Obtention de cryosections de haute qualité d’œil de lapin entier
Summary
Ce protocole décrit une méthode fiable pour obtenir des cryosections de haute qualité d’yeux de lapin entiers. Il détaille les procédures de dissection, de fixation, d’intégration et de sectionnement de l’œil de lapin, qui peuvent être facilement adaptées pour être utilisées dans toute étude utilisant l’immunohistochimie dans des yeux plus grands.
Abstract
Ce protocole décrit comment obtenir des cryosections rétiniennes de haute qualité chez des animaux de grande taille, tels que les lapins. Après l’énucléation, l’œil est brièvement immergé dans le fixateur. Ensuite, la cornée et l’iris sont retirés et l’œil est laissé toute la nuit pour une fixation supplémentaire à 4 °C. Après la fixation, l’objectif est retiré. L’œil est ensuite placé dans un cryomoule et rempli d’un milieu d’enrobage. En retirant le cristallin, le milieu d’enrobage a un meilleur accès au vitré et conduit à une meilleure stabilité rétinienne. Il est important que l’œil soit incubé dans un milieu d’enrobage pendant la nuit pour permettre une infiltration complète dans tout le vitré. Après une nuit d’incubation, l’œil est congelé sur de la glace sèche et sectionné. Des coupes rétiniennes entières peuvent être obtenues pour une utilisation en immunohistochimie. Des protocoles de coloration standard peuvent être utilisés pour étudier la localisation des antigènes dans le tissu rétinien. Le respect de ce protocole permet d’obtenir des cryosections rétiniennes de haute qualité qui peuvent être utilisées dans toute expérience utilisant l’immunohistochimie.
Introduction
La rétine est composée de plusieurs couches de cellules spécialisées dans l’œil qui, ensemble, convertissent la lumière en signaux neuronaux. Parce que la rétine joue un rôle essentiel dans la vision, la compréhension de sa structure et de sa fonction peut fournir des informations précieuses sur certaines des causes les plus courantes de perte de vision, telles que la dégénérescence maculaire et la rétinopathie diabétique, entre autres.
Les lapins servent de modèle animal pratique dans la recherche rétinienne car ils offrent plusieurs avantages par rapport aux autres modèles. L’anatomie des yeux de lapin est relativement similaire à celle des yeux humains 1,2. Par exemple, les lapins ont une zone de densité accrue de photorécepteurs, connue sous le nom de traînée visuelle horizontale, qui est analogue à la fovéa chez les humains. D’autres modèles animaux couramment utilisés, tels que les rongeurs, n’ont pas d’équivalent anatomique. De plus, par rapport aux rongeurs, le système vasculaire rétinien chez le lapin est assez similaire à celui de l’homme. Les yeux de lapin sont également relativement grands. Cela les rend particulièrement adaptés aux études qui impliquent l’administration de médicaments ou une intervention chirurgicale dans le vitré ou la rétine, ce qui pourrait autrement être difficile ou impossible dans un œil plus petit3.
L’immunohistochimie (IHC) est une technique largement utilisée pour étudier la localisation des antigènes dans un tissu et a de nombreuses applications dans la recherche rétinienne 4,5,6. La rétine étant une structure délicate, l’obtention de résultats utiles via l’IHC nécessite un traitement minutieux des tissus. Le décollement de la rétine et d’autres artefacts tissulaires tels que les fractures ou les plis rétiniens se produisent fréquemment pendant le traitement et peuvent interférer avec l’interprétation des résultats. Le succès du traitement dépend de divers facteurs, notamment de la manipulation des tissus, du type et de la durée de la fixation, du type de support d’enrobage et des techniques de sectionnement 7,8,9,10. Malgré les avantages de l’utilisation de lapins comme modèle animal dans la recherche rétinienne, il existe très peu de protocoles décrivant le traitement tissulaire réussi de la rétine de lapin. Cet article décrit une méthode fiable pour obtenir des coupes rétiniennes de haute qualité à partir d’yeux de lapin entiers pour une utilisation en IHC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avant de mettre en œuvre le protocole ci-dessus, nous rencontrions constamment des difficultés avec le traitement tissulaire des yeux de lapin pour l’IHC. Nous avions adapté plusieurs protocoles à partir des yeux de petits animaux tels que les souris, mais nous avons constaté que ceux-ci entraînaient une fixation inadéquate et des difficultés de section des tissus. Il y a plusieurs considérations importantes qui permettent d’obtenir des sections cohérentes et de haute qualité de la rétine du lapin.
<p…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Rosanna Calderon, Dominic Shayler et Rosa Sierra pour leurs conseils techniques. Cette étude a été financée en partie par une subvention sans restriction au Département d’ophtalmologie de l’USC Keck School of Medicine de la Recherche sur la prévention de la cécité (AN), du NIH K08EY030924 (AN), de la Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), d’un prix de développement de carrière de la Recherche pour prévenir la cécité (AN), de la Fondation des Templiers (AN), et la Edward N. and Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).
Materials
| 100 mm culture dish | Corning | 353025 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| 50 mL tube | Genesee Scientific | 28-106 | For fixation and cryoprotection (step 1) |
| Cryostat | Leica | CM1850 | For cryosectioning (step 7) |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Donkey anti-Goat 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Donkey anti-Mouse 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluted 1:1,000 in blocking buffer |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Glass Slide Cover | VWR | 48404-453 | For cryosectioning (step 7) |
| Goat anti-SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| High-profile disposable cryostat blades | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | For cryosectioning (step 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6) |
| Mouse anti-RPE65 | Novus Bio | NB100-355SS | Diluted 1:100 in blocking buffer |
| OmniPur Sucrose | Millipore | 167117 | Used for cryoprotectant (step 1.2) |
| Paraformaldehyde 20% solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1) |
| Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) | Polysciences, Inc. | 18646A | Used as embedding mold (step 6) |
| Phosphate buffered saline, 1x | Corning | 21-030-CV | Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2) |
| Scalpel blade no. 15 | Feather | 08-916-5D | Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5) |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For cryosectioning (step 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Used as embedding media (step 6) |
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