यहां मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के मुराइन मॉडल से अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल आबादी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह तकनीक रोग की प्रगति के साथ एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं सहित गैर-हेमटोपोइएटिक अस्थि मज्जा आला में परिवर्तन की पहचान करती है।
अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट में अलग-अलग सेल आबादी होती है, जैसे कि मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं, ऑस्टियोलिनेज कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट्स, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) के लिए समर्थन प्रदान करते हैं। सामान्य एचएससी का समर्थन करने के अलावा, अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विकारों के विकास में भी भूमिका निभाता है, जैसे कि मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम (एमडीएस) और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)। एचएससी में एमडीएस से जुड़े उत्परिवर्तन भेदभाव और प्रगतिशील अस्थि मज्जा विफलता में एक ब्लॉक का कारण बनते हैं, खासकर बुजुर्गों में। एमडीएस अक्सर चिकित्सा प्रतिरोधी एएमएल में प्रगति कर सकता है, एक बीमारी जो अपरिपक्व माइलॉयड विस्फोटों के तेजी से संचय की विशेषता है। अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट को इन माइलॉयड नियोप्लाज्म वाले रोगियों में बदलने के लिए जाना जाता है। यहां, मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के म्यूरिन मॉडल से अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल कोशिकाओं को अलग करने और फेनोटाइपिक रूप से चिह्नित करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अस्थि मज्जा आला आबादी में परिवर्तनों को अलग करने और चिह्नित करने से रोग की शुरुआत और प्रगति में उनकी भूमिका निर्धारित करने में मदद मिल सकती है और अस्थि मज्जा स्ट्रोमल आबादी में कैंसर को बढ़ावा देने वाले परिवर्तनों को लक्षित करने वाले उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास को जन्म दे सकता है।
अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट में हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं, गैर-हेमटोपोइएटिक स्ट्रोमल कोशिकाएं और बाह्य मैट्रिक्स 1,2 होते हैं। इस microenvironment hematopoietic स्टेम सेल आत्म नवीकरण को बढ़ावा देने, वंश भेदभाव को विनियमित, और हड्डी के ऊतकों 1,2,3,4,5 के लिए संरचनात्मक और यांत्रिक सहायता प्रदान कर सकते हैं. स्ट्रोमल आला ऑस्टियोवंश कोशिकाओं, fibroblasts, तंत्रिका कोशिकाओं, और endothelial कोशिकाओं6 शामिल हैं, जबकि hematopoietic आला लिम्फोइड और माइलॉयड आबादी 1,2,3 के होते हैं. सामान्य एचएससी का समर्थन करने के अलावा, अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट एमडीएस और एएमएल 7,8,9,10,11जैसे हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विकारों के विकास में भी भूमिका निभा सकता है। ऑस्टियोलिनेज कोशिकाओं में उत्परिवर्तन एमडीएस, एएमएल, और अन्य मायलोप्रोलिफेरेटिव नियोप्लाज्म 10,12,13,14के विकास को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है।
मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम प्री-ल्यूकेमिक विकारों का एक समूह है जो हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्तन से उत्पन्न होता है। एमडीएस अक्सर एचएससी भेदभाव और डिस्प्लास्टिक कोशिकाओं के उत्पादन में एक ब्लॉक से जुड़ा होता है, जो अक्सर अस्थि मज्जा विफलता का कारण बन सकता है। एमडीएस संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे अधिक पाया जाने वाला माइलॉयड नियोप्लाज्म है और 35% -45% 15 की 3 साल की जीवित रहने की दर से जुड़ा हुआ है। एमडीएस अक्सर तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में परिवर्तन के उच्च जोखिम से जुड़ा होता है। यह एक घातक जटिलता हो सकती है, क्योंकि एमडीएस-व्युत्पन्न एएमएल अधिकांश उपचारों के लिए प्रतिरोधी है और पुनरुत्थान की संभावना है। हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज में अनुवाद या उत्परिवर्तन के कारण डी नोवो उत्पन्न होने वाले एएमएल भी अक्सर मानक कीमोथेरेपी16,17 के लिए प्रतिरोधी होते हैं। चूंकि एमडीएस और एएमएल मुख्य रूप से बुजुर्गों की बीमारियां हैं, जिनमें से अधिकांश का निदान 60 वर्ष से अधिक आयु के साथ होता है, इसलिए अधिकांश रोगी उपचारात्मक अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए अयोग्य हैं। इस प्रकार, रोग की प्रगति के उपन्यास नियामकों की पहचान करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। चूंकि अस्थि मज्जा microenvironment घातक कोशिकाओं14 के लिए समर्थन प्रदान कर सकते हैं, रोग की प्रगति के साथ अस्थि मज्जा आला में परिवर्तन को परिभाषित करने ट्यूमर आला रीमॉडेलिंग बाधा के उद्देश्य से उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की पहचान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, रोग की प्रगति के उपन्यास नियामकों की पहचान करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। यह अंत करने के लिए, अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल आबादी में परिवर्तन की पहचान करना और चिह्नित करना महत्वपूर्ण है जो घातक कोशिकाओं के लिए समर्थन प्रदान कर सकता है।
एएमएल और एमडीएस के कई murine मॉडल उत्पन्न किया गया है और रोग दीक्षा और प्रगति 6,1,19,20,21,22 के दौरान अस्थि मज्जा microenvironment में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहां, रेट्रोविराली प्रेरित एएमएल 6,20 के म्यूरिन मॉडल का उपयोग करके अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल आबादी में परिवर्तन की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल, साथ ही एएमएलपरिवर्तन 19 के लिए उच्च जोखिम वाले एमडीएस के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Nup98-HoxD13 (NHD13) मॉडल का वर्णन किया गया है। डे नोवो एएमएल कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित चूहे 20-30दिनों में बीमारी के शिकार 6. NHD13 चूहों में 15-20 सप्ताह के आसपास साइटोपेनिया और अस्थि मज्जा डिस्प्लेसिया विकसित होता है, जो अंततः एएमएल में बदल जाता है, और लगभग 75% चूहे 32 सप्ताह के आसपास बीमारी के शिकार हो जाते हैं। murine मॉडल अस्थि मज्जा microenvironment आबादी का विश्लेषण करने के लिए, हड्डियों काटा जाता है, अस्थि मज्जा और हड्डी spicules एंजाइमी पाचन का उपयोग पचा रहे हैं, और कोशिकाओं को तो CD45-/Ter119- चुंबकीय छँटाई द्वारा गैर hematopoietic आबादी के लिए समृद्ध कर रहे हैं. जबकि इसी तरह के विश्लेषण पहले 11,13,22,23,24,25 वर्णित किए गए हैं, वे अक्सर अस्थि मज्जा या हड्डी पर ध्यान केंद्रित करते हैं और अपने विश्लेषण में दोनों स्रोतों से कोशिकाओं को शामिल नहीं करते हैं। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में इन आबादी के संयुक्त लक्षण वर्णन, कैसे सेलुलर हेमटोपोइएटिक microenvironment रोग दीक्षा और प्रगति(चित्रा 1) के लिए समर्थन प्रदान करता है की एक व्यापक समझ प्रदान कर सकते हैं. जबकि नीचे वर्णित प्रोटोकॉल पूर्वव्यापी प्रेरित एएमएल मॉडल और एक आनुवंशिक एमडीएस मॉडल पर केंद्रित है, इन रणनीतियों को आसानी से ब्याज के किसी भी murine मॉडल के अस्थि मज्जा आला में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
मुरीन ल्यूकेमिया मॉडल का उपयोग बड़े पैमाने पर सेल आंतरिक और आला-संचालित संकेतों की पहचान करने के लिए किया गया है जो आक्रामक माइलॉयड ल्यूकेमिया प्रगति 6,19,21को बढ़ावा द…
The authors have nothing to disclose.
हम यूआरएमसी फ्लो साइटोमेट्री कोर को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी स्कॉलर अवार्ड, ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन पुरस्कार और एनआईएच अनुदान R01DK133131 द्वारा समर्थित किया गया था और जेबी को सम्मानित किया R01CA266617 था।
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |