Summary
Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.
Abstract
Hassas teşhislerin geliştirilmesi için sentetik biyobelirteçlerin oluşturulması, geleneksel biyoakışkan ölçümleri için kullanılanların ötesindeki yolaklar aracılığıyla hastalığın tespit edilmesini sağlamıştır. Sentetik biyobelirteçler genellikle, hastalık insidansı ve ilerlemesi sırasında yerel hastalık mikroçevresindeki biyokimyasal değişiklikleri yansıtmak için biyosıvıda okunabilir sinyaller sağlayan raporlayıcılardan yararlanır. Raportörlerin farmakokinetik konsantrasyonu ve hastalık sinyalinin biyokimyasal amplifikasyonu, bir tanı testinde yüksek duyarlılık ve özgüllük elde etmek için çok önemlidir. Burada, bir sentetik biyobelirteç formatı kullanılarak bir kanser teşhis platformu oluşturulmuştur: tümör mikroçevresindeki anormal proteolitik imzalarla serbest bırakılabilen, kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA raportörleri taşıyan aktivite tabanlı nanosensörler. Bir hastalık raportörü olarak sentetik DNA, barkod olarak kullanılmasıyla çoğullama yeteneği sağlar ve aynı anda birden fazla proteolitik imzanın okunmasına izin verir. İdrara salınan DNA raportörleri, CRISPR RNA'ları ile hibridizasyon yoluyla CRISPR nükleazları kullanılarak tespit edilir ve bu da enzim aktivasyonu üzerine bir floresan veya kolorimetrik sinyal üretir. Bu protokolde, DNA barkodlu, aktivite tabanlı nanosensörler oluşturulur ve bunların uygulamaları, metastatik kolorektal kanserin klinik öncesi fare modelinde örneklendirilir. Bu sistem, hastalık biyolojisine göre oldukça değiştirilebilir ve aynı anda birden fazla hastalık sinyali üretir, bu da yalnızca nanosensör uygulaması, idrar toplama ve hasta başı teşhisi sağlayan bir kağıt testi gerektiren minimal invaziv bir süreçle hastalık özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Introduction
Dökülen proteinler ve DNA gibi tümör biyobelirteçlerini tanımlamaya yönelik önemli çabalara rağmen, kanser tanı alanı, dolaşımdaki düşük bollukları veya hızlı bozulmaları nedeniyle zorlanmıştır1. Tamamlayıcı bir strateji olarak, güçlendirilmiş sinyaller üretmek için hastalık özelliklerine seçici olarak yanıt veren biyomühendislik ürünü sentetik biyobelirteçler, doğru ve erişilebilir teşhise yönelik yeni yolları temsil eder 2,3. Algılamaya yardımcı olmak için, bu sentetik biyobelirteçler, geliştirilmiş sinyal-gürültü oranına sahip analitler üretmek için enzimatik amplifikasyon gibi tümöre bağlı aktivasyon mekanizmalarından yararlanır4. Burada, kanserle ilişkili bir enzim sınıfı olan proteazlar, kan veya idrar gibi biyosıvılardan tespit edilebilen hastalık raportörlerini serbest bırakmak için enjekte edilebilir nano ölçekli sensörleri etkinleştirmek için kullanılır 5,6. Tümör heterojenliği ışığında, proteazla aktive olan sensörlerden oluşan bir panel geliştirmek, kanser insidansını ve ilerlemesini daha spesifik, çoğullanmış bir şekilde değerlendirmek için farklı proteaz bölünme olaylarını bir 'hastalık imzası' halinde birleştiren multianalit testlerine izin verir.
İnert bir taşıyıcının7 yüzeyine konjuge edilmiş peptit substratlarını içeren proteazla aktive olan sentetik biyobelirteçler geliştirilmiştir. İn vivo enjekte edildiğinde, bu peptitler tümöre taşınır, bunun üzerine tümör proteazları tarafından enzimatik bölünme, rapor edicileri tespit için kana veya idrara bırakır. Proteazla aktive olan sentetik biyobelirteçlerle çoğullanmış algılama, bir kokteyl içindeki her sentetik biyobelirtecin benzersiz bir moleküler barkodla etiketlenmesini gerektirir. Bu amaçla, toplu barkodlar ve ligand kodlu raportörler 8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Birkaç farklı sinyal olasılığıyla sınırlı olabilen bu çoğullama yöntemlerinin aksine, DNA barkodlaması, insan hastalık durumlarının yüksek karmaşıklığına ve heterojenliğine uygun olarak çok daha fazla kombinasyon sağlar. Sentetik biyobelirteçlerin çoğulluğunu genişletmek için, sensörler, biyoakışkan sinyali ex vivo olarak yükseltmek için CRISPR-Cas nükleaz yoluyla tespit için her bir raporlayıcıyı benzersiz bir DNA dizisi ile etiketleyerek barkodlanır. Bu tek sarmallı DNA (ssDNA) barkodları, tamamlayıcı CRISPR kılavuz RNA'larına (crRNA'lar) bağlanacak ve CRISPR-Cas12a11'in hedefle tetiklenen kollateral nükleaz aktivitesini aktive edecek şekilde tasarlanmıştır. Bu nükleaz aktivitesi, floresan kinetiği veya kağıt şeritler kullanılarak tespit edilen bir muhabir DNA zincirini parçalamak için kullanılabilir.
Proteazlar (in vivo) ve CRISPR-Cas (ex vivo) yoluyla moleküler amplifikasyona ek olarak, proteazla aktive olan sentetik biyobelirteçlerin bir diğer önemli tasarım özelliği, biyosıvılardaki tanısal sinyal konsantrasyonunu artırmak için nanomalzeme farmakokinetiğinden yararlanmayı içerir10. Bir yaklaşım, yüzeyde konjuge peptit substratlarının dolaşım süresini artırmak için bir nanopartikül taşıyıcının kullanılmasıdır. Bir polietilen glikol (PEG) dendrimer, tümörlere iletimi artırmak için nispeten küçük hidrodinamik çapa ve çok değerliliğe sahip bir nanotaşıyıcı olarak seçilir. Tümör iletimini teşvik edecek kadar küçük olsa da, PEG taşıyıcısının boyutu, böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin ~ 5 nm boyutundaki kesiminden daha büyüktür, böylece böbrekler tarafından boyut filtrasyonundan yararlanarak sadece parçalanmış peptit substratları idrara temizlenebilir12. Bu protokolde, klinik öncesi bir fare modelinde DNA barkodlu aktivite tabanlı nanosensörlerin sentezi ve uygulanması için çok adımlı iş akışı ana hatlarıyla belirtilmekte ve bu grup tarafından çoklu kanser türlerinin fare modellerinde hastalık durumunu sınıflandırmak için kullanılan CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testinin kurulumu vurgulanmaktadır13. Çok yönlü tasarım prensibi sayesinde, nanosensörün üç işlevsel bileşeninin tümü - nanotaşıyıcı (PEG polimeri), uyaranlara duyarlı modül (proteazla aktive edilmiş substrat) ve biyoakışkan raportör (DNA barkodu) - uygulamaya özel ihtiyaçlara göre hassas bir şekilde değiştirilebilir ve hedef ve serbest bırakma özgüllüklerini uyarlayarak modülerliğe izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları, yazarların kurumundaki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu deneyleri düzgün bir şekilde gerçekleştirmek için barınma odaları, steril davlumbazlar, anestezi ve etik son nokta ötenazi dahil olmak üzere standart hayvan bakım tesisleri gereklidir. Tüm deneyler kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak yürütülür ve kurumdaki veteriner hekim personeli tarafından denetlenir. Deneyler için kullanılan dişi BALB/c fareleri, ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu) ve çalışmanın başlangıcında yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişmektedir. Özel sentezlenmiş DNA, crRNA, FRET bazlı peptit substrat probları ve sensör peptitleri için diziler Ek Tablo 1'de verilmiştir.
1. Proteazla aktive olan peptit substrat seçimi
- Daha önce yayınlanmış bir raporu takiben sağlıklı akciğer veya tümör nodülleri olan akciğer dokusundan doku örnekleri toplayın ve hazırlayın13.
- Dokuların tek hücreli süspansiyonlara otomatik ayrışması için doku ayrışma tüpleri ile önceden soğutulmuş fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) (200 mg doku / mL PBS) içinde dokuları homojenize edin.
- Santrifüj dokusu 6.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika homojenize olur. Süpernatanı yeni bir tüpte tutun.
- Süpernatanı 14.000 x g'da 4 °C'de 25 dakika santrifüjleyin.
- Bikinkoninik asit (BCA) protein tahlil kitini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
- 0.33 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için numuneye PBS ekleyin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek proteolitik aktiviteyi değerlendirin.
- 384 oyuklu bir plakada, her oyuğa 5 μL, 6 μM FRET bazlı peptit substrat probları ekleyin. Her prob için reaksiyonu üç kopya halinde gerçekleştirin.
NOT: FRET bazlı peptit substrat probu, bir florofor ve söndürücü çifti ile sonlandırılmış kısa bir peptit dizisi (bir hedef proteaz veya proteaz grubuna spesifik olacak şekilde tasarlanmış 6-8 amino asit) içerir. Örnek olarak Ek Tablo 1'de iki FRET probu açıklanmıştır. Probların tam kütüphanesi Hao ve ark.'da bulunabilir.13. - Probların plakanın dibinde olduğundan emin olmak için kuyu plakasını oda sıcaklığında 180 xg'de 10 saniye santrifüjleyin.
- Her oyuğa 25 μL 0.33 mg/mL doku örneği veya 40 μM rekombinant proteaz13 ekleyin.
NOT: Doku örneğinin veya rekombinant proteazın nihai konsantrasyonunun, içsel proteolitik aktivitelerine göre optimize edilmesi gerekebilir. Örneğin, bağırsaklar gibi yüksek proteolitik dokular, ilk enzimatik bölünmenin izlenmesine izin vermek için daha yüksek seyreltme faktörleri gerektirebilir. - Probları ve doku lizatlarını karıştırmak için kuyu plakasını 180 x g'da (oda sıcaklığında) kısaca santrifüjleyin.
- Bölünmeyi izlemek için 1 saat boyunca her 2 dakikada bir (λörn: 485 nm; λem: 535 nm) plaka okuyucu ile floresan ölçümü yaparak prob bölünmesini hemen algılamaya başlayın.
NOT: Belirli florofor ve söndürücü çiftleri için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanın. Bu çalışmada, FAM floroforu için parametreler (λex: 485 nm ve λem: 535 nm) ayarlanmıştır. - Floresan ölçüm verilerini analiz etmek için, https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic'da bulunan enzim kinetik analizi için Python (Malzeme Tablosuna bakınız) paketini kullanın. Bu komut dosyası, ilk 8-10 başlangıç zaman noktasının doğrusal uyumunun eğimini kullanarak ilk reaksiyon hızını(V 0) hesaplar.
- 384 oyuklu bir plakada, her oyuğa 5 μL, 6 μM FRET bazlı peptit substrat probları ekleyin. Her prob için reaksiyonu üç kopya halinde gerçekleştirin.
2. Sensör formülasyonu ve karakterizasyonu
- DNA ve proteazla aktive olan peptit (PAP) konjugatını sentezleyin.
- 20-mer fosforotiyoatlı DNA raportörlerini 3'-DBCO grubu ile (1.1 denk, bkz. Malzeme Tablosu) 100 mM fosfat tamponunda (pH 7.0) C-terminal sistein uçlu azid sonlu PAP'lar ile oda sıcaklığında >4 saat inkübe edin. Gece boyunca ayrılacaksanız, 4 °C'de inkübe edin.
- Ürünü, biyomoleküller için ideal bir kolonla donatılmış yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) sisteminde saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu). HPLC gradyanını %5 A tamponundan (H2O'da%0,05 TFA) başlayacak şekilde ayarlayın, 20 dakika boyunca izokratik tutun ve 0,3 mL min-1 akış hızıyla 65 dakikada %80 B tamponuna (%0,05 TFA, %99,95 asetonitril) ulaşın ve eşlenik ürünü ~31 dk'da tutma süresiyle toplayın.
- Saflaştırılmış konjugatları, matris14 olarak α-siyano-4-hidroksisinnamik asit kullanarak matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi ile doğrulayın (bkz.
- DNA kodlu aktivite tabanlı nanosensörleri sentezleyin.
- 2 mg çok değerlikli PEG (40 kDa, 8 kol, Malzeme Tablosuna bakınız) maleimid-reaktif grupla 1 mL 100 mM fosfat tamponu (pH 7.0) ve filtre (kesme: 0.2 μm) içinde çözün.
- Sistein sonlu DNA-peptit konjugatlarını (2 ek., Malzeme Tablosuna bakınız) PEG'ye ekleyin ve oda sıcaklığında >4 saat reaksiyona sokun. Gece boyunca ayrılacaksanız, 4 °C'de inkübe edin.
- Hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) üzerinde ticari olarak temin edilebilen bir dekstran-agaroz kompozit matris sütunu ile boyut dışlama kromatografisi kullanarak konjuge olmayan malzemeleri çıkarın (bkz. Numuneleri PBS'de çalıştırın ve DNA için 260 nm'de ve peptit için 280 nm'de absorbansı izleyin.
- Sentezlenen nanosensörleri, üreticinin tavsiye ettiği hıza göre santrifüj filtre tüpleriyle (MWCO = 10 kDa) konsantre edin (bkz.
- ssDNA test kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) ve λex: 485 nm ve λem: 535 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Nanosensörleri 4 °C'de saklayın.
- DNA kodlu aktivite tabanlı nanosensörleri karakterize edin.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile DNA kodlu nanosensörlerin hidrodinamik parçacık boyutunu ölçün.
NOT: Nanosensörlerin beklenen boyut aralığı 15-50 nm, ortalama boyutu 20-30 nm'dir. Sınırlı bir boyut aralığı isteniyorsa, farklı moleküler ağırlıklara sahip daha dar fraksiyonları izole etmek için FPLC (adım 2.3'te) kullanılabilir. - Nanosensörleri santrifüj filtre tüpleri (MWCO = 10 kDa) ile 0,5 mg/mL'ye (DNA konsantrasyonuna göre) konsantre edin ve numuneleri bir kriyoholder üzerine monte edilmiş karbon film kaplı bakır ızgaraya yükleyin. Kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu (200 kV, 10.000-60.000 büyütme)14 kullanarak morfolojiyi gözlemleyin.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile DNA kodlu nanosensörlerin hidrodinamik parçacık boyutunu ölçün.
3. Sensör enjeksiyonu ve idrar toplama
- Temel ölçüm için idrar toplayın.
- Fareyi, taban olarak 96 oyuklu bir plaka bulunan özel bir muhafaza odasına (bkz. Ek Şekil 1) yerleştirin.
- Fareyi dizginleyin ve kalan idrarı plakaya boşaltmak için mesaneye hafif bir baskı uygulayın.
- Fareyi normal yuvaya yerleştirdikten sonra toplanan idrarı (~ 100-200 μL) 96 oyuklu plakadan 1.5 mL'lik bir tüpe pipetleyin.
- Klinik öncesi murin tümör modeli oluşturun.
- 6 ila 8 haftalık BALB / c dişi fareleri, lusiferaz eksprese eden MC26-Fluc hücre hattı (100k hücre / fare) ile intravenöz enjeksiyonla aşılayın (bkz. Bir in vivo floresan görüntüleme sistemi kullanarak tümör ilerlemesini haftalık olarak izleyin.
NOT: Lüminesan sinyalle gösterilen görünür tümör yükü, bu özel hücre hattının enjeksiyonunun yaklaşık 2. haftasında ortaya çıkar. Tümör ilerlemesi sırasında tümör taşıyan hayvanları düzenli olarak dikkatlice kontrol edin.
- 6 ila 8 haftalık BALB / c dişi fareleri, lusiferaz eksprese eden MC26-Fluc hücre hattı (100k hücre / fare) ile intravenöz enjeksiyonla aşılayın (bkz. Bir in vivo floresan görüntüleme sistemi kullanarak tümör ilerlemesini haftalık olarak izleyin.
- Tümör implantasyonundan sonra nanosensörleri farklı zaman noktalarına enjekte edin.
- Steril PBS'de DNA barkodu ile 1 nmol konsantrasyonda nanosensörler içeren bir enjeksiyon çözeltisi (maksimum 200 μL hacim) hazırlayın.
- PBS'de 200 μL sensör solüsyonunu intravenöz olarak her deneysel fareye enjekte edin.
- Adım 1.1-1.3'te açıklandığı gibi sensör enjeksiyonundan 1 saat sonra sağlıklı kontrol ve tümör taşıyan farelerden idrar örnekleri toplayın.
NOT: Taze idrar örnekleri doğrudan DNA barkod analizine işlenebilir veya hemen buz üzerinde dondurulabilir.
4. DNA barkodlarının CRISPR tespiti: floresan bazlı
- Taze idrar örnekleri kullanın veya donmuş örnekleri buz üzerinde çözün. İdrar örneklerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
- Reaktifleri Ek Tablo 2'de birleştirin, en son Cas12a enzimini ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve reaksiyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Reaksiyonu 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Ek Tablo 3'te gösterildiği gibi, 2. adımın çarpımını kullanarak raportör reaksiyonunu üç kopya halinde çalıştırın. En son Adım 2'deki reaksiyonu ekleyin ve hızlı bir şekilde plaka okuyucuya getirin.
- DNA raportörünün bölünme kinetiğini izlemek için 3 saat boyunca her 2 dakikada bir (λex: 485 nm ve λem: 535 nm) bir plaka okuyucu ile floresansı ölçerek LbaCas12a aktivasyonunu tespit edin.
- Floresan ölçüm verilerini analiz etmek için, https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic'da bulunan enzim kinetik analizi için Python paketini kullanın. Bu komut dosyası, ilk 8-10 başlangıç zaman noktasının doğrusal uyumunun eğimini kullanarak ilk reaksiyon hızını(V 0) hesaplar.
5. DNA barkodlarının CRISPR tespiti: kağıt tabanlı
- İdrar örneklerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Floresan bazlı ve kağıt bazlı CRISPR tespiti için idrar örneklerini paralel olarak çalıştırın. - Reaktifleri Ek Tablo 2'de birleştirin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
NOT: Bu inkübasyon adımı, floresan tabanlı CRISPR tespiti ile aynıdır. - Bir kağıt şerit üzerinde yanal akış tahlili için FAM-biotin etiketli DNA raportörünü kullanarak raportör reaksiyonunu çalıştırın (bkz. Ek Tablo 4'teki reaktifleri, 2. adımın ürününü kullanarak 96 oyuklu bir plakada birleştirin. Alüminyum folyo ile kaplayın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
NOT: Yukarıda açıklanan floresan tabanlı CRISPR algılama testindeki gerçek zamanlı kinetik izlemeye göre en uygun inkübasyon süresini seçin. - 96 oyuklu bir plakanın taze bir kuyusuna 80 μL PBS ekleyin. 3. adımdan bu kuyucuğa 20 μL numune ekleyin.
- Her oyuğa bir yanal akışlı kağıt şerit yerleştirin ve sıvı şeridin tepesine ulaşana kadar bekleyin (<5 dakika). Kağıt şerit üzerinde kontrol ve/veya numune bantlarının görünümüne bakın.
- Yanal akış şeridinin fotoğrafını çekin ve ImageJ'yi kullanarak bant yoğunluğunu ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteazla aktive olan peptit substratlarının isimlendirilmesi
Dokunun proteolitik aktivitesindeki değişiklikleri yansıtacak sensörler tasarlamak için, dokudaki proteaz aktivitesi ilk olarak bir peptit probları13 kütüphanesi kullanılarak karakterize edilir (Şekil 1). Taze ve donmuş doku örnekleri, doku örneklerini substrat bölünmesini tespit etmek için tasarlanmış FRET probları ile birleştirerek tümör mikroçevresinin proteolitik aktivitesi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bir FAM florofor ve bir CPQ-2 söndürücü içeren bir FRET probları kütüphanesi, doku örnekleri ile inkübe edilir. Floresan spektrofotometrisi ile ölçüldüğü üzere, sahte doku ve tümör dokusu arasındaki bölünme oranında en büyük farka sahip problar, in vivo nanosensörlerde kullanılmak üzere peptit bağlayıcılar olarak seçilir (Şekil 1A). Tümör ortamının fizyolojisini daha iyi anlamak ve proteaz ekspresyon profillerini aktivite profilleriyle etkili bir şekilde karşılaştırmak için, FRET probları, Şekil 1B'de iki örnek prob ile gösterildiği gibi, substrat bölünmesini spesifik proteaz aktivitesi ile ilişkilendirmek için rekombinant proteazlarla inkübe edilebilir.
Sensör formülasyonu ve karakterizasyonu
Nanosensörler, Şekil 2A'da gösterildiği gibi bir polimerik çekirdek, peptitler ve tek sarmallı DNA barkodlarından oluşur. Polimerik çekirdekler, 8 adede kadar peptit-DNA konjugatı için taşıyıcı görevi gören 40 kDa, PEG dendrimerleridir (Şekil 2B). Peptitler, ~1.4 kDa, çekirdeği ve DNA'yı proteolitik aktivite yoluyla parçalanmak üzere tasarlanmış bir amino asit dizisine bağlar. Tek sarmallı DNA barkodu 20 baz çifti uzunluğunda, ~6.8 kDa'dır ve in vivo olarak gelişmiş stabilite için kimyasal olarak modifiye edilmiştir. Konjugasyonu takiben, peptit-DNA yapısı, konjuge ve serbest bileşenlerin ayrılmasına izin veren HPLC ile saflaştırılır (Şekil 2C). Kütle spektrometresi analizi, eşleniğin 8.283 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahip olduğunu gösterir, bu da sırasıyla 1.4 kDa ve 6.8 kDa'lık peptit ve DNA barkodu için kurucu moleküler ağırlıklar göz önüne alındığında beklenir. Peptit-DNA konjugatı ayrıca PEG dendrimerine konjuge edilir. Elde edilen sensör, PEGile edilenlere kıyasla daha uzun bir alıkonma süresi sergileyen serbest peptit-DNA'yı çıkarmak için FPLC kullanılarak saflaştırılır (Şekil 2D). Sensörün boyutu, çekirdeğe peptit-DNA ilavesini takiben çapın ~8 nm'den ~20 nm'ye arttığını gösteren dinamik ışık saçılımı ve kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edilebilir (Şekil 2B). Partikül boyutundaki varyans, kurucu zincirlerin esnekliğinden ve her bir PEG dendrimerine konjuge edilmiş değişken sayıda peptit-DNA kolundan kaynaklanabilir.
Klinik öncesi murin hastalığı modeli
Sensörleri test etmek için in vivo çalışma, BALB / c farelerinin akciğerlerinde 3 hafta boyunca tümörlerin oluşturulmasını, nanosensörlerin enjekte edilmesini ve sensör enjeksiyonundan 1 saat sonra idrar toplanmasını içerir (Şekil 3A). Hastalık indüksiyonundan sonra örneklerle karşılaştırmak için tümör aşılamasından önce bir başlangıç idrar örneği de alınır. Sensörün maligniteyi tespit etmedeki etkinliğini değerlendirmek için, lusiferaz ekspresyonu kolorektal kanser hücre hattı MC26 (MC26-Fluc) intravenöz olarak enjekte edilir ve bu da in vivo lüminesans görüntülemede görülebilen akciğer tümörü nodülleri ile sonuçlanır. Hematoksilen ve eozin boyaması13, Şekil 3B'de siyah oklarla gösterildiği gibi, sırasıyla tümör taşıyan ve sahte kontrol farelerinden alınan akciğer dokusunun histopatolojisini ve enjeksiyondan 11 ve 21 gün sonra tümör oluşumunun kanıtlarını ortaya koymaktadır.
Kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA ile CRISPR aktivasyonu
ssDNA barkodları ve tamamlayıcı crRNA eşleştirmesi yoluyla Cas12a aktivasyonunu optimize etmek için farklı oligonükleotid dizileri ve uzunlukları test edilmiştir. Cas12a'nın aktivasyonu, bir FRET eşleşmesi ile seyirci DNA muhabirinin Cas12a bölünmesi nedeniyle zaman içinde floresanstaki artışın ölçülmesiyle değerlendirilir. Bölünme oranındaki bir artış, temsili bir crRNA/barkod çifti ile gösterildiği gibi, kimyasal olarak modifiye edilmiş ssDNA barkodunun daha yüksek konsantrasyonları ile ilişkilidir (Şekil 4B). Önemli olarak, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, konsantrasyon ve aktivasyon arasındaki doğrusal bir ilişki, okumanın idrarda DNA barkodu varlığını yansıtmasını ve in vivo olarak proteolitik aktiviteyi dolaylı olarak yansıtmasını sağlar. Ayrıca, Ek Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi birden fazla farklı crRNA dizisi, çoğullamayı etkinleştirmek için kritik olan Cas12a aktivasyonu için kullanılabilir. DNA aktivatörleri, test performansındaki benzerliklerine dayanarak in vivo sensörlerin yapımı için seçilmiştir. Sentetik biyobelirteçin in vivo stabilitesi için kritik olan kimyasal olarak modifiye edilmiş ssDNA, modifiye edilmemiş dsDNA ve ssDNA ile karşılaştırıldığında Cas12a aktivasyonu göstermiştir (Şekil 4C).
Kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA barkodlarının çoğullanmış idrar tespiti
Çoklu crRNA ile modifiye edilmiş tek sarmallı DNA (ssDNA) aktivatör çiftleri, farklı diziler arasındaki ortogonallikleri açısından doğrulanmıştır. Bu, Şekil 5A'da gösterildiği gibi çoklu kuyu tahlillerinde eşzamanlı okumaya izin verir. Ek olarak, işlenmemiş idrardaki modifiye DNA molekülleri, Şekil 5B'de gösterildiği gibi, yanal akışlı kağıt şeritler üzerinde kolorimetrik bir okuma kullanılarak tespit edilebilir. Önde gelen 'örnek bandın' varlığı, Cas12a'nın idrar DNA'sı tarafından tetiklenmesinden sonra raportör bölünmesi yoluyla saptanabilir FAM'in salındığını gösterir. Cas12a, fare idrarındaki DNA aktivatörü tarafından aktive edildiğinde, floresein (FAM)-biyotin ile eşleştirilmiş oligonükleotid raportörünü parçalayarak FAM molekülünü serbest bırakır ve daha sonra 'numune bandında' tespit edilebilir. Ayrılmamış muhabirler, biyotinin streptavidin'e bağlanması nedeniyle 'kontrol bandında' yakalanır. Nanosensörler in vivo deneyler için seçilir ve proteazla aktive edilebilir peptitler ve farklı DNA barkodları kullanılarak oluşturulur. Peptitler, ex vivo doku profillemesi yoluyla aday gösterilir (Şekil 1A) ve DNA barkodları, benzer Cas12a aktivasyonuna göre seçilir (Şekil 4B).
Şekil 1: Sensör yapımı için kolorektal kanserde düzensiz proteazlar tarafından aktive edilen peptit substratlarının tanımlanması. (A) Her biri bir FAM florofor ve bir CPQ-2 söndürücü ile çevrili bir peptit dizisinden oluşan FRET eşleştirilmiş peptit substratları, rekombinant proteolitik enzimlere veya doku homojenatlarına karşı taranır. (B) FRET ile eşleştirilmiş peptit substratlarının temsili proteaz bölünme kinetiği (Prob 1 ve 2). Şekil Hao ve ark.13'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Polimerik PEG çekirdekli DNA barkodlu aktivite tabanlı nanosensörün karakterizasyonu. (A) DNA barkodlu nanosensörler, oligonükleotidlerle barkodlanmış proteazla aktive edilmiş peptitlerle işlevselleştirilmiş polimerik nanotaşıyıcı (8 kollu PEG) içerir. (B) Dinamik ışık saçılımı analizi, parçacık boyutunun 8,3 nm'den (yalnızca PEG çekirdeği) ve 13 nm'den (işlevselleştirilmiş sensör) arttığını gösterir. (C) Peptit-DNA konjugatının HPLC saflaştırılması. Eşlenik, kütle spektrometrisinde analiz edilir ve beklenen moleküler ağırlığı gösterir. (D) Sensörün FPLC saflaştırması, işlevselleştirilmiş sensörün ve bağlanmamış peptit-DNA konjugatının ayrılmasını gösterir. Şekil Hao ve ark.13'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İn vivo hastalık indüksiyonu ve sensör kullanımı. (A) Tümör gelişimi boyunca farklı zaman noktalarında nanosensör ile uzunlamasına tümör izleme zaman çizelgesi. (B) Tümör aşılamasından 11 ve 21 gün sonra CRC akciğer tümörleri taşıyan BALB / c farelerinin histolojik akciğer boyaması ve salin enjekte edilen Sham kontrol fareleri. Ölçek çubuğu = 200 μm. Organlar sabitlendi, parafine gömüldü ve hematoksilen ve eozin ile boyandı. Çalışma, zaman noktası başına n = 3 fare ile yapıldı ve temsili bir hayvandan alınan görüntüler gösterildi. Oklar akciğerdeki tümör nodüllerini gösterir. Şekil Hao ve ark.13'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA aktivatörleri ile Cas12a aktivasyonu. (A) Cas12a'nın tamamlayıcı crRNA ile bağlanma yoluyla temsili bir ssDNA barkodu ile aktivasyonu, spektrofotometre aracılığıyla floresan yoğunluğu ile ölçüldüğü gibi, seyirci DNA'sının doza bağlı bir şekilde trans-bölünmesine neden olur. (B) İlk reaksiyon hızı (V0), (A)'daki bir reaksiyonun başlangıcındaki eğrinin eğiminden belirlenir ve tahlil performansının doğrusal aralığını belirlemek için çizilir. (C) Çift sarmallı, tek sarmallı ve kimyasal olarak modifiye edilmiş DNA aktivatörleri ile Cas12a aktivasyonu. Şekil Hao ve ark.13'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İki algılama seçeneği ile çoğullanmış CRISPR-Cas12 aracılı DNA barkod okuması. (A) Farklı modifiye ssDNA aktivatör-crRNA çiftlerinin aktivasyonu üzerine Cas12a'nın trans-bölünme oranları, Cas12a floresan bölünme testinde belirlenir. Tahliller, 1 saatlik IV uygulamasından sonra 1 nmol modifiye ssDNA aktivatörü enjekte edilen farelerden toplanan idrar örnekleri ile gerçekleştirilir. Şekil Hao ve ark.13'ten uyarlanmıştır. (B) Kolorimetrik değişikliklerle idrar örneğiyle aktive edilen Cas12a'nın kağıt okuması, kağıt şeridin farklı yerlerinde görünür. Üst bant bölünmüş FAM DNA muhabirinden, alt bant ise bölünmemiş FAM-biyotin muhabirindendir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: 96 oyuklu bir plakanın üzerine yerleştirilecek idrar toplama odası. Fare, 96 oyuklu plakaya idrar yapmak için geçici olarak silindirin içine yerleştirilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Sensör formülasyonu ve CRISPR testi için oligo ve peptit dizileri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: Floresan bazlı ve kağıt bazlı Cas12a ve idrar numunesi reaksiyonu için reaktifler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 3: Floresan tabanlı CRISPR tespiti için raportör reaksiyonunun reaktifleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 4: Kağıt tabanlı CRISPR tespiti için raportör reaksiyonunun reaktifleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, minimal invaziv enjekte edilmiş bir sensör kullanarak hastalıkla ilişkili proteolitik aktiviteyi değerlendiren taşınabilir bir idrar testi ile çoğullanmış kanser tespiti için son derece özelleştirilebilir bir platform sunulmaktadır. Tümör proteazları tarafından aktive edildiğinde, peptit substrat bölünmesi, idrara DNA barkod salınımı yoluyla amplifiye edilir. Bir idrar örneğindeki sentetik DNA raportörleri, florometrik algılama veya basit bir kağıt tabanlı test kullanılarak ikincil bir CRISPR-Cas aracılı enzimatik amplifikasyon ile okunabilir. DNA barkodlaması, çoğulluk sağlamak için sentetik biyobelirteçleri etiketlemek için çekici bir yöntemdir. Kimyasal modifikasyon yoluyla DNA barkodlarının stabilitesinin iyileştirilmesi, nanosensör stabilitesinin in vivo olarak korunması için zorunludur. Spesifik olarak, CRISPR-Cas12a aracılığıyla DNA barkod tespiti, stabilize edilmiş bir omurgaya sahip tamamen fosforotiyoat ile modifiye edilmiş DNA barkodları kullanılarak etkinleştirilebilir. Bununla birlikte, kimyasal modifikasyon, artan stabilitesi nedeniyle, doğal DNA muadili ile birlikte CRISPR-Cas12a aktivasyonunun hızını azaltır. Ayrıca, crRNA'ya terminal modifikasyonları eklemek veya DNA barkodlarında farklı modifiye oligonükleotidleri test etmek, CRISPR aracılı DNA barkod tespitinin15 hassasiyetini daha da artırabilir ve böylece kanser teşhisinin tespit sınırını (LOD) iyileştirebilir.
Moleküler amplifikasyona ek olarak, erken kanser teşhisi için gerekli LOD'ye ulaşmak için bir başka önemli strateji, sentetik DNA raportörlerini idrarda konsantre etmek için böbrekler tarafından boyut filtrasyonundan yararlanmayı içerir. Bu amaçla, DNA barkodlarının boyutunu optimize etmek çok önemlidir. 20-mer crRNA tamamlayıcı DNA'lar, idrar örneklerinden optimal CRISPR-Cas12a aracılı DNA barkod okuması sergiledi. Bu optimum uzunluk, farklı CRISPR nükleazlarına veya klinik öncesi hayvan modellerine uygulandığında farklılık gösterebilir.
Bu algılama sisteminin tekrarlanabilirliğini korumak için, partiden partiye varyasyonu en aza indirmek için enjekte edilebilir nanosensörlerin kapsamlı bir karakterizasyonunun yapılması önemlidir. Çekirdek başına peptit-DNA konjugatlarının sayısındaki değişiklik, idrara salınan DNA barkodlarının miktarını değiştirecek ve bu nedenle son okumayı etkileyecektir. Benzer şekilde, sensörün intravenöz olarak dikkatli bir şekilde enjeksiyonu, sensör dozajında tutarlılığa yardımcı olacaktır. Belirli bir zaman noktasında her hayvandan en az 50 μL idrar hacminin uygun şekilde idrar toplanmasını sağlamak için, tümör taşıyan hayvan hidrasyonunun sürdürülmesi kritik öneme sahiptir. Bu, fareleri ıslatmayan su jeli üzerinde tutarak veya idrar toplamadan bir saat önce deri altına PBS enjekte ederekdesteklenebilir 16.
İdrar toplama zamanlaması ve CRISPR-Cas aracılı DNA barkod okuma süresi, test tutarlılığı için kritik faktörlerdir. Dolaşımdaki barkodlar, intravenöz enjeksiyondan ve kandan boyuta bağlı böbrek filtrasyonundan sonra karakteristik tek üstel konsantrasyon bozulmasına uğrar ve fare modellerinde uygulamadan 1 saat sonra zirve yapar13. Bu zaman noktası farklı bir hayvan modelinde değişebilir. CRISPR-Cas aktivasyon testlerinin iki okuma formatı için (floresan ve kağıt bazlı yanal akış testi), yanal akıştan önce floresan tabanlı kinetiği izlemek önemlidir, bu da CRISPR-Cas bölünme ürününü okumak için en uygun son noktaya izin verir.
Bu yaklaşım, proteolitik ve CRISPR-Cas aracılı enzimatik aktivasyondan çift sinyal amplifikasyon adımlarının dahil edilmesi ve hastalığın karmaşıklığını yakalamak için çoğullama yeteneği nedeniyle avantajlıdır. Sensörlerin çoklayıcılığının genişletilmesi, taşınabilirliği ve kullanım kolaylığını korumak için dikkatli malzeme dozajlamasının yanı sıra okuma verimini genişletmeyi gerektirecektir. Bu strateji, birden fazla modelde proteaz aktivitesinin kapsamlı bir karakterizasyonunu ve proteolitik profilin belirli bir hastalığa veya hastalık evresine özgüllüğünü gerektirir. Ayrıca, sensör enjeksiyonu, biyopsi gibi tanı alternatiflerinin çoğundan daha az invaziv olsa da, intravenöz enjeksiyon, sensör uygulaması için eğitimli flebotomistlere güvenebilir ve bu da potansiyel olarak kullanım durumunu klinik bir ortamda ilk tespitten ziyade hastalık izleme ile sınırlayabilir. Sistemik enjeksiyona ek olarak, DNA barkodlu nanosensörler, taşınabilir hastalık tespiti ve hastalık ilerlemesinin ve tedavi değerlendirmesinin kendi kendine kolayca izlenmesine izin vermek için noninvaziv oral, inhale ve topikal uygulama yoluyla uygulanabilen formülasyonlarla daha da tasarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.N.B., L.H. ve R.T.Z. bu çalışmanın içeriğiyle ilgili bir patent başvurusunda mucit olarak listelenmiştir. S.N.B., Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio'da hisse sahibidir ve Vertex'te yöneticidir; Moderna'ya danışmanlık yapıyor ve Johnson & Johnson, Revitope ve Owlstone'dan sponsorlu araştırma fonu alıyor.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (Swanson Biyoteknoloji Merkezi) P30-CA14051 numaralı Koch Enstitüsü Destek Hibesi, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nden P30-ES002109 Çekirdek Merkez Hibesi, Koch Enstitüsü'nün Kanser Nanotıp Mermer Merkezi, Kathy ve Curt Marble Kanser Araştırma Fonu aracılığıyla Koch Enstitüsü Sınır Araştırma Programı, ve Virginia ve D. K. Ludwig Kanser Araştırmaları Fonu. A.E.V.H., NIH tarafından finanse edilen bir doktora öncesi eğitim bursu (T32GM130546) tarafından desteklenmektedir. S.N.B. Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacısıdır. L.H., Ulusal Kanser Enstitüsü'nden K99/R00 Bağımsızlığa Giden Yol Ödülü ve Boston Üniversitesi'nden başlangıç fonu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
- Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
- Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
- Hanahan, D.
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
- Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Choi, H. S., et al.
- Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
- Hao, L., et al.
- Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
- Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).
