Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta
Summary
Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.
Abstract
Il microambiente del midollo osseo è costituito da popolazioni cellulari distinte, come le cellule stromali mesenchimali, le cellule endoteliali, le cellule osteolignaggio e i fibroblasti, che forniscono supporto alle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo svolge anche un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche, come le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (LMA). Le mutazioni associate alle MDS nelle HSC portano a un blocco della differenziazione e a una progressiva insufficienza del midollo osseo, soprattutto negli anziani. Le MDS possono spesso progredire verso la LMA resistente alla terapia, una malattia caratterizzata da un rapido accumulo di blasti mieloidi immaturi. È noto che il microambiente del midollo osseo è alterato nei pazienti con queste neoplasie mieloidi. Qui viene descritto un protocollo completo per isolare e caratterizzare fenotipicamente le cellule microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindrome mielodisplastica e leucemia mieloide acuta. L’isolamento e la caratterizzazione dei cambiamenti nelle popolazioni di nicchia del midollo osseo può aiutare a determinare il loro ruolo nell’inizio e nella progressione della malattia e può portare allo sviluppo di nuove terapie mirate alle alterazioni che promuovono il cancro nelle popolazioni stromali del midollo osseo.
Introduction
Il microambiente del midollo osseo è costituito da cellule ematopoietiche, cellule stromali non ematopoietiche e dalla matrice extracellulare 1,2. Questo microambiente può promuovere l’autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche, regolare la differenziazione del lignaggio e fornire supporto strutturale e meccanico al tessuto osseo 1,2,3,4,5. La nicchia stromale comprende le cellule dell’osteolignaggio, i fibroblasti, le cellule nervose e le cellule endoteliali6, mentre la nicchia ematopoietica è costituita dalle popolazioni linfoidi e mieloidi 1,2,3. Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo può anche svolgere un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche come MDS e LMA 7,8,9,10,11. È stato dimostrato che le mutazioni nelle cellule osteolignaggi promuovono lo sviluppo di MDS, LMA e altre neoplasie mieloproliferative 10,12,13,14.
Le sindromi mielodisplastiche sono un gruppo di malattie preleucemiche che derivano da mutazioni nelle cellule staminali ematopoietiche. La MDS è spesso associata a un blocco della differenziazione delle HSC e alla produzione di cellule displastiche, che spesso possono portare a insufficienza del midollo osseo. La MDS è la neoplasia mieloide più comunemente diagnosticata negli Stati Uniti ed è associata a un tasso di sopravvivenza a 3 anni del 35%-45%15. La MDS è spesso associata a un alto rischio di trasformazione in leucemia mieloide acuta. Questa può essere una complicanza fatale, poiché la LMA derivata da MDS è resistente alla maggior parte delle terapie e può recidiva. Anche la LMA che insorge de novo a causa di traslocazioni o mutazioni nel tronco ematopoietico e nei progenitori è spesso resistente alla chemioterapia standard16,17. Poiché le MDS e la LMA sono principalmente malattie degli anziani, con la maggior parte diagnosticate oltre i 60 anni, la maggior parte dei pazienti non è idonea per i trapianti curativi di midollo osseo. C’è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. Poiché il microambiente del midollo osseo può fornire supporto alle cellule maligne14, la definizione dei cambiamenti nella nicchia del midollo osseo con progressione della malattia può portare all’identificazione di nuove terapie volte a inibire il rimodellamento della nicchia tumorale. C’è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. A tal fine, è fondamentale identificare e caratterizzare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo che possono fornire supporto alle cellule maligne.
Sono stati generati diversi modelli murini di LMA e MDS che possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nel microambiente del midollo osseo durante l’inizio e la progressione della malattia 6,1,19,20,21,22. Qui, vengono descritti i protocolli per identificare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo utilizzando modelli murini di LMA 6,20 indotta da retrovirale, nonché il modello Nup98-HoxD13 (NHD13) disponibile in commercio di MDS ad alto rischio in trasformazioneAML 19. I topi trapiantati con cellule di LMA de novo soccombono alla malattia in 20-30 giorni6. I topi NHD13 sviluppano citopenie e displasia del midollo osseo intorno alle 15-20 settimane, che alla fine si trasformano in LMA, e quasi il 75% dei topi soccombe alla malattia intorno alle 32 settimane. Per analizzare le popolazioni del microambiente del midollo osseo modello murino, le ossa vengono prelevate, il midollo osseo e le spicole ossee vengono digeriti utilizzando la digestione enzimatica e le cellule vengono quindi arricchite per le popolazioni non ematopoietiche CD45-/Ter119- mediante ordinamento magnetico. Sebbene analisi simili siano state descritte in precedenza 11,13,22,23,24,25, spesso si concentrano sul midollo osseo o sull’osso e non incorporano cellule provenienti da entrambe le fonti nelle loro analisi. La caratterizzazione combinata di queste popolazioni, in combinazione con le analisi dell’espressione genica, può fornire una comprensione completa di come il microambiente ematopoietico cellulare fornisca supporto per l’inizio e la progressione della malattia (Figura 1). Mentre il protocollo descritto di seguito si concentra sul modello di LMA indotto retroviralmente e su un modello genetico di MDS, queste strategie possono essere facilmente adattate per studiare i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo di qualsiasi modello murino di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modelli di leucemia murina sono stati ampiamente utilizzati per identificare i segnali cellulari intrinseci e di nicchia che promuovono la progressione della leucemia mieloide aggressiva 6,19,21. Qui, viene presentato un protocollo completo basato sulla citometria a flusso per definire la composizione cellulare del microambiente del midollo osseo in modelli murini di MDS e AML.
Prima di acquisire i …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Flow Cytometry Core di URMC. Questo lavoro è stato sostenuto dall’American Society of Hematology Scholar Award, dal premio della Leukemia Research Foundation e dalle sovvenzioni NIH R01DK133131 e R01CA266617 assegnato a J.B.
Materials
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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