作成した後、いつでも実行できます。ただし、以下のステップ3.6.4.3でタイミングを実行するには、プレートがCytation 5にある必要があります。 - プロトコルをインポートします。
- 「 プロシージャー情報 」タブで、ドロップダウンメニューから「 ユーザー 」を選択します。[プロトコル ] スロットの横にある [ 選択] > [新しいエントリの追加] をクリックします。
- [Protocol] スロットの横にある [Select] をクリックします。これにより、新しいウィンドウが開き、ファイルアーキテクチャ内の目的のプロトコルに移動します。 [開く(Open )] をクリックして、プロトコルをスケジューリング ソフトウェアにインポートします。
- プレートのイメージングに必要な時間を入力します。[ OK ] をクリックして [ Gen5 プロトコル リスト ] ウィンドウを閉じます。
注: この手順は、一度に複数の実験を実行する場合に特に重要です。のイメージングに必要な時間を決定するには、[ Perform a timing run now] をクリックします。[ OK] をクリックします。
- イメージング間隔を設定し、実験をスケジュールします。
- [間隔]で、手順3.5.4で指定したイメージング間隔を入力します。
- 「開始時刻オプション」で、「使用可能な場合」を選択します。「期間」で、「固定」または「連続」を選択します。
注: 次に使用可能な時間にプロトコルを実行する代わりに、特定の開始時刻を指定できます。 [固定期間 ] を選択すると、実験に特定のエンドポイントが設定され、ユーザーは実験期間を指定する必要があります。 継続期間 では、エンドポイントなしで実験を実行でき、ユーザーが実験を停止することによってのみ終了できます。 - [ Schedule Plate/Vessel]をクリックします。これにより、プレート検証シーケンスが開きます。タブが開き、提案された初回読み取り時刻が表示されます。「 はい 」をクリックして、このスケジュールを受け入れます。
4. Gen5ソフトウェアでの画像解析 (図2)
- 画像解析モジュールを開きます。
- Gen5 を開きます。タスク マネージャーで、[実験] > [開く] を選択します。実験を選択してファイルを開きます。ツールバーの[プレート>ビュー]をクリックします。
- [ データ] ドロップダウン メニューを [Z 投影法] に変更します。目的の井戸をダブルクリックします。[ 分析] > [新しい画像分析データ削減ステップを設定する] を選択します。[ OK] をクリックします。
- 細胞解析
- プライマリーマスク
- [Analysis Settings] で、Type: Cellular Analysis and Detection Channel: ZProj[Tsf[Bright Field]](左パネル中央)を選択します。
- [ オプション] をクリックします。これにより、[ Primary Mask and Count ] ページが開きます。[ Threshold ] ボックスで [ Auto ] をオンにして [Apply] をクリックします。[ オブジェクトをハイライト表示 ]ボックス(右パネル下部)をクリックして、指定したしきい値内のオブジェクトを表示します。必要に応じて調整し、対象のオブジェクトを含めます。
注: しきい値の設定は、ピクセル強度に基づきます。たとえば、閾値を 5000 に設定すると、強度が 5000 を超えるピクセルが解析に含まれます。 - [オブジェクトの選択]で、最小および最大のオブジェクト サイズ(μm)を指定します。必要に応じて調整し、細胞の破片/単一細胞を除外します。
注意: PDOのサイズは、モデルやタイプによって大きく異なる場合があります。Gen5ソフトウェアの測定ツールを使用して、各モデルのPDOサイズの最小および最大しきい値を決定します。ユーザーは、薬物治療後の後の時点でPDOフラグメントが除外されるのを防ぐために、測定ツールによって提供される値に対してより小さい最小PDOサイズ閾値を選択することができます。 - 解析をウェルの特定の領域に制限するには、「 画像全体を解析」 の選択を解除し、「 プラグ」をクリックします。 イメージ プラグ(Image Plug )ウィンドウで、ドロップダウン メニューを使用してプラグ シェイプ( Plug shape)を選択します。必要に応じてサイズと位置のパラメータを調整し、関心領域に合わせます。
メモ: プラグ内の PDO の数を最大化すると同時に、バックグラウンドを最小限に抑えるために PDO のない領域を除外することが重要です。レプリケート間で対象オブジェクトの大部分を一貫してキャプチャするプラグサイズを指定します。ドームのエッジも除外するプラグを生成することは、エッジの周りのドームの極端な曲率による光の屈折によって歪んで見える可能性のあるオブジェクトを除外するため、重要です。「 プライマリ エッジ オブジェクトを含める 」の選択を解除して、プラグ内の PDO 全体のみをキャプチャすることもできます。
- 部分母集団分析。サブポピュレーション指定の例を 図3に示します。
- [Cellular Analysis] ツールバーの [Calculated Metrics] をクリックします。[関心のあるオブジェクトレベルの指標を選択または作成]をクリックします(右下隅)。[Available Object metrics] で、関心のある指標 (循環性など) を選択し、[Insert] ボタンをクリックします。[OK] をクリックします。
注:各PDOモデルの形態と密度は、亜集団を区別するために関心のある最良の指標を決定します。 - Cellular AnalysisツールバーのSubpopulation Analysisをクリックします。「追加」をクリックして、新しい部分母集団を作成します。ポップアップウィンドウが開きます。
- 必要に応じて、部分母集団の名前を入力します。 [Object Metrics] で、目的のメトリックを選択し、[ Add Condition] を押します。[ Edit Condition ] ウィンドウで、選択した オブジェクト メトリックのパラメータを入力します。必要に応じて、追加のメトリックで繰り返します。
注意: パラメータは手動で調整するか、ファインダーツールを使用して設定できます。たとえば、瓦礫を除外するには、オブジェクト メトリックとして [面積] を追加し、800 未満のオブジェクトを選択できます。オブジェクト メトリックとしての真円度は日常的に使用され、モデルに応じて 0.2 から 0.5 を超える真円度を持つオブジェクトが含まれます。 - ウィンドウ下部の表で、表示する結果を確認します。[ OK] > [適用] をクリックします。
- 部分母集団内のオブジェクトを表示するには、[ オブジェクトの詳細 ] ドロップダウン メニュー (右側のパネル、中央) を使用して、部分母集団を選択します。パラメータに該当するオブジェクトは、画像内で強調表示されます。
注:プライマリマスクとサブポピュレーションのハイライトカラーを変更するには、[ 設定 ](右パネル、下)をクリックします。 - サブポピュレーション パラメーターを調整するには、[セル解析] ツールバーから [サブポピュレーション解析] ウィンドウを再度開きます。部分母集団を選択し、「編集」をクリックします。[ステップの追加] をクリックします。
注:これにより、実験内のすべてのウェルにすべての時点で同じ分析が適用されます。[マトリックス] ページのドロップダウン メニューでは、個々の表示に対して異なるメトリックを選択できます。
- [Cellular Analysis] ツールバーの [Calculated Metrics] をクリックします。[関心のあるオブジェクトレベルの指標を選択または作成]をクリックします(右下隅)。[Available Object metrics] で、関心のある指標 (循環性など) を選択し、[Insert] ボタンをクリックします。[OK] をクリックします。
- プライマリーマスク
5. Gen5 から Excel へのデータのエクスポート
- エクスポートするデータ・ファイルをカスタマイズするには、ツールバーの 「レポート/エクスポート・ビルダー」 アイコンを選択します。ポップアップウィンドウで、[ Excelへの新規エクスポート]をクリックします。
- ポップアップ ウィンドウの [プロパティ ] ページで、[ プレート>スコープ] と [カスタム>コンテンツ] を選択します。ツールバーの[ コンテンツ ]オプションをクリックします。[ テンプレートの編集] をクリックすると、Excel プログラムが開きます。
- スプレッドシート内で、[ Add-ins > Table > Well Data (井戸データのテーブルアドイン)] を選択します。さまざまな選択にカーソルを合わせると、エクスポートのオプションが表示されます。関心のあるメトリックを選択します(例:Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]])。
注: プレート レイアウトは、[ アドイン] > [プロトコルの概要] > [レイアウト] を選択することで、スプレッドシート分析テンプレートに追加できます。 - [編集] ウィンドウが開きます。[ウェル]ボックスで、エクスポートするウェルを Well-ID または Well # で指定します。[OK] を選択します。テンプレートがスプレッドシートファイルに読み込まれます。スプレッドシートを閉じます。テンプレートは自動的に保存されます。
- 「Excel への新規エクスポート」ウィンドウで「OK」をクリックし、「レポート/エクスポート・ビルダー」ウィンドウを閉じます。
- Gen5ツールバー のエクスポートアイコン をクリックします。目的のエクスポートファイルの横にあるチェックボックスをオンにします。[ OK] をクリックします。Gen5 では、スプレッドシート テンプレートが自動的に入力され、Excel でファイルが開きます。
6. 外部データ分析
- Excel でエクスポート ファイル (.xlsx) を開きます。
- 各井戸について、個々の値をその井戸の 0:00 の時点の値で割ります。これにより、時点 0 が 1 に設定され、それを超える各値は最初の読み取り値に対して相対的になります。
- データ解析ソフトウェアで新しいファイルを開きます。 [XY レイアウト ] オプションを選択します。
注:このプロトコルでは、GraphPad Prism(バージョン9.5.1)が使用されました。 - 各データグループの入力ラベル。各処理グループの時点と対応する正規化された値をコピーして、プリズム表に貼り付けます。データのグラフが自動的に生成され、[ グラフ] の下にあります。
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Representative Results
私たちの目的は、PDO治療反応を評価するためにマルチプレックス生細胞イメージングを使用することの実現可能性を実証することでした。子宮内膜がんの2つの別々のPDOモデル、ONC-10817およびONC-10811で概念実証実験が実施された(ONC-10811データについては補足 図1 および 補足図2 を参照のこと)。アポトーシス(アネキシンV染色)および細胞毒性(Cytotox Green取り込み)は、アポトーシス誘導剤であるスタウロスポリンに応答して動態的にモニターされました。具体的には、PDOを96ウェルプレートに播種し、Annexin V RedおよびCytotox Green色素で処理し、 図1に示すように37°Cのインキュベーターに一晩入れました。2つの独立したPDOモデルにおいて、アネキシンVおよびCytotox Green色素による治療は毒性がないことを確認しました(補足図2)。翌日、PDOはスタウロスポリンの濃度(0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、500 nM)で処理されました。その後、Gen5ソフトウェアでプロトコルが確立され、実験は5日間にわたって実施され、6時間ごとにイメージングされるように設定されました。データは、プロトコルのセクション 4 に記載されているように、Gen5 ソフトウェアの細胞解析機能を使用して解析しました。プライマリマスクは、自動しきい値機能を使用して、「接触するオブジェクトを分割する」をオフにし、サイズパラメータを最小:30μm、最大:1000μmに設定しました。PDOの亜集団は、0.25>循環性によって定義されました。指定されたPDO亜集団内のTRITC(アネキシンV、アポトーシス)およびGFPチャネル(Cytotox Green、細胞毒性)のオブジェクト平均強度は、さらなる分析のために.xlsxファイルとしてエクスポートされました。GFP チャネルと TRITC チャネルの両方の各時点における各ウェルの物体平均強度は、時間 0 に正規化されました。次に、正規化された蛍光データをPrismファイルに転送し、折れ線グラフとして視覚化しました。
スタウロスポリンによる治療は、TRITC(アネキシンV)およびGFP(Cytotox)チャネルの両方で物体平均強度の増加によって証明されるように、ビヒクルコントロールと比較して、アポトーシスの有意な用量依存的な増加と経時的な細胞の健康状態の低下をもたらしました(図4、図5、補足ビデオ1、補足ビデオ2、補足ビデオ3、 補足動画4、補足動画5、補足動画6、補足動画7)。スタウロスポリンの500 nM、100 nM、および10 nMの用量は、それぞれ、時間の経過とともにアポトーシスと細胞毒性の両方が統計的に有意に増加しました(図5A-C)および実験の終了時(図5E、F)。さらに、スタウロスポリンは、PDOの総面積の全体的な減少によって示されるように、これらの濃度でのPDOの成長と形成を効果的に阻害しましたが、対照ウェルはPDOの総面積の増加を示しました(図4および図5D)。
生細胞イメージングの大きな利点は、プレーティングのばらつきを補正できることであるため、細胞生存率をエンドポイント指標として評価する実験を行いました。概念実証エンドポイントアッセイデータは、患者由来の前立腺がんの異種移植片から生成されたPDOモデルを使用して収集されました。治療期間の開始時(0日目)に明視野画像を収集し、その後、生存率(アクリジンオレンジ、AO)と細胞死(ヨウ化プロピジウム、PI)の両方を測定する二重色素試薬を追加しました。AO成分は、二本鎖DNAに結合すると緑色の蛍光シグナルを発し、細胞生存率の指標となります。PI成分は死細胞を染色し、処理に反応した細胞死を定量するために使用できます。PDOめっきのばらつきを考慮するため、明視野画像をデジタル位相差画像に変換することにより、時間0におけるウェル当たりのPDO数を求める方法を考案した(補足図3 、 補足ファイル1)。
前立腺がんのPDOは、細胞死を引き起こす化学療法剤であるダウノルビシンで7日間治療されました。実験終了後、 サンプルを補足ファイル1に記載のAOPIで染色し、続いてGen5で蛍光画像を解析しました。 図6A は、7日目のAOPIエンドポイントアッセイの画像パネルを示しています。ビヒクル処理したPDO(1行目)と10 μMダウノルビシンで処理したPDO(2列目)を比較すると、緑色蛍光が明らかに減少し(生存率の指標、2列目)、赤色蛍光が増加しました(細胞死の指標、3列目)。次に、これらの結果を 図 6B に定量し、AOPI エンドポイント染色技術を使用して達成できる一連の読み出しを示します。左上のプロットは、AO染色から生成された生存率測定値を示しており、0日目に各ウェルのデジタル位相コントラスト画像解析によって決定されたPDO数に正規化されています。これらのデータは、ダウノルビシンの濃度が増加するにつれて生存率が劇的に低下するという 図6Aの視覚的結果と相関しています。これはさらに右上のグラフに要約されており、PI染色で獲得した赤色蛍光の増加によって示される細胞死の増加を示しています。
次に、PIデータを生存率測定値(AO)と組み合わせて、生存率と死亡率を計算しました(図6B、左下のグラフ)。この比率は、薬物が細胞増殖抑制性または細胞傷害性であるかどうかを判断するための有用なアプローチです。具体的には、細胞増殖抑制性のある薬剤は増殖を阻害するが細胞死を誘発しない可能性があるため、細胞増殖抑制薬よりもはるかに0に近づきます。最後に、PDOの面積は、PDOが細胞死やブレブを起こしている場合でも、AO染色の緑色蛍光を使用して正確に計算できます。右下のグラフは、サブポピュレーション分析で示された面積の合計をPDO番号で割って計算された平均PDO面積を示しています。領域の分析により、治療が単にPDOの成長を阻害しているのか、それとも実際にPDO退行を引き起こしているのかについて、さらなる指標を得ることができます。平均PDO面積の解析は、GFPチャンネルと細胞解析機能を用いて行ったのに対し、 図5Dでは明視野画像を用いて総PDO面積を計算した。これらのデータは、データの可用性とユーザーの関心に応じて分析パイプラインが柔軟であることを強調しています。
最後に、生存率測定値のゴールドスタンダードである CellTiter-Glo 3D と、AOPI を使用した生存率蛍光測定値を比較しました(図 6C)。このパネルのデータは、通常、CellTiter-Glo 3Dキットを使用するラボでは行われないため、時間0のPDO番号に正規化されていないことに注意してください。どちらのアッセイでも薬物効果の傾向は同じで、ダウノルビシン濃度が増加するにつれてPDOの生存率が低下しました。これらの読み出しの唯一の視覚的な違いは、CellTiter-Glo 3D分析がAOPI分析の前にIC50に達し、ほぼ完全に0に達したことです。この結果は、ダウノルビシンの作用機序によって説明できる可能性があります。.ダウノルビシンはトポイソメラーゼ-II阻害剤であり、二本鎖DNA切断を導入し、細胞周期の停止、そして最終的にはアポトーシスを引き起こします14。細胞周期停止中、ATPの枯渇が起こることがある15。CellTiter-Glo 3DアッセイがATP-ルシフェラーゼ反応に基づいて発光シグナルを生成することを考えると、高濃度のダウノルビシンでの細胞生存率の大幅な低下は、完全な細胞死ではなくATPの枯渇によるものであったという仮説を立てています。この考えを裏付けるように、 図6A の画像は、緑色の蛍光で示される培養物にPDOを生息する集団を示しています。
図1:めっき、イメージング、および分析プロトコルの概要。 PDOは96ウェルプレートに播種され、蛍光染料と薬剤で処理されます。実験のイメージングパラメータ(露光、Zスタックなど)は、Gen5ソフトウェアで作成されます。画像はCytation 5で取得され、Gen5で処理され、データはさらなる分析のためにエクスポートされます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:細胞解析機能の概要。 1: プラグの指定: プラグは、対象領域を含むように指定されます。2:プライマリマスクを設定:プライマリマスクは、選択したチャンネルのサイズとピクセル強度に基づいて、対象のオブジェクトを定義します。この代表的な画像では、プライマリマスクに含まれるオブジェクトの輪郭が紫色で囲まれています。3: 部分母集団の定義: 分析に必要な母集団をさらに絞り込むために、追加の部分母集団を定義することができます。画像例の部分母集団(黄色で囲まれた部分母集団)は、円形度(>0.25)と面積(>800)に基づいて定義されています。画像は4倍の対物レンズで取得しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:細胞解析機能を使用したサブポピュレーションマスキングの例。 サブポピュレーションは明視野チャンネルで定義されます。画像例の部分母集団(黄色で囲まれている部分母集団)は、真円度(>0.25)と面積(>800)に基づいて定義されています。画像は4倍の対物レンズで取得しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:スタウロスポリン治療は、アポトーシスと細胞毒性の用量依存的な増加をもたらします。 スタウロスポリンの500 nM、10 nM、および0.1 nMの用量について、GFPおよびTRITC蛍光オーバーレイによる明視野画像(4倍対物レンズ)が3つの時点(0時間、54時間、114時間)で示されています。赤色の蛍光シグナルはアポトーシス(アネキシンV)を示し、緑色の蛍光シグナルは細胞毒性(Cytotox)を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:PDOレスポンスを評価するためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージング。PDOモデルONC-10817を96ウェルプレートに播種し、Annexin V Red(1:400)およびCytotox Green(200 nM)色素と37°Cで一晩インキュベートしました。 翌日、PDOはスタウロスポリンの濃度を上げて処理され、~5日間、6時間ごとに画像化されました。(A,B)スタウロスポリンに反応した(A)細胞毒性または(B)アポトーシスの時間および用量依存的な増加。.データは、GFPまたはTRITCチャネルの物体平均強度としてプロットされました。(C)100 nMまたは500 nMのスタウロスポリンに反応したアポトーシスと細胞毒性の経時変化の比較。データは、GFPおよびTRITCチャネルの物体平均強度値としてプロットされました。(D)スタウロスポリンはPDOの増殖を阻害する。データは、平均総PDO面積としてプロットされました。A-D のデータは、各ウェルの時間 0 時間における PDO 番号に正規化され、平均および平均の標準誤差 (SEM) としてプロットされました。N=5 回のテクニカル レプリケートを処理ごとに行います。p < 0.0001 対 2 因子分散分析による車両制御。(E)実験終了時(114時間)における500 nMスタウロスポリン処理PDOと車両の比較の代表的な明視野、GFP、およびTRITC画像。画像は4倍の対物レンズで取得しました。(F)114時間の時点での細胞毒性、アポトーシス、および生存率の定量化。GFP天体平均強度(左)とTRITC天体平均強度(中央)は、パネルA〜Cの結果を使用して、114時間の時点で計算されました。生存率(右)は、メーカーのプロトコルに従ってCellTiter-Glo 3D試薬を使用して評価しました。生の発光(RLU)値は、時間0時間で総PDO面積に正規化され、1.0に設定された車両制御に対する倍率生存率としてプロットされました。** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 対 Dunnett の事後検定による一元配置分散分析による車両制御。N = 1 回の処理で 5 回のテクニカル レプリケート。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:エンドポイントアッセイデータの標準化を支援するための生細胞イメージングの使用。 PDOは、トポイソメラーゼII阻害剤であるダウノルビシンの濃度を7日間増加させて治療しました。PDOをAOPI染色液に曝露し、 補足ファイル1に記載されているように画像化しました。AO = アクリジンオレンジ、生存率の尺度(GFPチャネル);PI = ヨウ化プロピジウム、細胞死の尺度(テキサスレッドチャンネル)。(A)10 μMダウノルビシンまたはビヒクルコントロール(0.1% DMSO)による7日間の処理後にAOPI染色を使用して取得した代表的な画像。(B)AOPI蛍光をエンドポイント生存率/細胞死法として使用したさまざまな読み出し。分析方法の詳細な説明については、 補足ファイル1 を参照してください。左上、AO染色で判定した7日後のPDO生存率の解析。右上、PI染色による細胞死の解析。AO染色とPI染色のデータは、時間0時のPDO番号に正規化され、次に1.0に設定されたビヒクルコントロールに正規化され、平均と標準偏差としてプロットされました。左下は、AO染色とPI染色の平均対象物積分を使用した生存死比の計算です。右下、AO染色によって決定されたPDOの領域。細胞解析はGFPチャンネルで行いました。(C)PDOの実行可能性をテストするための2つの方法の比較。イメージング後、メーカーのプロトコルに従って、CellTiter-Glo 3D試薬を使用して生存率を評価しました。ビヒクルコントロールに対する倍数生存率は、ダウノルビシンの濃度が上昇した場合にプロットされました。データは、処理ごとの N = 6 テクニカル反復の平均と標準偏差を表します。パネルCのデータは時間0時間に正規化されていません。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 処遇 | # 井戸の数 | メディアボリューム | アネキシン | 100 μMのサイトトックス | ||
| 希釈 | 容積 | 希釈 | 容積 | |||
| 多重 | 60 | 6.6 mLの | 1:400 | 16.5μL | 200 nM | 13.2 μL |
表1:多重化実験例 アネキシンVレッドは、アポトーシス細胞膜の外側のリーフレットに露出したホスファチジルセリンに結合します。Cytotox Greenは、膜の完全性が損なわれた細胞に統合され、DNAに結合します。
補足図1:ONC-10811の多重化生細胞イメージング。 PDO を 96 ウェルプレートに播種し、Annexin V Red(1:400)およびCytotox Green(200 nM)色素中で 37 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、PDOはスタウロスポリンの濃度を上げて治療され、5日間6時間ごとに画像化されました。(A)スタウロスポリンに反応した細胞毒性の時間および用量依存的な増加。データは、GFPチャネルの物体平均強度としてプロットされました。(B)114時間でのスタウロスポリンの用量反応。データは、114時間の時点でGFPチャネルの物体平均強度値としてプロットされました。(C)スタウロスポリンに反応したアポトーシスの時間と用量依存的な増加。データは、TRITCチャネルのオブジェクト平均強度としてプロットされました。(D)114時間でのスタウロスポリンの用量反応。データは、114時間の時点でTRITCチャネルの物体平均強度値としてプロットされました。A と C のデータは、ウェルレベルで時間 0 時の PDO 番号に正規化されました。N = 各モデルの処理ごとに 5 テクニカル反復。p < 0.0001 対 2 因子分散分析による車両制御。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:アネキシンVとサイトトックスによる治療はPDOの生存率を乱さない。 PDOを96ウェルプレートに播種し、Annexin V Red(1:400)およびCytotox Green(200 nM)色素と37°Cで一晩インキュベートしました。 24時間のインキュベーション後、メーカーのプロトコルに従ってCellTiter-Glo 3Dアッセイを用いて生存率を評価しました。(A) 24 時間時点での色素処理済みおよび未処理の PDO の生存率。相対光単位(RLU)値とPDO合計面積に正規化された値の両方が表示されます。具体的には、各ウェルのCellTiter-Glo3D RLUを、めっき時(すなわち、色素添加直後)におけるそのウェルのPDO面積の合計に正規化しました。PDOの総面積は、Cellular Analysisの「Object Sum Area」計算を使用して決定しました。N = 10 です。(B) 114 時間時点での色素処理済みおよび未処理の PDO の生存率。生の発光値と、PDO領域全体に正規化された値の両方が表示されます。各ウェルの CellTiter-Glo3D RLU は、プレーティング後 24 時間(速度論イメージング実験の時間 0 時間に相当)の PDO 面積の合計に正規化しました。N = 5 です。AとBの有意性は、対応のないt検定を使用して評価されました。p値はグラフにリストされています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:デジタル位相差を用いたPDOのラベルフリー分析。 この図は、 補足ファイル1:単一焦点視野解析(明視野/デジタル位相差画像)およびGen5ソフトウェアでのデジタル位相コントラスト画像解析のイメージングパラメータの設定に記載されているラベルフリー解析を示す代表的な画像(対物レンズ2.5倍)を示しています。(A)前立腺がんPDXOモデルの単一焦点面での明視野画像の例。(B)Aの明視野像をデジタル位相差像に変換した。明視野画像の暗い物体は、デジタル位相コントラスト画像では明るく見え、その逆も同様です。(C) デジタル位相コントラスト画像を用いたPDOマスキングの例。対象物のエッジは、明視野画像と比較してはるかに鮮明になることに注意してください。この代表的な画像では、プライマリマスク内のオブジェクトの輪郭が黄色で囲まれています。(C)の部分母集団(ピンクで囲まれた部分母集団)は、円形度(>0.3)、面積(>1000)、平均[Dig.Ph.Con]>2000、StdDev[Dig.Ph.con]>5000+<13500、およびピーク[Dig.Ph.Con]>12500に基づいて定義されます。この代表図で使用したパラメータを 図6 のデータに適用し、0日目の細胞数に正規化しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:PDOモデルは、その形態とめっきの一貫性が異なる場合があります。 上段:BMEドーム内のPDOの微分分散の例。下部パネル:円盤偏差型PDOと円形型PDOの代表的な画像。すべての画像はEVOS顕微鏡で取得しました。倍率が注目されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:蛍光を定量化するためのCellular Analysis vs. Image Statisticsを使用した画像の例。 Cellular Analysisを使用すると、画像内の特定の集団を定義し、それらの領域の蛍光を測定できます。画像統計は、バックグラウンドシグナルを除外する閾値を定義することにより、画像内の蛍光を測定するためにも使用できます。画像統計の使用に関する制限事項については、「ディスカッション」を参照してください。画像は4倍の倍率です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
付表1:オルガノイド培養培地成分。なお、試薬は婦人科がんPDOの培養に最適化されています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:500 nMスタウロスポリン治療のタイムラプスビデオと6時間ごとに取得された画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ2:100 nMスタウロスポリン治療のタイムラプスビデオと6時間ごとに取得された画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ3:6時間ごとに取得した画像による10 nMスタウロスポリン治療のタイムラプスビデオ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ4:6時間ごとに取得した画像による1nMスタウロスポリン治療のタイムラプスビデオ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ5:0.1 nMスタウロスポリン治療のタイムラプスビデオと6時間ごとに取得された画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ6:0.01 nMスタウロスポリン治療のタイムラプスビデオと6時間ごとに取得した画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画7:車両(0.06%DMSO)のタイムラプス動画(6時間ごとに撮影した画像)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:補足プロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PDO培養は、細胞の応答や挙動を反映する能力があるため、in vitroモデルシステムとしてますます人気が高まっています2。PDOの生成、培養、増殖技術は大きく進歩しましたが、治療反応を解析する方法は遅れていました。市販の3D生存率キットは溶解性エンドポイントアッセイであり、潜在的に貴重な速度論的反応データを見逃し、他の方法によるその後の分析を制限します8。新しい研究では、PDOモデルにおける薬物反応を評価するために生細胞イメージングを適用しています。ここでは、マルチプレックス蛍光生細胞イメージングを利用して、PDO治療反応を経時的に評価する方法を紹介します。マルチプレックス蛍光色素により、異なる細胞応答を同時に定量化することができます。アポトーシスと細胞毒性に加えて、このアプローチは将来の研究で拡張され、PDOにおける他の表現型の影響を調べることができると想定しています。
本明細書に提示するプロトコールは、96ウェルプレートにドームとしてプレーティングされたPDOのキネティック明視野および蛍光画像を取得するように設計されています。主なステップは、1)めっき、2)色素と薬剤による処理、3)イメージングパラメータの定義、4)キネティック画像取得完了時の画像前処理と解析、5)他の統計ソフトウェアで解析するためのデータのエクスポートです(図1)。インタクトPDOは、あらかじめ決められた比率のBMEとオルガノイド培養培地(通常は1:1)で構成された5 μLのBMEドームとして96ウェルプレートに播種されます。ここで紹介するプロトコールは、バッチ間のばらつきが最小限で、イメージングの光学特性が優れているため、BMEとしてUltiMatrixを使用しています。マトリゲルなどの他のBMEで培養したPDOを回収するための修正や、凝集して解離しにくいモデルに対する修正が必要な場合があります(例 の補足図4を参照)。次に、蛍光色素をプレーティング時(-1日目)にオルガノイド培養培地に100μLの容量で2倍の濃度で添加し、一晩インキュベートしてベースラインの細胞死を決定します。翌日(0日目)に、薬物または他の処理剤をオルガノイド培養培地に2倍の濃度で100 μLの容量で添加し、次に各ウェルに添加して最終容量を200 μLにします。最終容量は200μLで、イメージングによるメニスカス効果が軽減されます。キネティック画像は、BioSpa 卓上インキュベーターと提携した Cytation 5 プレートリーダーを使用して取得されます。BioSpaインキュベーターは、37°Cの固定温度と5%CO2 環境で実験プレートのインキュベーションを可能にします。BioSpaには最大8枚のプレートを保管することができ、8つの実験を同時に行うことができます。各プレートのイメージングパラメータは、Gen5ソフトウェアで「イメージャー手動モード」を使用して設定され、プロトコルとして保存されます。プロトコルは、スケジューリングソフトウェア(BioSpa OnDemand)にロードされます。BioSpa OnDemand ソフトウェアは、BioSpa インキュベーターから Cytation 5 へのプレートの物理的な移動や、データ収集のために Gen5 で実行するプロトコルの指示など、キネティック画像取得のワークフローを自動化します。画像は、Gen5ソフトウェアのCellular Analysis機能を使用して解析されます(図2)。蛍光画像と明視野画像のZ投影を解析する具体的な方法について説明します。単一のZ平面および/または明視野画像のみを解析する具体的な方法は、 補足ファイル1に記載されています。最後に、PDO面積、数値、平均蛍光強度などの特定のデータ特徴を定義してExcelスプレッドシートとしてエクスポートし、その後の薬物効果の統計分析に役立てることができます。
PDOモデルが薬物効果を調査するための比較的新しいモデルシステムであることを考えると、培養条件、特にBMEの成長に対応する方法はまだ登場しています16。薬物治療に対するPDO反応を評価する研究の大部分は、細胞の健康の代理としてATPベースのエンドポイントアッセイに依存しています(CellTiter-Glo 3D)。この方法では細胞溶解が必要なため、その後のダウンストリーム分析が不可能です。蛍光染色、シングルタイムポイントイメージング、形態学的追跡などの代替エンドポイントアッセイは、薬物反応を特徴付けるための他の指標を提供すると同時に、追加の目的でのサンプル使用を可能にしています。例えば、インプレートエンドポイント固定プロトコルは、薬物効果のハイスループット分析に適用されています17,18。この方法の利点は、典型的な免疫組織化学および免疫蛍光イメージング19で必要とされる広範な処理を回避し、PDOモデルの場合のようにサンプルが限られている場合に特に有用である。また、共焦点顕微鏡による高解像度イメージングにも適しています。細胞溶解を必要としない別のエンドポイントアッセイは、ヨウ化プロピジウムやアクリジンオレンジなどの試薬を用いた生細胞イメージングです。細胞の生存率と死を評価するために、細胞溶解を必要としないCellTiter-Glo 3DとAOPIの比較解析(図6C)では、PDOモデルで生細胞イメージング色素を使用する利点が強調されています。この方法は、実験の終了時に表現型効果を評価するために、私たちを含むいくつかのグループによって適用されています18,19,20。ただし、ウェル内固定法またはエンドポイント生細胞イメージング法のいずれかを使用した速度論的データ取得には、大量のサンプルが必要です。PDOの経時的なラベルフリー形態学的評価は、この制限を部分的に克服し、幅広いイメージングモダリティを使用して評価できます8,10,17,18が、形態の変化は、アポトーシスや細胞生存率の変化などの潜在的な薬物効果のスペクトルを代表していない可能性があります。我々は、薬物に反応した形態学的変化において、モデル間の有意なばらつきを観察した。たとえば、一部のPDOはアポトーシスを受けるにつれて面積が増加しますが、他のモデルは縮小する可能性があります。動態学的評価は、限られた数の研究で固定細胞または生細胞蛍光エンドポイントアッセイのいずれかとマルチプレックス化されています18,20。本稿で紹介する方法は、ハイスループットシステムにおいて複数の細胞効果を同時に評価するために、異なる蛍光色素をマルチプレックス化した初めての手法です。
キネティック生細胞イメージングがもたらす最大の改善点の1つは、エンドポイントアッセイに関連する重要な制限を克服できることです。例えば、ほとんどの自動セルカウンターは60 μm未満の物体に対してゲートされているため、ウェルごとに同数のPDOをめっきすることは技術的に困難です。生細胞イメージングにより、各ウェルの時間0時間におけるPDO数または面積の正規化が可能になり、ウェル間のプレーティングのばらつきを調整するために使用できます。PDOのゴールドスタンダードエンドポイントアッセイは、細胞生存率の代理としてATPを測定するCellTiter-Glo 3Dキットです。このアッセイは、婦人科および前立腺がんPDOの研究に広く使用されています13,21,22,23,24。ATP測定のために細胞溶解を必要とすることに加えて、薬物やその他の治療法はATPレベルを変化させる可能性があり、治療反応の不正確な評価を提供する可能性があります。生細胞イメージング色素を利用することで、アポトーシスや細胞毒性など、より広い範囲の特異的な細胞応答を定量化することができます。重要なことは、これらの試薬は、ヨウ化プロピジウムの場合のように、細胞の生存率を乱したり、DNA損傷を誘発したりしないことです。これにより、PDO応答を経時的に繰り返し評価することができます。アクリジンオレンジ(AO)の動態測定への使用は検討していませんが、AOの作用機序は、将来的にそのような適用を妨げるべきではありません。
腫瘍は、さまざまなゲノムプロファイルおよび形態を有するいくつかの異なる細胞集団から構成される。PDOモデルの複雑な異質性により、個々のPDO応答は異なる場合があり、これらの応答を追跡することは困難です。私たちのプロトコルは、ウェルごとに複数のPDO応答指標を評価する方法を提供します。ただし、生細胞イメージングには、特定の技術的考慮事項が引き続き適用されます。96ウェルプレートを播種するために必要な24ウェルプレートのウェル数は、各PDOモデルの密度と成長率によって異なります。凝集は画像解析を混乱させる可能性があるため(補足図4)、PDOモデルでは、めっきの前に追加の処理ステップが必要になる場合があります。必要に応じて、PDOは、幅の広いp200チップを使用した強力なピペッティングによって、処理中に機械的にせん断することができます。TrypLE Expressを使用した酵素消化は、PDOの解離を促進し、凝集を減少させるために、プレーティングの前に採用することもできます。私たちの経験では、TrypLEのインキュベーションの長さはモデルによって大きく異なることに気付きました。したがって、TrypLEのインキュベーションは、特に研究者がシングルセル懸濁液を取得したい場合には、モデルごとに最適化する必要があります。酵素消化に特に敏感なPDOモデルでは、治療開始前の回復時間が必要になる場合があります。
特定の生細胞イメージング試薬の方法を紹介します。本明細書に提示される方法の広範な適用性における制限は、BMEと適合する試薬の不足である。PDOでの使用にまだ最適化されていない他の色素/試薬については、最適な濃度を決定し、溶媒の影響を最小限に抑えるために、追加のトラブルシューティングが必要になる場合があります。関心のある読み出し(アポトーシスや細胞毒性など)に応じて、スタウロスポリンやダウノルビシン13 などの細胞死を誘導することが知られている化合物による処理を使用して、試薬条件を最適化する必要があります。さらに考慮すべき点として、染料をBMEドームに組み込むのに最適な時期があります。私たちの実験では、処理前に一晩インキュベーションを行い、色素をドームに完全に取り込み、ベースラインの細胞の健康状態を判断します。シグナル強度は時間の経過とともに増加するため、研究者は色素を使用してパイロット研究を行い、実験終了時に理想的な露光時間を決定し、露出オーバーの画像を回避する必要があります。最後に、試薬は細胞プロセスに干渉してはなりません。例えば、DNAにインターカレートする色素は、キネティックイメージングとは相容れません。ただし、生細胞イメージングは、エンドポイントアッセイにおけるデータの正規化に使用できます。実際、AOPIを使用して細胞の生存率と生存可能:死細胞比を定量化するための補足的な方法を提示します。この実験では、蛍光シグナルを、0日目(処理日、 図6)の生細胞イメージングによって決定された各ウェルのPDO番号に正規化されます。
この分析法の論文のもう一つの限界は、実験を手動ピペッティングに依存しているため、技術的な再現のばらつきが大きくなる可能性があることです。データの再現性のさらなる向上は、他の人が実証しているように、めっきや薬物調剤のための自動リキッドハンドラーの使用など、実験プロセスの他のステップに自動化を追加することで達成できます8,10。ただし、この追加には研究インフラストラクチャへの追加投資が必要であり、すべての研究者が利用できるとは限りません。各モデルのPDO面積の不均一性を考えると、時間を0時間で初期PDO番号または面積に正規化することは、自動シード処理では依然として有用なアプローチです。
他の生細胞イメージングプラットフォームと比較した場合のCytation 5の主な利点は、画像および解析機能をカスタマイズできることです。しかし、Cytation 5/Gen5ソフトウェアは学習曲線が急で、ユーザーがイメージングの基礎知識を持っていることを前提としています。この方法論文の目標の1つは、他の研究者がPDO研究プログラムに高度な生細胞イメージング技術を組み込むための障壁を減らすための段階的な指示を提供することです。ここで紹介する特定の分析手順は 1 つのシステムに対するものですが、ダウンストリーム分析では NIH ImageJ などのサードパーティソフトウェアの使用が必要になる場合があることを理解した上で、多重化の原則を他のプラットフォームに適用できます。
分析指標は、実験目標とめっき条件の両方に基づいて選択する必要があります。例えば、細胞死を定量するために蛍光色素を用いて実験を行う場合、蛍光強度は有効な読み出しとなります。最も効果的な蛍光指標(総蛍光対物体平均強度)は、めっき条件によって異なります(補足図4)。PDOが均一に分散し、より円形で凝集した形態を有する場合、定義されたPDO亜集団で蛍光を測定できます。Gen5 ソフトウェアの特定の機能は Cellular Analysis で、出力は Object Mean Intensity です。ただし、PDOモデルが塊状であったり、形態がまとまっていたりする場合は、画像レベルで蛍光シグナルを定量化することをお勧めします。この関数は [画像統計] の下にあり、出力は [総蛍光強度] です。この方法は、個々のウェルレベルでの変化を観察するのに便利ですが、この指標は対象物に固有のものではなく、実験中にPDOが指定されたプラグの外側に移動した場合、誤って変化する可能性があります。重大な破片や死んだ単一細胞があるシナリオでは、PDOに特に関連していない蛍光シグナルをゲートアウトするために、細胞解析の使用が推奨されます。Cellular Analysis と Image Statistics を使用した差分結果の例を 補足図 5 に示します。
画像統計機能の最適な閾値を決定するには、ラインツールを使用できます。ラインツールを使用すると、画像内の蛍光強度の範囲を決定できます。下限閾値を画像内のピーク強度の25%値として設定します。指定された閾値に含まれる蛍光領域を表示するには、「閾値外れ値」ボックスにチェックを入れます。下限しきい値の追加微調整が必要な場合があります。
生細胞イメージングにおける大きな課題は、各実験で生成された膨大な量のデータを保存することです。これは、Zスタックを使用して複数の焦点面を画像化し、Zプロジェクションを生成するPDO培養の場合に特に関連します。この問題を解決する方法は複数あります。まず、十分なストレージ容量を確保します。合計 17 TB のソリッドステート ハード ドライブを 3 台インストールしました。その他のオプションには、実験ファイルを外付けハードドライブまたはネットワークストレージに転送することが含まれます。クラウドベースのストレージにファイルを直接書き込むことはお勧めしません。外付けドライブに保存されているデータを解析するには、実験と画像ファイルをGen5ソフトウェアを搭載したコンピューターに転送するだけです(注:大きなファイルは転送に時間がかかる場合があります)。解析の前に、画像を実験に再リンクする必要があります。実験ファイルを開き、ツールバーの [プロトコル] をクリックして [プロトコル オプション] を選択します。「画像保存オプション」をクリックし、「新しい画像フォルダを選択」をクリックします。画像ファイルを見つけて、[再リンクするフォルダを選択]をクリックします。
実験の目的によっては、Gen5 内でビニング機能を使用することも適している場合があります。ビニングはピクセル数を減らすことでファイルサイズを小さくし、画像の解像度を下げます(手順3.5.3.2を参照)。したがって、高解像度の画像が必要な場合、ビニングは推奨されません。ビニング機能を使用する場合は、露出設定を調整する必要があります。実験ファイルが作成されたら、画像セクションをダブルクリックし、顕微鏡アイコンをクリックしてイメージャー手動モードを再度開きます。自動露出機能を使用するか、必要に応じて露出を手動で調整します。
要約すると、細胞毒性物質に反応してPDOのアポトーシスと細胞の健康状態を評価する方法を紹介します。今後の研究は、PDOの速度論的イメージングのための方法を最適化し、細胞毒性ではなく細胞増殖抑制性を持つ薬物の他の表現型や効果など、追加の分析戦略を開発するために必要です。主な障害は、BMEに適合する色素と試薬の商業的入手可能性です。これらのモデルから最も多くのデータを抽出するために、キネティック生細胞イメージングをフルに活用する方法をよりよく理解するには、さらに多くの作業が必要です。
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Disclosures
KWTはImmortagen Inc.の共同所有者であり、CJDはAgilentの従業員です。JSdBは、アムジェン社、アストラゼネカ社、アステラス製薬、バイエル社、バイオクセル・セラピューティクス社、ベーリンガーインゲルハイム社、セルセントリック社、第一社、エーザイ社、ジェネンテック/ロシュ社、ゲンマブ社、GSK、ハープーン社、イムチェック・セラピューティクス社、ヤンセン社、メルク・セローノ社、メルク・シャープ・アンド・ドーム社、メナリニ/シリコン・バイオシステムズ社、オリオン社、ファイザー社、キアゲン社、サノフィ・アベンティス社、シエラ・オンコロジー社、大鵬社、テルモ社、バーテックス・ファーマシューティカルズ社から報酬を受け取っています。AZ、アステラス製薬、バイエル、セルセントリック、第一、ジェネンテック、ゲンマブ、GSK、ヤンセン、メルクセローノ、MSD、メナリニ/シリコンバイオシステムズ、オリオン、サノフィアベンティス、シエラオンコロジー、大鵬、ファイザー、バーテックスから研究活動に対する資金提供またはその他の支援を受けているがん研究所(ICR)の従業員であり、アビラテロン、DNA修復欠陥のある癌におけるPARP阻害に商業的関心を持っています。 およびPI3K / AKT経路阻害剤(個人所得なし);は、ヤンセンが提出した、コルチコステロイドによる酢酸アビラテロンの使用を対象とする特許8,822,438について、金銭的利害関係のない発明者として名前が挙がりました。多くの業界が後援する臨床試験のCI / PIを務めています。国立衛生研究所(NIHR)の主任研究員です。他の著者は、開示すべき潜在的な利益相反を持っていません。
Acknowledgments
患者の腫瘍標本を提供してくれたアイオワ大学のTissue Procurement CoreとKristen Coleman博士、PDOモデルの生成を支援してくれた産婦人科のSofia Gabrilovich博士に感謝します。また、論文の批判的分析をしてくれたValerie Salvatico博士(Agilent、米国)にも感謝します。我々は、以下の資金源を認める:NIH/NCI CA263783及びDOD CDMRPはKWTにCA220729P1する。Cancer Research UK、Prostate Cancer UK、Prostate Cancer Foundation、Medical Research CouncilからJSdBへ。資金提供者は、実験の設計や分析、出版の決定に何の役割も果たしていなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrfuge tube | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.100 | |
| 554 NM LED Cube | Agilent | 1225012 | |
| 96-well plate | Corning Costar | 3596 | Prewarmed to 37 °C |
| 96-well plate | Agilent | 204626-100 | Prewarmed to 37 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media) |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | component of organoid culture media |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| BioTek BioSpa 8 Automated Incubator | Agilent | BIOSPAG-SN | Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10) |
| BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Agilent | CYT5PW-SN | Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08) |
| Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Systems | BME001-10 | |
| Daunorubicin HCl | Sigma-Aldrich | S3035 | Reconstituted in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
| Forskolin | Tocris | 1099 | Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media) |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein | Gibco | AF-100-15-1MG | Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human FGF-10 Recombinant Protein | Gibco | 100-26-1MG | Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Human R-Spondin 1 Recombinant Protein | Gibco | 120-38-5UG | Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technologies | 7926 | Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Imaging Filter Cube- GFP | Agilent | 1225101 | |
| Imaging Filter Cube- TRITC | Agilent | 1225125 | |
| Imaging LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
| Incucyte Annexin V Red Dye | Sartorius | 4641 | Reconstituted in organoid culture media |
| Incucyte Cytotox Green Dye | Sartorius | 4633 | DMSO solution |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media) |
| Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution | Fisher-Scientific | 13366169 | Add 1:50 volume |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media) |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media) |
| Recombinant Human Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
| Staurosporine solution from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | S6942 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Y-27632, CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media) |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media) |
References
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