L'électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Summary

Une seule cellule d'électroporation (SCE) est une technique spécialisée qui permet la livraison d'ADN ou d'autres macromolécules dans les cellules individuelles au sein des tissus intacts, y compris dans les préparations in vivo. Ici, nous détaillons la procédure de SCE d'un colorant fluorescent ou de l'ADN plasmidique dans les neurones dans le cerveau intact du têtard de Xenopus laevis.

Abstract

Une seule cellule d'électroporation (SCE) est une technique spécialisée permettant la livraison d'ADN ou d'autres macromolécules dans les cellules individuelles au sein des tissus intacts, y compris dans les préparations in vivo. L'avantage de cette technique est que les manipulations expérimentales peuvent être effectuées sur des cellules individuelles, tout en laissant les tissus environnants inchangée, distinguant ainsi cellulaire autonome des effets de ceux résultant de traitements globaux. Lorsqu'il est combiné à un stade avancé dans les techniques d'imagerie in vivo, la SCE de marqueurs fluorescents permet la visualisation directe de la morphologie cellulaire, la croissance cellulaire, et les événements intracellulaires sur des périodes variant de quelques secondes à quelques jours. Bien que cette technique est utilisée dans une variété de préparations in vivo et ex vivo, nous avons optimisé cette technique pour une utilisation chez les têtards de Xenopus laevis. Dans cet article, vidéo, nous détaillons la procédure de SCE d'un colorant fluorescent ou de l'ADN plasmidique dans les neurones dans le cerveau intact de l'albinos têtard de Xenopus. Nous discutons également des méthodes pour optimiser le rendement, et de montrer des exemples de vivre à deux photons imagerie de fluorescence des neurones marqués par fluorescence par SCE.

Protocol

Matériel mis en place: L'équipement électrique nécessaire pour cette technique sont un stimulateur, un oscilloscope et un porte micropipette équipé d'un fil d'argent pour être inséré dans la micropipette. Nous utilisons généralement une Axon Instruments Axoporator 800A stimulateur, cependant d'autres stimulateurs communs tels que les instruments d'herbe SD9 stimulateurs sont également appropriés pour une seule cellule électroporation. Le stimulateur est connecté à l'head…

Discussion

Une seule cellule d'électroporation (SCE) est un outil puissant pour déterminer la fonction des gènes et l'exécution ciblée des manipulations génétiques. La transparence du têtard albinos et l'accessibilité du cerveau font de ce système modèle idéal pour la visualisation de la croissance neuronale et des événements intracellulaires au sein d'un organisme vivant. SCE permet la visualisation de la croissance d'un seul neurone, et d'effectuer des manipulations de cellules-autonome au sein d'un cerveau …