PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증
Summary
이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.
Abstract
세포 사멸은 모든 살아있는 유기체의 근본적인 과정입니다. 이 프로토콜은 세포 사멸을 관찰하기 위해 인간 단핵구(THP-1) 대식세포 모델에서 지질다당류(LPS) 및 아데노신 삼인산(ATP) 유도 phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) 분화 지질 침착을 확립합니다. LPS와 ATP가 결합된 LPS는 전형적인 염증 유도 방법으로, 발톱증을 연구하는 데 자주 사용되지만, 세포사멸과 괴사도 LPS/ATP에 의한 자극에 반응합니다. 정상적인 상황에서, 포스파티딜세린은 원형질막의 안쪽 leaflet에서만 국한됩니다. 그러나 pyroptosis, apoptosis, necroptosis의 초기 단계에서는 세포막이 온전한 상태로 포스파티딜세린에 노출되고 후기 단계에서는 세포막이 무결성을 잃게 됩니다. 여기에서 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-Aminoactinomycin D(AAD) 이중 염색을 분석하여 전체 세포에서 세포 사멸을 검출했습니다. 그 결과, LPS/ATP로 자극을 받은 후 상당한 세포가 죽었다는 것을 알 수 있었다. 주사 전자 현미경을 사용하여 개별 세포에서 가능한 세포 사멸 형태를 관찰합니다. 결과는 세포가 LPS/ATP로 자극된 후 발열증, 세포사멸사 또는 괴사(necroptosis)를 겪을 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 LPS/ATP로 자극한 후 대식세포의 사멸을 관찰하는 데 중점을 둡니다. 그 결과, LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸이 파이롭토시스에 국한되지 않고 세포사멸 및 괴사멸도 발생할 수 있음을 보여주었으며, 이는 연구자들이 LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸을 더 잘 이해하고 더 나은 실험 방법을 선택하는 데 도움이 되었습니다.
Introduction
세포 사멸은 모든 살아있는 유기체에서 기본적인 생리학적 과정입니다. 최근 몇 년 동안 상당한 연구에 따르면 세포 사멸이 유기체 내의 면역과 균형에 관여합니다. 세포 사멸을 연구하면 질병의 발병과 발병을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. 프로그램된 세포 사멸의 여러 형태가 설명되었으며, 이러한 과정에서 일부 주요 표적이 확인되었습니다. Pyroptosis, apoptosis, necroptosis는 내부 균형 및 질병에 관여하는 유전적으로 정의된 세 가지 프로그램된 세포 사멸 경로입니다1.
Pyroptosis는 막 구멍의 형성과 세포 내용물의 방출을 특징으로합니다. 활성화된 카스파제 또는 그랜자임은 가스더민을 절단하여 N-말단 도메인을 분리한 다음 올리고머화되어 멤브레인에 결합하고 기공 2,3,4를 형성합니다. gasdermin pore는 세포막을 가로지르는 비정형 분비 채널을 제공하여 함량 방출 및 이온 유입 2,3,4를 포함한 다운스트림 세포 반응을 일으킵니다. 결국, 세포는 결국 ninjurin-1에 의해 촉진되는 원형질막 파열과 열병합 용해를 경험하게 된다5. 세포사멸에서 활성화된 Bax와 Bak은 미토콘드리아 외막에 올리고머를 형성하고 시토크롬 C를 방출하며, 이는 BCL-2 계열의 프로아포토시스 단백질과 항아사멸 단백질, 개시제 카스파제(카스파제-8, -9 및 -10) 및 효과기 카스파제(카스파제-3, -6 및 –7)1,6,7 사이의 균형에 의해 조절됩니다. 세포자멸사의 형태학적 변화에는 막 출혈, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 응축 및 자가사멸체 형성이 포함됩니다 6,8. 수용체 상호 작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 1(RIPK3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 괴사 메커니즘1의 두 가지 다운스트림 핵심 구성 요소입니다. RIPK3는 MLKL을 모집 및 인산화하고, p-MLKL은 올리고머화하고, 세포막과 결합하고, 막 천공을 시작하고, 이온 유입을 일으키고, 세포 내 삼투압을 증가시키고, 결국 세포 파열을 일으킵니다 6,9. 가스더민스(Gasdermins)와 MLKL은 각각 원형질막에 결합하여 열포화증(pyroptosis)과 괴사(necroptosis)를 매개하며, BAX/BAK는 미토콘드리아의 외막에 결합하여 세포사멸을 매개합니다6.
각 경로에는 특정 메커니즘과 결과가 있지만 세포막에서 유사한 변화를 일으킵니다. 정상적인 상황에서 포스파티딜세린(PS)은 원형질막의 내부 판단에만 국한됩니다. 그러나 pyroptosis, apoptosis, necroptosis의 초기 단계에서는 PS가 원형질막 외부로 노출됩니다. Caspase-3/caspase-7은 TMEM16 및 XKR 계열을 활성화하여 비대칭 세포막을 유도하고 세포사멸10 동안 PS를 외부화합니다. Gasdermin D 매개 및 MLKL 매개 Ca2+ 유입은 세포막에서 인지질 이중층의 대칭성을 잃고 PS를 노출시킵니다. 노출은 세포막 무결성11,12의 손실 전에 발생합니다. 이 세 가지 유형의 프로그래밍된 세포 사멸의 막에서 발생하는 유사한 변화를 기반으로 유세포 분석을 사용하여 Annexin V/7-Aminoactinomycin D(7-AAD) 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출합니다. 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질인 Annexin V는 PS에 대한 친화력이 높고, 이는 원형질막(13)의 표면에서 노출된 PS를 검출하기 위한 민감한 프로브 역할을 할 수 있다. 7-AAD는 전체 세포막을 통과할 수 없는 핵산 염색제입니다. 일반적으로 사용되는 핵산 염료인 프로피듐 요오드화물(PI)과 유사합니다. 두 제품은 유사한 형광 특성을 갖지만 7-AAD는 방출 스펙트럼이 더 좁고 다른 검출 채널과의 간섭이 적습니다. 이러한 유사성으로 인해 pyroptosis, apoptosis, necroptosis를 구별하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 우리는 전체 세포에서 세포 사멸을 검출하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. 두 번째 방법은 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 세포막을 캡처하는 데 사용되어 개별 세포에서 가능한 세포 사멸 형태를 관찰합니다.
세포 사멸을 관찰하기 위해 인간 단핵구(THP-1) 대식세포 모델에서 지질다당류(LPS) 및 아데노신 삼인산(ATP) 유도 phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) 분화 지질 침착을 확립했습니다. 이 프로토콜은 메커니즘을 조사하기보다는 세포 사멸을 관찰하는 데 중점을 둡니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서는 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS와 ATP 유도 사멸을 감지하기 위해 두 가지 방법을 사용했습니다. Annexin V/7-AAD 이중 염색을 사용하였으며, 전체 염색으로부터 유세포 분석으로 결과를 분석하였다. 다른 유세포 분석과 마찬가지로, 염색되지 않은 세포 그룹과 단일 염색된 세포 두 그룹을 설정하여 위양성 및 위음성 결과를 제외했습니다. 그 결과, LPS/ATP 자극 후 여러 세포가 막 무결성을 잃?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유세포 분석에 도움을 준 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy의 Jiayi Sun과 Lu Yang, 주사 전자 현미경 검사에 도움을 준 Southwestern Chinese Medicine Resources의 State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources의 Cuiping Chen에게 큰 감사를 표합니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)[82104491], 쓰촨성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Sichuan)[2023NSFSC0674], 중국 박사후 과학재단(Post-doctoral Science Foundation of China)[2021M693789]의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
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