قياس الفلورة عالي الدقة لتقييم التغيرات الديناميكية في إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا المناعية البشرية
Summary
طرق دراسة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا تحت تركيزات الركيزة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الخلايا المناعية محدودة. نحن نقدم بروتوكولا مفصلا يستخدم قياس الفلور عالي الدقة لتقييم التغيرات في استجابة غشاء الميتوكوندريا المحتمل للطلب على الطاقة في الخلايا التائية البشرية ، وحيدات الخلايا ، والخلايا أحادية النواة المحيطية.
Abstract
تظهر الخلايا أحادية النواة المحيطية (PBMCs) تغيرات قوية في القدرة التنفسية للميتوكوندريا استجابة للصحة والمرض. في حين أن هذه التغييرات لا تعكس دائما ما يحدث في الأنسجة الأخرى ، مثل العضلات الهيكلية ، فإن هذه الخلايا هي مصدر قيم يمكن الوصول إليه للميتوكوندريا القابلة للحياة من البشر. تتعرض PBMCs لإشارات نظامية تؤثر على حالة الطاقة الحيوية الخاصة بها. وبالتالي ، فإن توسيع أدواتنا لاستجواب استقلاب الميتوكوندريا في هذه الفئة من السكان سيوضح الآليات المتعلقة بتطور المرض. غالبا ما تقتصر المقايسات الوظيفية للميتوكوندريا على استخدام مخرجات الجهاز التنفسي بعد تركيزات الركيزة القصوى والمثبطات وغير المقرنة لتحديد النطاق الكامل للقدرة التنفسية ، والتي قد لا يمكن تحقيقها في الجسم الحي. يؤدي تحويل أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة ATP-synthase إلى انخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (mMP) وزيادة في استهلاك الأكسجين. لتوفير تحليل أكثر تكاملا لديناميكيات الميتوكوندريا ، توضح هذه المقالة استخدام قياس الفلورة عالي الدقة لقياس الاستجابة المتزامنة لاستهلاك الأكسجين وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (mMP) لتركيزات ADP ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تستخدم هذه التقنية رباعي ميثيل رودامين ميثيل إستر (TMRM) لقياس استقطاب mMP استجابة لمعايرة ADP بعد فرط الاستقطاب الأقصى مع ركائز معقدة I و II. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد كيفية تأثير التغيرات في الحالة الصحية ، مثل الشيخوخة وأمراض التمثيل الغذائي ، على حساسية استجابة الميتوكوندريا للطلب على الطاقة في PBMCs والخلايا التائية والوحيدات من البشر.
Introduction
تعتمد قدرة الخلية على العمل والبقاء على قيد الحياة في فترة الإجهاد الفسيولوجي إلى حد كبير على قدرتها على تلبية المتطلبات النشطة لاستعادة التوازن 1,2. يرتفع الطلب على الطاقة استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات. على سبيل المثال ، زيادة تقلص العضلات أثناء التمرين يزيد من استخدام ATP والجلوكوز بواسطة العضلات الهيكلية ، ويزيد ارتفاع تخليق البروتين بعد الإصابة من استخدام ATP من قبل الخلايا المناعية لإنتاج السيتوكين وانتشاره3،4،5،6. يؤدي الارتفاع الحاد في الطلب على الطاقة إلى سلسلة من عمليات الطاقة الحيوية لاستعادة نسبة ATP / ADP. عند استهلاك ATP ، ترتفع مستويات ADP وتحفز F1F0 ATP-synthase (المركب V) ، الأمر الذي يتطلب قوة دافعة بروتونية لدفع دورانه الميكانيكي والتحويل التحفيزي ل ADP إلى ATP داخل الميتوكوندريا7. القوة الدافعة البروتونية هي تدرج كهروكيميائي تم إنشاؤه عن طريق ضخ البروتونات أثناء نقل الإلكترونات من الركائز إلى الأكسجين من خلال نظام نقل الإلكترون (ETS) داخل غشاء الميتوكوندريا الداخلي. يخلق الاختلاف الناتج في تركيز البروتون (دلتا pH) والإمكانات الكهربائية (جهد الغشاء) القوة الدافعة البروتونية التي تدفع تخليق ATP واستهلاك الأكسجين استجابة للطلب على الطاقة مما يقلل من نسبة ATP / ADP أو يرفع مستويات ADP. يمكن تحديد تقارب الميتوكوندريا مع ADP من خلال حساب Km أو EC50 للتنفس المحفز ADP للميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا المتداخلة 8,9. أظهرت هذه الطريقة أن الألياف العضلية المتداخلة من البشر الأكبر سنا تتطلب تركيزا أكبر من ADP لتحفيز 50٪ من قدرتها القصوى على الفسفرة التأكسدية مقارنة بالأشخاص الأصغر سنا9. وبالمثل ، تتطلب شيخوخة العضلات الهيكلية للفأر المزيد من ADP لخفض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية للميتوكوندريا (ROS) 10,11. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل حساسية ADP في ألياف العضلات المتداخلة للفئران المصابة بالسمنة التي يسببها النظام الغذائي بالنسبة إلى الضوابط ويتم تعزيزها في وجود الأنسولين وبعد استهلاك النترات 12,13. وبالتالي ، فإن قدرة الميتوكوندريا على الاستجابة للطلب على الطاقة تختلف في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة ، ولكن لم يتم استكشاف ذلك من قبل في سياق الخلايا المناعية.
تستخدم خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) بشكل شائع للتحقيق في الطاقة الحيوية الخلوية في البشر14،15،16،17،18،19،20. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى سهولة الحصول على الخلايا من عينات الدم غير المتخثرة في الدراسات السريرية ، واستجابة الخلايا للاضطرابات الأيضية ، والأساليب التي طورتها مجموعات مختلفة لاستجواب استقلاب الميتوكوندريا باستخدام مثبطات و uncouplers لتحديد السعة القصوى والحد الأدنى لتنفس الميتوكوندريا21,22. وقد أدت هذه الأساليب إلى تقدير أدوار الطاقة الحيوية في الشيخوخة ، وأمراض التمثيل الغذائي ، ووظيفة المناعة14،20،23،24. غالبا ما يتم تقليل القدرة التنفسية للميتوكوندريا في العضلات الهيكلية و PBMCs في ظل ظروف قصور القلب18,25. ترتبط الطاقة الحيوية PBMC أيضا بعوامل الخطر القلبية الأيضية لدى البالغين الأصحاء17 وتستجيب لعلاجات مثل نيكوتيناميد ريبوسيد18. تشمل PBMCs العدلات والخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية) والوحيدات والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة ، والتي تساهم جميعها في قدرة الميتوكوندريا PBMC26،27،28. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الطاقة الحيوية الخلوية دورا حاسما في تنشيط الخلايا المناعية وتكاثرها وتجديدها23. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطرق هو أن الخلايا لا تعمل تحت نطاق فسيولوجي من الركائز. لذلك هناك حاجة إلى طرق إضافية لاستجواب وظيفة الميتوكوندريا في تركيزات الركيزة الأكثر صلة بما تختبره الخلايا في الجسم الحي.
إمكانات غشاء الميتوكوندريا (mMP) هي المكون الرئيسي للقوة الدافعة للبروتونية وهي ضرورية لمجموعة متنوعة من عمليات الميتوكوندريا التي تتجاوز إنتاج ATP ، مثل تنظيم تدفق الجهاز التنفسي ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، واستيراد البروتين والأيونات ، والالتهام الذاتي ، وموت الخلايا المبرمج. يمكن تقييم mMP باستخدام مجسات كهروكيميائية أو أصباغ فلورية حساسة للتغيرات في استقطاب الغشاء مثل JC-1 و Rhod123 و DiOC6 ورباعي ميثيل رودامين (TMRE) أو ميثيل استر (TMRM) وسافرانين. الأخيران هما أصباغ كاتيونية محبة للدهون تم استخدامها بنجاح في قياس الفلورة عالي الدقة لمتجانسات الأنسجة ، والميتوكوندريا المعزولة ، والأنسجة النفاذية11،29،30،31،32،33. في هذه التقنية ، يتم استخدام TMRM في وضع التبريد ، حيث تتعرض الخلايا لتركيز عال من TMRM الذي يتراكم في مصفوفة الميتوكوندريا عند الاستقطاب (ارتفاع mMP والقوة الدافعة) ، مما يؤدي إلى إخماد مضان TMRM الخلوي. عندما تزيل الميتوكوندريا استقطابها استجابة ل ADP أو uncouplers ، يتم إطلاق الصبغة من المصفوفة ، مما يزيد من إشارة الفلورسنت TMRM34,35. الغرض من هذه الطريقة هو قياس التغيرات في تنفس الميتوكوندريا و mMP في وقت واحد استجابة لمعايرة ADP في PBMCs المشتقة من الإنسان ، والوحيدات المنتشرة ، والخلايا التائية ، ويمكن أيضا تطبيقها على الخلايا التائية الطحالية للفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم هذا البروتوكول قياس الفلورة عالي الدقة لقياس حساسية استجابة الميتوكوندريا للطلب على الطاقة عن طريق قياس تبديد mMP استجابة لزيادة مستويات ADP في PBMCs ، وحيدات ، والخلايا التائية. يتم ذلك عن طريق إضافة ركائز معقدة I و II لزيادة جهد غشاء الميتوكوندريا ومعايرة ADP لتحفيز ATP-synthase تدريجيا لاستخدام تدرج البروتون لتوليد ATP.
تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول ضبط كسب وشدة الفلوروفور على 1000 والتأكد من الحصول على إشارة الفلورسنت TMRM أثناء معايرة TMRM. نظرا لأن مضان TMRM ينخفض بعد كل معايرة (أحد قيود هذه الطريقة) ، فمن الضروري إجراء تجارب الخلفية باستخدام عينات فارغة. لقد وجدنا أيضا أن DMSO له تأثير مثبط على التنفس الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء ، وبالتالي ، نوصي بتخفيف محلول عمل TMRM في Mir05 (الشكل التكميلي 1).
بعض التعديلات التي يمكن استخدامها عند تجربة هذا البروتوكول هي ضبط تركيزات الخلايا واستخدام غرفة 2 مل القياسية. ومع ذلك ، فإن غرفة 0.5 مل مفضلة للخلايا التائية والوحيدات بسبب التركيز العالي للخلايا اللازمة للاستجابة المثلى في إمكانات الغشاء وتدفق الأكسجين. قد يكون التركيز المنخفض للخلايا هو الأمثل عند اختبار الخلايا ذات السعة التنفسية الأكبر ، مثل البلاعم.
تشمل القيود الإضافية للطريقة المعروضة هنا متطلبات ما لا يقل عن 5 ملايين خلية تائية و 2.5 مليون خلية وحيدة. يمكننا في كثير من الأحيان الحصول على خلايا كافية من ~ 20 مل من الدم من المشاركين الأصحاء ، ولكن هذه الأرقام يمكن أن تختلف حسب الحالة الصحية والعمر والجنس26. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو الحال في معظم طرق تقييم قدرة الميتوكوندريا ، يجب عزل الخلايا حديثا. ومع ذلك ، يمكن تجربة هذه الطريقة في الخلايا المحفوظة بالتبريد في المستقبل. بالمقارنة مع العائد من دم الإنسان ، فإن إنتاج الخلايا التائية من طحال الفئران السليمة مرتفع بما يكفي لإجراء هذا الفحص.
تعتمد الخلايا التائية المنتشرة ، وخاصة الذاكرة طويلة العمر (TM) والخلايا التنظيمية (Treg) ، على الفسفرة التأكسدية للحصول على الطاقة37. في حين أن الطلب على الطاقة واستهلاك الأكسجين منخفضان (على سبيل المثال ، مقارنة بعضلات الراحة) ، فإن بقائهم ضروري لاستجابة مناعية فعالة لإعادة العدوى والسرطان38،39،40. يؤدي انخفاض الفسفرة التأكسدية للخلايا التائية إلى ضعف القدرة التكاثرية ويعزز استنفاد الخلايا التائية والشيخوخة 5,41. بالإضافة إلى ذلك ، يعزز فرط استقطاب الميتوكوندريا الإنتاج المستدام للسيتوكينات (IL-4 و IL-21) بواسطة الخلايا التائية CD4 المستجيبة أثناء التنشيط42. عند الإصابة ، يمكن أن تصل متطلبات الطاقة لتنشيط وتكاثر الخلايا المناعية إلى 25٪ -30٪ من معدل الأيض الأساسي43. لذلك ، تعمل الخلايا المناعية في نطاق واسع ومتطرف من متطلبات الطاقة ، ويمكن لهذا البروتوكول اختبار استجابات الميتوكوندريا ضمن هذا النطاق.
الالتهاب المزمن هو سمة شائعة للسمنة والسكري والشيخوخة. المستويات غير المنظمة للهرمونات المنتشرة والدهون والجلوكوز لها تأثيرات جهازية وبالتالي يمكن أن تؤثر على كيفية استجابة الميتوكوندريا لتحدي نشط. هنا ، قدمنا طريقة لتقييم حساسية ADP للميتوكوندريا في تعميم PBMCs. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد كيفية تعديل حساسية ADP في أمراض التمثيل الغذائي وكيف تؤثر على الحالة الصحية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المتطوعين الطيبين الذين تبرعوا بالدم لهذا المشروع. كما نعرب عن خالص تقديرنا للدكتورة إلين شور وفريقها لتزويدنا بعينات إضافية من دراستهم. نود أيضا أن نشكر أندرو كيرش على مراجعة المخطوطة وتحريرها للتأكد من وضوحها. تم دعم هذا العمل من قبل مصادر التمويل التالية: P01AG001751 ، R01AG078279 ، P30AR074990 ، P30DK035816 ، P30DK017047 ، R01DK089036 ، K01HL154761 ، T32AG066574.
Materials
| Adenosine Diphosphate | Sigma-Aldrich | A5285 | Fluorespirometry |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Fluorespirometry |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | Mir05 buffer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | Cell isolation |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | Fluorespirometry |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Cell isolation |
| CD3 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | Cell isolation |
| DatLab | Oroboros | Version 8 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Fluorespirometry |
| D-Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Mir05 buffer |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | Mir05 buffer |
| Filter Set AmR | Oroboros | 44321-01 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 12060-040 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7523 | Mir05 buffer |
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell isolation |
| K2EDTA blood collection tubes | BD Vacutainer | 366643 | Cell isolation |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | Mir05 buffer |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | Fluorespirometry |
| L-Malic Acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Fluorespirometry |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Cell isolation |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | Mir05 buffer |
| Multi-MACS stand and MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | Cell isolation |
| O2k-Fluo Smart-Module | Oroboros | 12100-03 | |
| O2k-FluoRespirometer series J | Oroboros | 10201-03 | |
| O2k-sV-Module (0.5 chamber) | Oroboros | 11200-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 04876 | Fluorespirometry |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi | 130095130 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | Mir05 buffer |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | Mir05 buffer |
| Prism | GraphPad | Version 10 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Fluorespirometry |
| RPMI Buffer | Corning | 17-105-CV | Cell isolation |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Fluorespirometry |
| Succinate disodium salt | Sigma-Aldrich | S2378 | Fluorespirometry |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Mir05 buffer |
| Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite | Sigma-Aldrich | T5428 | Fluorespirometry |
References
- Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
- Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224 (Pt Suppl 1), jeb.236802 (2021).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
- Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
- Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
- Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070 (2019).
- Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709 (2011).
- Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
- Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
- Pharaoh, G. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
- Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
- Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307 (2022).
- Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489 (2020).
- Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol (1985). 126 (2), 454-461 (2019).
- DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
- Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
- Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239 (2021).
- Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes. Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
- van der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 3.16B.11-3.16B.14 (2016).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
- Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857 (2020).
- Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
- Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899 (2021).
- Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. 85, 51301 (2014).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
- Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
- Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
- Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147.e111 (2020).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), e00286 (2015).
- Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , (2023).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
- Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
- MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
- Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
- Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, e06376 (2015).
- Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).
