Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi
Summary
Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.
Abstract
Kemik iliği mikroçevresi, hematopoietik kök hücreler (HSC’ler) için destek sağlayan mezenkimal stromal hücreler, endotel hücreleri, osteolineage hücreleri ve fibroblastlar gibi farklı hücre popülasyonlarından oluşur. Normal HSC’leri desteklemenin yanı sıra, kemik iliği mikroçevresi, miyelodisplastik sendromlar (MDS) ve akut miyeloid lösemi (AML) gibi hematopoietik kök hücre bozukluklarının gelişiminde de rol oynar. HSC’lerde MDS ile ilişkili mutasyonlar, özellikle yaşlılarda farklılaşmada bir bloğa ve ilerleyici kemik iliği yetmezliğine yol açar. MDS sıklıkla tedaviye dirençli AML’ye ilerleyebilir, bu hastalık hızlı bir şekilde olgunlaşmamış miyeloid patlamaların birikmesi ile karakterize bir hastalıktır. Bu miyeloid neoplazmları olan hastalarda kemik iliği mikroçevresinin değiştiği bilinmektedir. Burada, miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevresel hücrelerini izole etmek ve fenotipik olarak karakterize etmek için kapsamlı bir protokol açıklanmaktadır. Kemik iliği niş popülasyonlarındaki değişikliklerin izole edilmesi ve karakterize edilmesi, hastalığın başlaması ve ilerlemesindeki rollerinin belirlenmesine yardımcı olabilir ve kemik iliği stromal popülasyonlarında kanseri teşvik eden değişiklikleri hedefleyen yeni terapötiklerin geliştirilmesine yol açabilir.
Introduction
Kemik iliği mikroçevresi hematopoietik hücrelerden, hematopoietik olmayan stromal hücrelerden ve hücre dışı matriks 1,2’den oluşur. Bu mikro çevre, hematopoietik kök hücrenin kendi kendini yenilemesini teşvik edebilir, soy farklılaşmasını düzenleyebilir ve kemik dokusuna yapısal ve mekanik desteksağlayabilir 1,2,3,4,5. Stromal niş, osteosoy hücrelerini, fibroblastları, sinir hücrelerini ve endotel hücrelerini6 içerirken, hematopoietik niş, lenfoid ve miyeloid popülasyonlardanoluşur 1,2,3. Normal HSC’leri desteklemenin yanı sıra, kemik iliği mikroçevresi de MDS ve AML 7,8,9,10,11 gibi hematopoietik kök hücre bozukluklarının gelişiminde rol oynayabilir. Osteolineage hücrelerindeki mutasyonların MDS, AML ve diğer miyeloproliferatif neoplazmların gelişimini desteklediği gösterilmiştir 10,12,13,14.
Miyelodisplastik sendromlar, hematopoetik kök hücrelerdeki mutasyonlardan kaynaklanan bir grup pre-lösemik bozukluktur. MDS sıklıkla HSC farklılaşmasında bir blok ve sıklıkla kemik iliği yetmezliğine yol açabilen displastik hücrelerin üretimi ile ilişkilidir. MDS, Amerika Birleşik Devletleri’nde en sık teşhis edilen miyeloid neoplazmdır ve 3 yıllık sağkalım oranı %35-45 arasındadır15. MDS genellikle akut miyeloid lösemiye dönüşüm riski ile ilişkilidir. MDS’den türetilen AML çoğu tedaviye dirençli olduğundan ve nüks etme olasılığı yüksek olduğundan, bu ölümcül bir komplikasyon olabilir. Hematopoietik kök ve progenitörlerdeki translokasyonlar veya mutasyonlar nedeniyle ortaya çıkan AML, genellikle standart kemoterapiye dirençlidir16,17. MDS ve AML esas olarak yaşlıların hastalıkları olduğundan, çoğunluğu 60 yaşın üzerinde teşhis edildiğinden, çoğu hasta küratif kemik iliği nakli için uygun değildir. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Kemik iliği mikroçevresi malign hücreler için destek sağlayabildiğinden14, kemik iliği nişindeki değişikliklerin hastalık ilerlemesi ile tanımlanması, tümör nişinin yeniden şekillenmesini inhibe etmeyi amaçlayan yeni terapötiklerin tanımlanmasına yol açabilir. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Bu amaçla, malign hücrelere destek sağlayabilecek kemik iliği stromal hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak ve karakterize etmek çok önemlidir.
AML ve MDS’nin birkaç fare modeli oluşturulmuştur ve hastalığın başlaması ve ilerlemesi sırasında kemik iliği mikro ortamındaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir 6,1,19,20,21,22. Burada, retroviral olarak indüklenen AML 6,20’nin murin modellerini ve ayrıca ticari olarak temin edilebilen Nup98-HoxD13 (NHD13) yüksek riskli MDS’den AML’ye dönüşüm19 modelini kullanarak kemik iliği stromal hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için protokoller açıklanmaktadır. De novo AML hücreleri ile nakledilen fareler 20-30 gün içinde hastalığa yenik düşer6. NHD13 fareleri, 15-20 hafta civarında sitopeni ve kemik iliği displazisi geliştirir, bu da sonunda AML’ye dönüşür ve farelerin yaklaşık% 75’i 32 hafta civarında hastalığa yenik düşer. Fare modeli kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını analiz etmek için kemikler hasat edilir, kemik iliği ve kemik spikülleri enzimatik sindirim kullanılarak sindirilir ve hücreler daha sonra manyetik sıralama ile CD45-/Ter119-hematopoietik olmayan popülasyonlar için zenginleştirilir. Benzer analizler daha önce 11,13,22,23,24,25 olarak tanımlanmış olsa da, genellikle kemik iliğine veya kemiğe odaklanırlar ve analizlerinde her iki kaynaktan gelen hücreleri içermezler. Bu popülasyonların birleşik karakterizasyonu, gen ekspresyon analizleri ile birlikte, hücresel hematopoietik mikroçevrenin hastalığın başlaması ve ilerlemesi için nasıl destek sağladığının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir (Şekil 1). Aşağıda açıklanan protokol retroviral olarak indüklenen AML modeline ve genetik bir MDS modeline odaklanırken, bu stratejiler ilgilenilen herhangi bir murin modelinin kemik iliği nişindeki değişiklikleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murin lösemi modelleri, agresif miyeloid lösemi ilerlemesini destekleyen hücre içsel ve niş odaklı sinyalleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır 6,19,21. Burada, MDS ve AML’nin murin modellerinde kemik iliği mikroçevresinin hücresel bileşimini tanımlamak için kapsamlı bir akış sitometrisi tabanlı protokol sunulmaktadır.
Deneysel numunelerden akış sitometrik verileri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
URMC Flow Sitometri Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Hematoloji Derneği Akademik Ödülü, Lösemi Araştırma Vakfı ödülü ve NIH hibeleri R01DK133131 ve JB’ye verilen R01CA266617 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
