Summary
In dit protocol hebben we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (RA) ontwikkeld dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. Door de door de FDA goedgekeurde RA aan de nano-emulsie toe te voegen, werd antigeenspecifiek sIgA gepromoot in de vagina en dunne darm na intramusculaire injectie van de nano-emulsie.
Abstract
Kationische nanostructuren zijn naar voren gekomen als een adjuvans en antigeenafgiftesysteem dat de rijping van dendritische cellen, ROS-generatie en antigeenopname verbetert en vervolgens antigeenspecifieke immuunresponsen bevordert. In de afgelopen jaren heeft retinoïnezuur (RA) steeds meer aandacht gekregen vanwege het effect ervan bij het activeren van de mucosale immuunrespons; om RA echter als mucosale adjuvans te gebruiken, is het noodzakelijk om het probleem van het oplossen, laden en afleveren op te lossen. Hier beschrijven we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (CNE-RA) afgiftesysteem dat bestaat uit het kationische lipide 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOTAP), retinoïnezuur, squaleen als de oliefase, polysorbaat 80 als oppervlakteactieve stof en sorbitaantrioleaat 85 als co-oppervlakteactieve stof. De fysische en chemische eigenschappen werden gekarakteriseerd met behulp van dynamische lichtverstrooiing en een spectrofotometer. Immunisatie van muizen met het mengsel van antigeen (ovalbumine, OVA) en CNE-RA verhoogde significant de niveaus van anti-OVA secretoire immunoglobuline A (sIgA) in vaginale spoelvloeistof en de dunne darmspoelvloeistof van muizen in vergelijking met OVA alleen. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de voorbereiding, karakterisering en evaluatie van het adjuvante effect van CNE-RA.
Introduction
Adjuvantia worden vaak gebruikt om de werkzaamheid van een vaccin te verbeteren door het immuunsysteem te stimuleren om sterker op het vaccin te reageren, waardoor de immuniteit tegen een bepaalde ziekteverwekker wordtverhoogd. Nano-emulsie (NE) adjuvans verwijst naar een colloïdaal dispersiesysteem met thermodynamische stabiliteit door een bepaald deel van de oliefase en de waterige fase te emulgeren om een emulsie te produceren in de vorm van water-in-olie (W/O) of olie-in-water (O/W)2. O/W nano-emulsieadjuvans kan cytokines en chemokinen op de injectieplaats produceren, de snelle aggregatie en proliferatie van belangrijke immuuncellen zoals monocyten, neutrofielen en eosinofielen induceren, en de immuunrespons versterken en de immunogeniciteit van antigenen verbeteren3. Momenteel zijn drie nano-emulsieadjuvantia (MF59, AS03 en AF03) goedgekeurd voor gebruik in vaccins en hebben ze een goede veiligheid en werkzaamheid aangetoond4.
Mucosale immuniteit is echter slecht aangepakt door de momenteel goedgekeurde adjuvante formuleringen in conventionele parenterale vaccinatie5. Van retinoïnezuur (RA) is gemeld dat het intestinale homing van immuuncellen induceert, maar de lage polariteit, slechte oplosbaarheid in water en slechte licht- en thermische stabiliteit beperken het gebruik ervan voor robuuste darmvaccinatie. Nano-emulsies bieden mogelijkheden om de biologische beschikbaarheid van zeer lipofiele geneesmiddelen te verhogen, en de oliekern van O/W-emulsieadjuvantia is geschikt voor het oplossen van niet-polaire stoffen zoals RA6. Daarom kunnen nano-emulsies worden gebruikt als dragers voor RA om het dubbele responseffect van systemische immuniteit en mucosale immuniteit te bereiken.
Vergeleken met neutrale of anionische toedieningssystemen hebben kationische afgiftesystemen relatief efficiënte antigeeninkapseling en -afgiftemogelijkheden, wat de immunogeniciteit van antigenen kan verbeteren 7,8,9. De kationische oppervlaktelading van een verscheidenheid aan adjuvante systemen is belangrijk voor hun adjuvante effecten 10,11,12. De kationische lading is een belangrijke factor bij het verlengen van de retentie van het vaccin op de injectieplaats, het verhogen van de antigeenpresentatie en het verlengen van de stimulatie van de cellulaire immuniteit in het lichaam12.
Op basis van de bovenstaande overwegingen hebben we een kationische nano-emulsie ontwikkeld om RA en antigenen effectief samen af te leveren. De deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de nano-emulsie werden bepaald met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS), en de systemische en mucosale immuunresponsen van de nano-emulsie in combinatie met OVA werden geëvalueerd door intramusculaire injectie13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Leidraad voor het Gebruik en de Verzorging van Proefdieren en goedgekeurd door de Commissie Welzijn en Ethiek Proefdieren van de Derde Militaire Medische Universiteit.
1. Bereiding van nano-emulsies (NE's)
- Voor de bereiding in de waterige fase lost u 0,15 g polysorbaat 80 op in 28,2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) terwijl u roert bij 40 °C.
- Gebruik voor de bereiding van de oliefase de oliefaseformulering van de nano-emulsie zoals weergegeven in tabel 1. Los het sornitaantrilleaat 85, DOTAP en RA al roerend op 40 °C op in squaleen.
- Voor de primaire O/W-emulsiebereiding roert u de oliefase magnetisch met 1400 tpm terwijl u het waterige langzaam en druppelsgewijs toevoegt met een snelheid van 1 ml/min. Emulgeer het mengsel vooraf met behulp van een high-shear emulgator bij 30.000 tpm gedurende 6 minuten.
- Voor hogedrukhomogenisatie (HPH) behandelt u de hierboven bereide primaire O/W-emulsie met een hogedrukhomogenisator gedurende 12 cycli bij 900 bar om een homogene nano-emulsie in het bereik van 160-190 nm te verkrijgen.
- Verzamel aan het einde van het proces de emulsie in een kolf van 50 ml en filtreer de emulsie door een PES-filtermembraan van 0,2 μm.
- Sluit de kolf via de katheter aan op de Schlenk-lijn, draai aan de driewegkraan om het systeem op de vacuümbuis aan te sluiten en zet de vacuümpomp aan om vacuüm in de kolf te creëren. Draai vervolgens aan de driewegkraan het systeem aan op de Argon-buis en vul deze met Argon. Herhaal deze stap 3x om er zeker van te zijn dat de kolf gevuld is met Argon.
- Vervang de kurk en sluit af met een paraffiene folie, wikkel de kolf in aluminiumfolie en bewaar deze bij 4 °C.
2. Karakterisering van de nano-emulsies
- Detectie van deeltjesgrootte en zeta-potentiaal
- Schakel het instrument in en wacht 30 minuten totdat de laserlichtbron is gestabiliseerd.
- Verdun de NE 50-voudig met ultrapuur water en voeg 1 ml monster toe aan de overeenkomstige monstercel.
- Om de deeltjesgrootte te meten, stelt u de temperatuur in op 25 °C, selecteert u water als dispergeermedium en selecteert u plastic wegwerpschaaltjes als meetcel. Laad de monsters en meet automatisch. Rapporteer de gemiddelde waarde van drie herhaalde metingen voor elk monster als eindresultaat.
- Voor het meten van het zetapotentiaal stelt u de temperatuur in op 25 °C. Vanwege de keuze van de waterige fase als dispersiemedium, kiest u het Smoluchowsi-model en de gevouwen capillaire cel als meetcel. Laad de monsters en meet automatisch. Rapporteer het gemiddelde van drie gerepliceerde metingen voor elk monster als het eindresultaat.
- Bepaling van de inkapselingssnelheid en de laadsnelheid van geneesmiddelen
- Om de hoeveelheid RA te bepalen die in de NE is geladen, gebruikt u absolute ethanol om de RA te demulgeren en uit de NE te extraheren. Voeg aan 5 μl monster 995 μl ethanol toe en bepaal het RA-gehalte van de oplossing met behulp van een spectrofotometer bij 355 nm. Vergelijk de absorptie met een standaardcurve. Gebruik de volgende vergelijking:
Inkapseling = werkelijke RA-belasting/gewicht van het toegevoegde geneesmiddel
Laadsnelheid van het geneesmiddel = werkelijke RA-belasting / kwaliteit van het monster
- Om de hoeveelheid RA te bepalen die in de NE is geladen, gebruikt u absolute ethanol om de RA te demulgeren en uit de NE te extraheren. Voeg aan 5 μl monster 995 μl ethanol toe en bepaal het RA-gehalte van de oplossing met behulp van een spectrofotometer bij 355 nm. Vergelijk de absorptie met een standaardcurve. Gebruik de volgende vergelijking:
3. Immunisatieprocedures en monsterneming
- Immunisatieprocedure en groepering
- Groep vrouwelijke Balb/C-muizen van 6-8 weken oud en met een gewicht van ongeveer 18-21 g in sets van 5 voor immunisatie op dag 0, dag 14, dag 28 volgens de volgende experimentele groepen: (1) PBS-groep, (2) ovalbumine (OVA) groep, (3) OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA) groep, (4) OVA+CNE-RA (OVA/CNE-RA) groep.
- Immuniseer alle muizen door intramusculaire injectie in de bovenste quadricepsspieren met 200 μL van verschillende vaccinformuleringen: 100 μL emulsie en 15 μg OVA geabsorbeerd in 100 μL PBS, gemengd vóór toediening. Injecteer 100 μL/achterpoot. Voor muizen in de controlegroep alleen PBS toedienen.
- Euthanasie: Euthanaseer alle muizen door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital 2 weken na voltooiing van de drie immunisaties.
- Monsterafname en verwerking: Gebruik na euthanasie een schaar om de borstkas van muizen open te knippen en steek een spuit rechtstreeks in het hart om ongeveer 0,5 ml volbloed op te zuigen. Laat het bloed 2 uur bij kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 4 °C op 1800 x g bij 4 °C. Verzamel serum, aliquot en bewaar bij -80 °C voor verdere analyse.
- Verzamel volbloed, milt, vaginale spoelvloeistof (VLF), bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), neusspoelvloeistof (NLF) en dunne darmspoelvloeistof (SILF).
- Isolatie van miltlymfocyten
- Week de muizen in ethanol 75% (v/v) voor een korte sterilisatie, breng de muizen over naar een schone bank. Knip de huid op de linkerbuik af met een schaar, leg de milt bloot en verwijder deze.
- Plaats de milt in een petrischaal met 3 ml PBS, maal en filtreer in een centrifugebuis van 15 ml met behulp van een zeef (200 mesh, 70 μm) en een maalstaaf.
- Centrifugeer de cellen bij 650 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en suspendeer het neerslag met 3 ml lyse-oplossing voor rode bloedcellen, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 ml PBS toe aan de tube en schud goed om de reactie te beëindigen, centrifugeer het vervolgens 5 minuten op 650 x g bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 10 ml PBS, voeg 20 μl van de celverdunning toe aan de geautomatiseerde celteller voor het tellen van cellen.
- Centrifugeer de cellen bij 650 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en verdun de cellen tot 1 x 106 cellen/ml met 1640 compleet medium (1% penicilline-streptomycine, 10% foetaal runderserum).
- VLF-verzameling: Spoel de vagina 4x met 75 μL 1%BSA/PBST, combineer de spoeloplossing en verzamel in centrifugebuisjes van 1,5 ml, centrifugeer op 5000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten en verzamel het supernatans met een pipet en bewaar bij -80 °C.
- BALF en NLF collectie
- Desinfecteer de muizen na het offeren met 75% (v/v) ethanol. Houd de buik van de muis omhoog en strek de nek. Gebruik een schaar om een longitudinale incisie in de huid van de muizennek te maken en gebruik een pincet om de spieren te scheiden en de luchtpijp adequaat bloot te leggen.
- Snijd de luchtpijp door een kleine dwarsopening en steek de slang in de richting van de longen, bevestig de spuit aan de slang en injecteer 0,5 ml PBS in de longen en trek op, herhaal het spoelen 3x en centrifugeer op 650 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten, bewaar het supernatans (BALF) bij -80 °C.
- Draai de slang terug naar de neusholte, bevestig de spuit aan de slang en injecteer 0,5 ml PBS, de vloeistof stroomt door de neusholte in de centrifugebuis van 1,5 ml. Zuig het wasgoed uit de centrifugebuis en herhaal de spoeling 2x, centrifugeer vervolgens op 650 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten, bewaar het supernatans (NLF) bij -80 °C.
- SILF collectie
- Bereid PBS-oplossing met 0,1 mg/ml trypsineremmer, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/l fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) als spoeloplossing in de dunne darm. Roer op kamertemperatuur om op te lossen en bewaar bij 4 °C.
- Snijd de dunne darm langs de darmbuis open en dompel deze onder in 3 ml spoelvloeistof voor de dunne darm. Meng door verticaal schudden bij 15 tpm gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer bij 1440 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten en vang het supernatans op met een pipet, centrifugeer vervolgens bij 5000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten. Bewaar het supernatans (SILF) bij -80 °C.
4. Evaluatie van OVA-specifieke antilichaamrespons na intramusculaire toediening
- Bepaal serumspiegels van IgG, subklassen van IgG1, IgG2a en de niveaus van specifiek sIgA in VLF, BALF, NLF en SILF door middel van enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA).
- Voor antigeencoating verdunt OVA tot 5 μg/ml met coatingbuffer en smeer ELISA-platen met 96 putjes een nacht in bij 4 °C met 100 μl OVA-oplossing per putje.
- Was de ELISA-platen 5x met PBST en blokkeer ze door incubatie met 250 μL 1%BSA/PBST bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Was de ELISA-platen 5x met PBST, voeg vervolgens 100 μl van het verdunde monster toe zoals hieronder beschreven om te testen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Verdund serum, VLF, BALF, NLF met 0,5% BSA/PBST, verdund SILF met 20% foetaal kalfsserum (FCS)/PBST.
- Begin met het verdunnen van het serum 1000x met behulp van een verdunningsprocedure in twee stappen: verdun 20 μL serum tot 1 ml en verdun vervolgens 25 μL van dit verdunde serum tot 500 μl. Gebruik deze verdunning van serum voor detectie van IgG1, IgG2a.
- Voeg 200 μl van het serum verdund met 1000x toe aan de eerste rij van de gecoate plaat en voeg 100 μl 0,5% BSA/PBST toe aan alle putjes behalve de eerste rij. Breng 100 μL over van de eerste rij naar de tweede rij en meng 10x met de pipet. Herhaal deze stap tot rij 8 en gooi 100 μL vloeistof weg, het serum van verschillende concentraties is verkregen voor de detectie van IgG.
- Voer een 1:1 verdunning van BALF, NLF en SILF uit om IgA te detecteren. Gebruik voor VLF dezelfde verdunningsprocedure als voor serum.
- Was de ELISA platen 5x met PBST. Voeg 100 μL HRP-geconjugeerde geitenanti-muis IgG/IgG1/IgG2a/IgA (verdund 1:10000 met PBST) toe aan de daarvoor bestemde putjes en incubeer bij 37 °C gedurende 40 min.
- Was de ELISA-platen 5x met PBST, voeg 100 μL TMB ELISA-substraat (zeer gevoelig) toe en breng de plaat gedurende 5 minuten over naar een plaats die beschermd is tegen licht. Voeg onmiddellijk 100 μL 450 nm stopoplossing voor TMB-substraat toe om de reactie te stoppen.
- Meet de extinctie (OD) bij 450 nm voor elk putje en bereken de antilichaamtiter door 2,1 keer de serumwaarde van de muis uit de lege groep als positieve responswaarde te nemen.
5. ELISpot-test
- Volg de richtlijnen voor ELISpot Plus, gebruik Mouse IFN-γ (ALP) uit de kit om de tests uit te voeren.
- Haal de plaat uit de verzegelde verpakking en was 4x met steriel PBS (200 μL/putje). Conditioneer de plaat met 1640 compleet medium (200 μL/putje) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het medium en voeg de aangepaste concentratie lymfocytensuspensie bereid in stap 3.2.2 (100 μL/putje) toe aan de plaat, voeg vervolgens 100 μL van de stimulus toe, d.w.z. 1640 compleet medium met 20 μg/ml OVA257~264 of OVA323~339 of 1640 compleet medium. Plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om verdamping te voorkomen.
- Gooi de celsuspensie weg en was de plaat 5x met PBS (200 μL/putje). Verdun het detectieantilichaam (R4-6A2-biotine) tot 1 μg/ml in PBS met 0,5% foetaal kalfsserum (PBS-0,5% FCS). Voeg 100 μL/putje toe en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Wasplaat zoals in stap 5.2. Verdun de streptavidin-ALP (1:1000) in PBS-0,5%FCS en voeg 100 μL/putje toe, incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wasplaat zoals in stap 5.2. Filtreer de kant-en-klare substraatoplossing (BCIP/NBT-plus) door een filter van 0,45 μm en voeg 100 μL/putje toe. Ontwikkel totdat er duidelijke vlekken verschijnen.
- Stop de kleurontwikkeling door uitgebreid te wassen in kraanwater, verwijder het zachte plastic en laat de plaat drogen.
- Inspecteer en tel plekken in een ELISpot-lezer.
6. Statistische analyse
- Analyseer de verschillen tussen de gegevens van 4 groepen door eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey meervoudige vergelijking na de test. Druk alle resultaten uit als gemiddelde ± SD. P-waarde van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In totaal werden vier nano-emulsieformuleringen bereid en gekenmerkt door hun deeltjesgrootte (figuur 1), hun zeta-potentieel en hun inkapselingsefficiëntie, zoals weergegeven in tabel 2. De deeltjesgrootte was geconcentreerd rond 160-190nm en de toevoeging van DOTAP keerde het Zeta-potentieel van nano-emulsie om. OVA-specifiek serum IgG en het antilichaamniveau van de subgroep in serum werden 2 weken na de derde immunisatie gedetecteerd. Het nano-emulsie-adjuvante vaccin verhoogde significant de OVA-specifieke IgG-, IgG1- en IgG 2a-antilichaamtiters in serum (figuur 2). Wat nog belangrijker is, is dat de niveaus van specifiek sIgA in de vaginale spoelvloeistof en de dunne darm spoelvloeistof significant werden verhoogd wanneer OVA werd geadjuveerd met CNE-RA (Figuur 3). In de ELISpot-test werden geen significante vlekken gevonden.
Figuur 1: Grootte, diameter en verdeling. (A) Grootte, diameter en verdeling van NE-RA. (B) Grootte, diameter en verdeling van CNE-RA. D.nm is de gemiddelde diameter van de deeltjes in nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: OVA-specifiek serum IgG en de subgroep antilichaamniveaus in serum. OVA-specifiek serum IgG en zijn subgroep antilichaamspiegels in serum 2 weken nadat de drie immunisaties waren voltooid. (A) Log2-waarde van de IgG-titers. (B) IgG1 optische dichtheid bij 450 nm. (C) IgG2a optische dichtheid bij 450 nm. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n=5), ***: P<0,001. Vergelijkingen van de verschillen tussen de groepen en de PBS-groep worden direct boven de kolommen in de figuur weergegeven en worden als volgt aangegeven: ns: geen significantie, #p<0,05, ###p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: OVA-specifieke sIgA. OVA-specifieke sIgA in vaginale spoelvloeistof, bronchoalveolaire spoelvloeistof, neusspoelvloeistof, dunne darmspoelvloeistof. (A) Vaginale spoelvloeistof, (B) bronchoalveolaire spoelvloeistof, (C) Neusspoelvloeistof en (D) dunne darmspoelvloeistof. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n=5), ns: geen significantie, *p<0,05; Blz<0,001. Vergelijkingen van de verschillen tussen de groepen en de PBS-groep worden direct boven de kolommen in de figuur weergegeven en worden als volgt aangegeven: ns: geen significantie, ###p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Monster | Squaleen | Sorbitan trioleaat 85 | DOTAP | RA |
| NE-RA | 1,5 gr | 0,15 gr | 0 | 60mg |
| CNE-RA | 1,5 gr | 0,15 gr | 45mg | 60mg |
Tabel 1: De formulering van NE's in de oliefase.
| Monster | Gemiddelde grootte van het deeltje (nm) | Polydispersiteitsindex | Zeta-potentiaal (mV) | Efficiëntie van inkapseling (%) | Laadsnelheid van het geneesmiddel (mg/ml) |
| NE-RA | 182,9±3,4 Overige | 0,18±0,02 | -23,0±0,2 | 40 | 0.8 |
| CNE-RA | 162,7±4,2 Overige | 0,16±0,01 | 42,2±0,5 | 40 | 0.8 |
Tabel 2: Fysisch-chemische kenmerken van NE's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol ontwikkelden we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. In vergelijking met traditionele NE-adjuvantia heeft het de volgende twee voordelen. Ten eerste heeft het oppervlak van O/W NE's over het algemeen een hoge negatieve lading, waardoor het moeilijk is om antigenen direct te laden. Kationische NE's kunnen peptide- of eiwitantigenen effectief adsorberen en de specifieke immunogeniciteit verbeteren. Ten tweede heeft de ervaring in traditioneel vaccinonderzoek geleerd dat het moeilijk is om de mucosale respons te stimuleren door subcutane of intramusculaire injectie5. Door de door de FDA goedgekeurde RA toe te voegen aan de nano-emulsie 14,15,16, werd OVA-specifiek sIgA in de vagina en dunne darm bevorderd door intramusculaire injectie. Dit protocol is niet gevalideerd in andere antigenen, behalve voor OVA. In toekomstige studies kunnen diermodellen van darmgerelateerde ziekten worden gebruikt om het effect en het mechanisme van CNE-RA bij het verbeteren van de vaccinbescherming verder te evalueren.
Hogedrukhomogenisatie, afschuifmenging en ultrasoonbehandeling zijn de meest voorkomende hoogenergetische emulgeringsmethoden die worden gebruikt om NE's te bereiden, waarbij homogenisatie onder hoge druk de beste homogeniteit biedt17. Hogedrukhomogenisatiemethoden vereisen echter vaak dure gespecialiseerde apparatuur, met hoge voorbereidingskosten en niet te verwaarlozen koelproblemen18. In onze eerdere experimenten werd ontdekt dat de homogenisatiedruk en het aantal cycli een effect hadden op de deeltjesgrootte van NE's, en binnen een bepaald bereik, hoe hoger de homogenisatiedruk en hoe hoger het aantal cycli, hoe kleiner de deeltjesgrootte meestal was. De bereiding van olie-in-water-emulsiecolostrum zet de olie- en waterfasen effectief om in grote druppels en vermindert het aantal homogenisatiecycli. Als deze stap wordt overgeslagen, kan het verhogen van het aantal homogenisatiecycli uiteindelijk resulteren in nano-emulsies met dezelfde deeltjesgrootte en dispersie. Het vervangen van PBS in de waterige fase door 0,9% zoutoplossing of natriumcitraatbuffer had geen effect op de deeltjesgrootte en dispersie van de NE's.
Meerdere kationische lipiden worden op grote schaal toegepast in het ontwerp van vaccins19, DOTAP werd gekozen omdat het is goedgekeurd voor klinisch gebruik, een goede veiligheid vertoont en goed wordt verdragen. Overmatige positieve lading op het NE-oppervlak kan leiden tot cytotoxiciteit. Om veiligheidsredenen moet bij de bereiding van kationische NE's rekening worden gehouden met het type en de hoeveelheid kationische lipiden. Andere kationische lipiden die vaak in vaccinstudies worden gebruikt, zijn DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraeen-19-yl4-(dimethylamino)butanoaat)20, DMG-PEG2000 (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethyleenglycol-2000), DOTMA (N,N,N-trimethyl-2,3-bis(octadec-9-en-1-yloxy)propaan-1-aminiumchloride)21, DC-Chol (3β- [N-(N', N',N'-dimethylaminoethaan)-carbamoyl]cholesterolhydrochloride)22, en of ze kunnen worden gebruikt voor de bereiding van kationische NE's moet verder worden onderzocht.
In de afgelopen jaren heeft RA de aandacht getrokken vanwege het vermogen om via verschillende routes immuuncellen naar het darmslijmvlies te induceren, maar RA is niet alleen slecht in water oplosbaar, maar ook onstabiel voor licht en zuurstof. Tijdens de bereiding en opslag van NE's moet voortdurend aandacht worden besteed aan de bescherming van RA tegen licht en zuurstof. RA zal snel worden geoxideerd en afgebroken wanneer het wordt blootgesteld aan licht en zuurstof, en uiteindelijk zijn adjuvante effect verliest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben in dit werk.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door het Key Program van de Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) en het Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 32270988).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J.
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
