Tot voor kort werden expressie studies over menselijke hersenen beperkt tot de kwantificering van RNA of eiwit. Met de chromatine immunoprecipitatie technieken beschreven in dit document, zal het mogelijk zijn om histon-methylatie en andere epigenetische regulatoren van genexpressie in postmortem hersenen kaart.
Chronische neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, bipolaire aandoeningen en autisme men denkt dat het gevolg zijn van een combinatie van genetische en omgevingsfactoren die zouden kunnen resulteren in epigenetische veranderingen in genexpressie en andere moleculaire pathologie. Traditioneel waren echter expressie studies in postmortem hersenen beperkt tot de kwantificering van mRNA of eiwit. De beperkingen aangetroffen in postmortem hersenonderzoek zoals variabiliteit in de tijd autolyse en weefsel integriteiten zijn waarschijnlijk ook alle studies die van hogere orde chromatine structuren impact. Echter, de nucleosomale organisatie van genomisch DNA met inbegrip van DNA: kern histon-binding – lijkt grotendeels bewaard in representatieve monsters als bedoeld door verschillende hersenen banken. Daarom is het mogelijk de studie van de methylatie patroon en andere covalente modificaties van de kern histon-eiwitten op bepaalde genomische loci in postmortem hersenen. Hier presenteren we een vereenvoudigde inheemse chromatine immunoprecipitatie (NChIP) protocol voor bevroren (nooit-vast) menselijke hersenen exemplaren. Te beginnen met micrococcal nuclease vertering van hersenhomogenaten, NChIP gevolgd door qPCR kan worden afgerond binnen de drie dagen. De methodologie hier gepresenteerde moet nuttig zijn om epigenetische mechanismen van genexpressie te helderen in normale en zieke menselijke brein.
Het protocol hier beschreven is vooral handig voor onderzoekers geïnteresseerd zijn in histon-en / of DNA-methylatie handtekeningen van menselijke hersenen, omdat deze chromatine markeringen mogen, indien minder gevoelig is voor postmortale artefacten in vergelijking met andere types van wijzigingen, inclusief (histonen) acetylering en fosforylatie 1, 2. Het postmortem hersenen vatbaar is voor de studie van de mono-nucleosomale preparaten; het DNA blijft grotendeels aan de kern van histonen, althans in exemplaren met een represe…
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute of Mental Health (5R01MH071476).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
3M DTT | Fluka | 43815 | ||
Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions: