מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית
Summary
כאן, פרוטוקול לתרבית אורגנואידים של הוושט האנושי ותרבות ממשק אוויר-נוזל מסופק. ניתן להשתמש בתרבית ממשק אוויר-נוזל של אורגנואידים בוושט כדי לחקור את ההשפעה של ציטוקינים על מחסום אפיתל הוושט.
Abstract
אפיתל הקשקש של הוושט חשוף ישירות לסביבה, מול אנטיגנים זרים ברציפות, כולל אנטיגנים מזון וחיידקים. שמירה על שלמות מחסום האפיתל היא קריטית למניעת זיהומים ולמניעת דלקת הנגרמת על ידי אנטיגנים לא מזיקים שמקורם במזון. מאמר זה מספק פרוטוקולים פשוטים ליצירת אורגנואידים אנושיים בוושט ותרביות ממשק אוויר-נוזל מביופסיות של מטופלים כדי לחקור את תא האפיתל של הוושט בהקשר של הומאוסטזיס רקמות ומחלות. פרוטוקולים אלה היוו אבני דרך מדעיות משמעותיות בעשור האחרון, המתארים מבנים תלת-ממדיים דמויי איברים מתאים ראשוניים שמקורם בחולה, אורגנואידים ותרביות ממשק אוויר-נוזל. הם מציעים את האפשרות לחקור את תפקודם של ציטוקינים ספציפיים, גורמי גדילה ומסלולי איתות באפיתל הוושט במסגרת תלת ממדית תוך שמירה על התכונות הפנוטיפיות והגנטיות של התורם. אורגנואידים מספקים מידע על מיקרו-ארכיטקטורה של רקמות על ידי הערכת התעתיק והפרוטאום לאחר גירוי ציטוקינים. לעומת זאת, תרביות ממשק אוויר-נוזל מאפשרות להעריך את שלמות מחסום האפיתל באמצעות עמידות טרנסאפיתל (TEER) או מדידות שטף מקרומולקולות. שילוב של אורגנואידים אלה ותרביות ממשק אוויר-נוזל הוא כלי רב עוצמה לקידום המחקר במצבי מחסום אפיתל לקוי בוושט.
Introduction
דלקת בוושט פוגעת בשלמות מחסום האפיתל 1,2,3,4,5, כפי שנצפה בדלקת ושט אאוזינופילית (EoE), מחלה דלקתית כרונית הנשלטת על ידי Th2 בוושט6. EoE תואר לראשונה בשנות ה-90של המאה ה-20 7,8 והוא מושרה בעיקר על ידי אנטיגנים של מזון 9,10,11,12,13. הסימפטומים השכיחים ביותר של EoE באוכלוסייה הבוגרת הם דיספגיה ופגיעה במזון14. אצל ילדים, EoE מתבטא בדרך כלל בכישלון לשגשג, סירוב מזון, הקאות וכאבי בטן15. מחקרי אסוציאציה רחבת גנום (GWAS) זיהו גנים בסיכון EoE המעורבים בשלמות מחסום האפיתל, והעבירו את האפיתל למוקד מחקר EoE 16,17,18. תעתיק EoE גילה עוד כי תהליך התמיינות לקוי והיפרפלזיה תגובתית של אזור הבסיס גורמים לתפקוד המחסום הנפגע של אפיתל הוושט 3,5,19,20,21,22. ההבנה המוקדמת של EoE כמחלה בתיווך Th26 הובילה לגילוי IL-13 כמתווך נהיגה על ידי הפרעה לשלמות האפיתל 3,4,21,23. מערכות ניסיוניות המאפשרות דיסקציה של השפעות בתיווך ציטוקינים על שלמות האפיתל מפגיעה במחסום הפנימי באמצעות נטייה גנטית מספקות את האפשרות לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי מערכת החיסון לבין האפיתל ב-EoE. אורגנואידים של הוושט האנושי ותרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) הוצעו ככלים רבי ערך לניתוח התוצאות של גירוי ציטוקינים על שלמות האפיתל5.
הפרוטוקול הראשון ליצירת אורגנואידים של ושט שמקורם בתאי גזע בוגרים ספציפיים לרקמה (ASC) נקבע חמש שנים לאחר הדוחות הראשונים שפורסמו של אורגנואידי מעיים בשנת 2009 באמצעות LGR5+ ASCs במעי המשחזרים את תא האפיתל של המעי הדק24. DeWard et al. היו חלוצים ביצירת אורגנואידים מתאי אפיתל של הוושט25. בשנת 2018, Kasagi et al. יצרו אורגנואידים אנושיים של הוושט מקו תאי אפיתל קשקשי של הוושט האנושי EPC2-hTERT ותאים ראשוניים שמקורם במטופל26. באותה שנה, Zhang et al. יצרו בהצלחה אורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שמקורם בוושט. הם תיארו את המשמעות של עיכוב TGFβ וחלבון מורפוגנטי עצם (BMP) להתפתחות תאי אב של הוושט (EPC) ואת התפקיד המכריע של איתות Notch בהתמיינות של אפיתל קשקשי מרובד26,27. טריזנו ועמיתיו השלימו ממצאים אלה על ידי זיהוי Sox2 כמעכב Wnt המכוון את הגורל ההתפתחותי לקראת התמיינות הוושט28. השכלולים הבאים של פרוטוקולים, הרכב בינוני ותנאי תרבית הגדילו את קצב היווצרות האורגנואידים והפכו את תת-התרבות והשחזור של אורגנואידים לאחר שימור בהקפאה לאפשריים 26,29,30,31,32. למרות שאורגנואידים אלה הם כלים רבי עוצמה לחקר ארכיטקטורת רקמות וביטוי של גני מטרה פוטנציאליים לאחר גירוי עם ציטוקינים, אורגנואידים של הוושט לא יציעו את האפשרות למדוד עמידות טרנסאפיתל (TEER) או שטף מקרומולקולות כאמצעים ישירים לשלמות המחסום. כפי שתואר קודם לכן על ידי שריל ועמיתיו22, תרביות ALI המדגימות התמיינות אפיתל4 מאפשרות הערכות ישירות של שלמות האפיתל. שילוב אורגנואידים שמקורם במטופל ותרביות ALI הוא כלי רב עוצמה לחקר ארכיטקטורת רקמות ותקינות מחסום אפיתל ב- EoE.
להלן נהלים עם הוראות לבידוד תאים ברי קיימא מביופסיות הוושט והקמת תרביות אורגנואידים ותרביות ALI של הוושט שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעות של ציטוקינים על שלמות המחסום.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליכים הניתנים מאפשרים טיפוח של אורגנואידים שמקורם במטופל ותרביות ALI עם סיכויי הצלחה גבוהים. פרוטוקול האורגנואידים הותאם מהפרוטוקול הראשון שפורסם המדווח על יצירת אורגנואידים של הוושט האנושי26 ומפרוטוקול32 שפורסם לאחרונה. שריל ועמיתיו תיארו את מודלALI 2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מענק SNSF 310030_219210 ל- J.H.N. תמך בפרסום כתב יד זה ללא הגבלות. איור 1 נוצר בעזרת BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
References
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
- Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
- Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
- Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
- Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
- Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
- Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
- Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
- Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
- Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
- Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
- Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
- Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
- Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
- Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
- Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
- Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
- Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
- Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
- Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
- Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
- Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
- Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
- Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
- Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
- Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
- Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
- Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).
