יצירה וניתוח במורד הזרם של תעתיקים חד-תאיים וגרעינים בודדים באורגנואידים במוח
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.
Abstract
במהלך העשור האחרון, שעתוק חד-תאי התפתח באופן משמעותי והפך לשיטת מעבדה סטנדרטית לניתוח סימולטני של פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים, המאפשר ללכוד את המגוון התאי. על מנת להתגבר על המגבלות שמציבים סוגי תאים קשים לבידוד, ניתן להשתמש בגישה חלופית שמטרתה לשחזר גרעינים בודדים במקום תאים שלמים לריצוף, מה שהופך את פרופיל השעתוק של תאים בודדים ליישום אוניברסלי. טכניקות אלה הפכו לאבן פינה בחקר אורגנואידים במוח, וביססו אותם כמודלים של המוח האנושי המתפתח. תוך מינוף הפוטנציאל של שעתוק חד-תאי וחד-גרעין במחקר אורגנואידים במוח, פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב המקיף הליכים מרכזיים כגון דיסוציאציה אורגנואידית, בידוד תא בודד או גרעינים, הכנת ספרייה וריצוף. על ידי יישום גישות חלופיות אלה, חוקרים יכולים להשיג מערכי נתונים באיכות גבוהה, המאפשרים זיהוי של סוגי תאים עצביים ולא עצביים, פרופילי ביטוי גנים ומסלולי שושלת תאים. זה מאפשר חקירות מקיפות של תהליכים תאיים ומנגנונים מולקולריים המעצבים את התפתחות המוח.
Introduction
במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות אורגנואידים התגלו ככלי מבטיח לתרבית רקמות דמויות איברים 1,2,3. במיוחד עבור איברים שלא ניתן לגשת אליהם בקלות, כגון המוח האנושי, אורגנואידים מציעים הזדמנות לקבל תובנות לגבי התפתחות וביטוי מחלות4. ככאלה, אורגנואידים במוח נמצאים בשימוש נרחב כמודל ניסיוני לחקר הפרעות מוח אנושיות שונות, כולל מחלות התפתחותיות, פסיכיאטריות או אפילו נוירודגנרטיביות 4,5,6.
עם הופעתן של טכנולוגיות פרופיל שעתוק חד-תאי, רקמות אנושיות ראשוניות ומודלים מורכבים במבחנה יכלו להיחקר ברמת פירוט חסרת תקדים, לספק תובנות מכניסטיות לגבי שינויים בביטוי גנים ברמת תת-אוכלוסיות התא בבריאות ובמחלות וליידע על מטרות טיפוליות משוערות חדשות 7,8,9. תחום האורגנואידים התקדם על ידי שימוש בפרופיל שעתוק חד-תאי כדי להעריך את הרכב התא, יכולת השחזור והנאמנות של טכנולוגיות אורגנואידים במוח 10,11,12. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) איפשר סיווג תאים וזיהוי של חוסר ויסות גנטי באורגנואידים חולים13,14. חשוב לציין, המורכבות של רקמות אורגנואידים היא שמחייבת יישום של טכניקות המאפשרות פרופיל של תאים בודדים. אפיון אורגנואידים בשיטות כגון פרופיל שעתוק בתפזורת (ריצוף RNA בתפזורת) מוביל להטרוגניות תאית מוסווית ולפרופילי ביטוי גנים הממוצעים על פני כל סוגי התאים ברקמה המורכבת, ובסופו של דבר מגבילים את הבנתנו את התהליכים המתמשכים במהלך התפתחות אורגנואידים בבריאות ובמחלות 15,16,17 . ככל ששיטות scRNA-seq ממשיכות להתקדם, מספר גדל והולך של אטלסים נוצרים, כפי שמודגם על ידי משאבים כמו אטלס המוח אלן או אטלס התא היחיד של אורגנואידים במוח האנושי על ידי Uzquiano et al.18.
השגת scRNA-seq מוצלח מאורגנואידים במוח מסתמכת על בידוד יעיל ולכידת תאים שלמים. מכיוון שהדיסוציאציה של אורגנואידים במוח להשגת תאים בודדים מבוססת על עיכול אנזימטי, היא יכולה להשפיע על דפוסי ביטוי גנים על ידי גרימת מתח ונזק לתאים19,20. לפיכך, הדיסוציאציה של הרקמה לתאים בודדים היא הצעד המכריע ביותר. גישה חלופית היא ריצוף RNA חד-גרעין (snRNA-seq), המאפשר מיצוי ללא אנזימים של גרעינים מרקמה21,22 טרייה וקפואה. עם זאת, בידוד גרעינים מרקמה מציב אתגרים אחרים כגון העשרת סוגי תאים מעניינים ותכולת RNA נמוכה של גרעינים בהשוואה לתאים.
מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח נערכים בדרך כלל באמצעות scRNA-seq 10,18,23. עם זאת, בידוד של גרעינים בודדים עשוי לספק שיטה אורתוגונלית ומשלימה לחקור את הפרופיל התעתיק של אורגנואידים. כאן, אנו מציגים ארגז כלים עבור scRNA- ו- snRNA-seq עבור אורגנואידים במוח ודנים בנקודות הקריטיות להשגת נתוני ריצוף באיכות הטובה ביותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח שעתוק של תאים בודדים וגרעינים בודדים התגלה ככלי מרכזי להבנת מנגנוני בקרת גנים בתוך רקמות מורכבות. שתי השיטות מאפשרות מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח. כדי להבטיח ניסוי מוצלח כולל, איכות חומר המוצא היא בעלת רלוונטיות גבוהה. לכן, יש צורך לחתוך את האורגנואידים באופן קבוע כדי למנוע היווצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לולריה פרננדז-ואלון על ההוראות המקוריות לערכת הדיסוציאציה העצבית של Miltenyi. אנו מודים גם לפלטפורמת הטכנולוגיה הגנומית של מרכז מקס דלברוק על שסיפקה את המתכון למאגר הליזיס NP40 ועל העצות החשובות להגדרת פרוטוקול זה. אנו מודים גם למרגרטה הרצוג ולאלכסנדרה צ’רנישף על התמיכה הארגונית במעבדה.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
References
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
- Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
- Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
- Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
- Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
- Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
- Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
- Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
- Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
- Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).
