Трехмерные модели клеточных культур для исследования эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите
Summary
Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.
Abstract
Плоский эпителий пищевода подвергается непосредственному воздействию окружающей среды, постоянно сталкиваясь с чужеродными антигенами, включая пищевые антигены и микробы. Поддержание целостности эпителиального барьера имеет решающее значение для предотвращения инфекций и предотвращения воспаления, вызванного безвредными антигенами пищевого происхождения. В данной статье представлены упрощенные протоколы получения органоидов пищевода человека и культур воздушно-жидкостных границ раздела из биопсии пациента для изучения эпителиального компартмента пищевода в контексте тканевого гомеостаза и заболевания. Эти протоколы стали важными научными вехами за последнее десятилетие, описывая трехмерные органоподобные структуры из первичных клеток, полученных от пациента, органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела. Они дают возможность исследовать функцию специфических цитокинов, факторов роста и сигнальных путей в эпителии пищевода в трехмерной структуре, сохраняя при этом фенотипические и генетические свойства донора. Органоиды предоставляют информацию о микроархитектуре тканей путем оценки транскриптома и протеома после цитокиновой стимуляции. В отличие от этого, культуры на границе раздела воздух-жидкость позволяют оценить целостность эпителиального барьера с помощью трансэпителиального сопротивления (TEER) или измерения потока макромолекул. Объединение этих органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела является мощным инструментом для продвижения исследований в условиях нарушенного эпителиального барьера пищевода.
Introduction
Воспаление пищевода нарушает целостность эпителиального барьера 1,2,3,4,5, что наблюдается при эозинофильном эзофагите (ЭоЭ), хроническом воспалительном заболевании пищевода с преобладанием Th26. EoE был впервые описан в 1990-х годах как 7,8 и индуцируется преимущественно пищевыми антигенами 9,10,11,12,13. Наиболее часто встречающимися симптомами ЭоЭ у взрослого населения являются дисфагия и пищевая имперация14. У детей ЭоЭ обычно проявляется отставанием в росте, отказом от пищи, рвотой и болью в животе15. Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили гены риска EoE, участвующие в целостности эпителиального барьера, переместив эпителий в центр исследований EoE 16,17,18. Транскриптомика EoE также показала, что нарушение процесса дифференцировки и гиперплазия реактивной базальной зоны вызывают нарушение барьерной функции эпителия пищевода 3,5,19,20,21,22. Раннее понимание того, что ЭоЭ является Th2-опосредованнымзаболеванием6, привело к открытию IL-13 в качестве движущего медиатора, нарушающего целостность эпителия 3,4,21,23. Экспериментальные системы, позволяющие препарировать цитокин-опосредованные эффекты на целостность эпителия от нарушения внутреннего барьера через генетическую предрасположенность, дают возможность изучить сложное взаимодействие между иммунными клетками и эпителием в ЭоЭ. Пищеводные органоиды человека и культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ОПЛ) были предложены в качестве ценных инструментов для анализа влияния цитокиновой стимуляции на целостность эпителия5.
Первый протокол для получения взрослых тканеспецифических стволовых клеток (ASC) пищеводных органоидов был разработан через пять лет после первых опубликованных сообщений о кишечных органоидах в 2009 году с использованием кишечных Lgr5+ ASC, повторяющих эпителиальный компартмент тонкой кишки24. ДеВард и др. первыми получили органоиды из эпителиальных клеток пищевода мышей25. В 2018 году Kasagi et al. получили органоиды пищевода человека из иммортализованной клеточной линии плоского эпителия пищевода человека EPC2-hTERT и первичных клеток, полученных от пациента26. В том же году Zhang et al. успешно получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из органоидов пищевода. Они определили значение ингибирования TGFβ и костного морфогенетического белка (BMP) для развития клеток-предшественников пищевода (EPC) и решающую роль передачи сигналов Notch в дифференцировке стратифицированного плоского эпителия26,27. Трисно и его коллеги дополнили эти результаты, определив Sox2 в качестве ингибитора Wnt, который направляет судьбу развития в сторону дифференцировки пищевода. Последующее усовершенствование протоколов, состава среды и условий культивирования увеличило скорость образования органоидов и сделало возможным субкультивирование и восстановление органоидов после криоконсервации 26,29,30,31,32. Несмотря на то, что эти органоиды являются мощными инструментами для изучения архитектуры тканей и экспрессии потенциальных генов-мишеней после стимуляции цитокинами, органоиды пищевода не дают возможности измерить трансэпителиальную резистентность (TEER) или поток макромолекул в качестве прямых измерений целостности барьера. Как ранее было описано Шерриллом и коллегами22, культуры ALI, моделирующие дифференцировкуэпителия4, позволяют напрямую оценить целостность эпителия. Объединение органоидов, полученных от пациента, и культур ALI является мощным инструментом для исследования архитектуры тканей и целостности эпителиального барьера в EoE.
Ниже приведены процедуры с инструкциями по выделению жизнеспособных клеток из биопсии пищевода и созданию органоидов пищевода и культур ОПЛ, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения влияния цитокинов на целостность барьера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проводимые процедуры позволяют культивировать органоиды и культуры ОЛ пациентского происхождения с высокими перспективами успеха. Протокол на основе органоидов был взят из первого опубликованного протокола, в котором сообщалось о создании органоидов пищеводачеловека26…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Грант SNSF 310030_219210 для J.H.N. поддержал публикацию этой рукописи без ограничений. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
References
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
- Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
- Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
- Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
- Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
- Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
- Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
- Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
- Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
- Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
- Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
- Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
- Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
- Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
- Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
- Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
- Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
- Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
- Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
- Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
- Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
- Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
- Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
- Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
- Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
- Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
- Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
- Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).
