Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos
Summary
Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.
Abstract
Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução. O método consiste na implantação de uma janela de imagem do crânio, a injeção de um corante indicador fluorescente de cálcio que podem ser tomadas por um grande número de neurônios e, finalmente, gravar a atividade dos neurônios com o tempo de imagem usando um lapso de cálcio in-vivo duas microscópio de fótons. Co-injeção de astrócitos específicos corantes permite diferenciar os neurônios de astrócitos. A técnica pode ser realizada em camundongos expressando moléculas fluorescentes em subpopulações específicas de neurônios para entender melhor as interações de rede de diferentes grupos de células.
Protocol
Discussion
A vantagem deste método sobre gravações eletrofisiológicas é que é menos invasiva e permite que as gravações da atividade neuronal em densas redes neuronais. Ao fazer este procedimento é importante lembrar de tomar extremo cuidado ao realizar a craniotomia para não danificar a dura. Mesmo uma pequena quantidade de sangramento subdural com muito obscura a imagem.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Olga Garaschuk para discussões úteis sobre como otimizar o carregamento a granel de indicadores de cálcio.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
