תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה
Summary
Aplysia נוירונים californica לפתח קונוסים צמיחה גדול בתרבות כי הם מעולה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צמיחה חרוט והדרכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה ו ציפוי של תא עצב Aplysia התיק, כמו גם להקמת תא הדמיה תא חי.
Abstract
קונוסים הצמיחה העצבית הם מבנים ניעתי מאוד בקצה של אקסונים כי ניתן לזהות רמזים הדרכה הסביבה transduce מידע זה לתנועה כיוונית לכיוון תא היעד המתאים. כדי להבין כיצד מידע והדרכה מועבר מתא השטח לרשתות הבסיסית cytoskeletal דינמי, צריך מערכת מודל מתאים הדמיה תא חי של הדינמיקה חלבון ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. טיפוסית גביעי צמיחה חוליות קטנים מדי כדי לנתח באופן כמותי F-אקטין ודינמיקה microtubule. נוירונים של ארנבת ים Aplysia californica לפעמים 5-10 גדול יותר נוירונים החוליות, יכול בקלות להיות כל הזמן בטמפרטורת החדר הם תאים חזקים מאוד המיקרומניפולציה מדידות biophysical. קונוסים הצמיחה שלהם הגדירו מאוד אזורים cytoplasmic ומערכת היטב תיאר cytoskeletal. גופי התא העצבי יכול להיות microinjected עם מגוון רחב של בדיקות לחקר חרוט צמיחה תנועתיות והדרכה. בפרוטוקול הנוכחי אנחנו מדגימים נוהל דיסקציה של הגנגליון הבטן, תרבות של נוירונים תא שקית והקמת תא הדמיה הדמיה תא חי של קונוסים צמיחה.
Protocol
Discussion
תא Aplysia נוירונים תיק לספק סרום ללא מערכת העצבית עם תרבית תאים לא עצביים תאים בודדים. נוירונים אלה מהווים קונוסים צמיחה גדול מאוד מתאים לכתובת מספר שאלות חשובות תא ביולוגי. תא עצב תיק יכול בקלות להיות מניפולציות צילמו בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב…
Acknowledgements
ברצוננו להודות ריאן Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) עבור הצילומים ההליך שלנו רודני McPhail (מחלקת מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue) לקבלת סיוע עם עריכת וידאו לנתיחה. מחקר במעבדה סוטר הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH (R01 NS049233) והמרכז Bindley Bioscience באוניברסיטת Purdue כדי DMS
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
