Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Anjali Tripathi; Anindita Dasgupta; Debashis Mitra

doi:10.3791/66522

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Article de méthode

Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

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DOI :

10.3791/66522

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14 juin 2024

Anjali Tripathi¹ , Anindita Dasgupta¹ , Debashis Mitra¹

¹National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Résumé

Les infections virales peuvent provoquer un stress du réticulum endoplasmique (RE) en raison d’une accumulation anormale de protéines, conduisant à une réponse protéique dépliée (UPR). Les virus ont développé des stratégies pour manipuler l’UPR de l’hôte, mais il y a un manque de compréhension détaillée de la modulation de l’UPR et de son importance fonctionnelle pendant l’infection par le VIH-1 dans la littérature. Dans ce contexte, le présent article décrit les protocoles utilisés dans notre laboratoire pour mesurer les niveaux de stress du RE et l’UPR pendant l’infection par le VIH-1 dans les lymphocytes T et l’effet de l’UPR sur la réplication virale et l’infectiosité.

La coloration à la thioflavine T (ThT) est une méthode relativement nouvelle utilisée pour détecter le stress du RE dans les cellules en détectant les agrégats de protéines. Ici, nous avons illustré le protocole de coloration ThT dans les cellules infectées par le VIH-1 pour détecter et quantifier le stress du RE. De plus, le stress du RE a également été détecté indirectement en mesurant les niveaux de marqueurs UPR tels que BiP, IRE1 phosphorylé, PERK et eIF2α, l’épissage de XBP1, le clivage de ATF6, ATF4, CHOP et GADD34 dans les cellules infectées par le VIH-1, en utilisant l’immunoblot conventionnel et la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (RT-PCR). Nous avons constaté que la fluorescence ThT est en corrélation avec les indicateurs d’activation de l’UPR. Cet article présente également les protocoles permettant d’analyser l’impact du stress RE et de la modulation UPR sur la réplication du VIH-1 par des expériences d’inactivation ainsi que l’utilisation de molécules pharmacologiques. L’effet de l’UPR sur l’expression/réplication du gène VIH-1 et la production de virus a été analysé par des tests rapporteurs de la luciférase et par ELISA de capture de l’antigène p24, respectivement, tandis que l’effet sur l’infectiosité du virion a été analysé par coloration des cellules rapporteures infectées. Collectivement, cet ensemble de méthodes fournit une compréhension complète des voies de réponse protéique dépliée pendant l’infection par le VIH-1, révélant sa dynamique complexe.

Introduction

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) se caractérise par une réduction progressive du nombre de lymphocytes T CD4⁺, ce qui entraîne une défaillance progressive de la réponse immunitaire. Le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est l’agent causal du sida. Il s’agit d’un virus à ARN simple brin enveloppé, de sens positif, avec deux copies d’ARN par virion et appartenant à la famille des rétroviridae. La production de fortes concentrations de protéines virales dans la cellule hôte exerce une pression excessive sur la machinerie de repliement des protéines de la cellule¹. Le RE est le pr....