والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان
Summary
حتى وقت قريب ، كانت مقتصرة على دراسات التعبير الكمي للدماغ الإنسان من الحمض النووي الريبي أو البروتينات. مع تقنيات مناعي لونين وصفها في هذه الورقة ، سوف يكون من الممكن مثلأيشن هيستون خريطة جينية والمنظمين الآخرين في التعبير الجيني في الدماغ بعد الوفاة.
Abstract
ويعتقد أن الأمراض العصبية المزمنة ، مثل انفصام الشخصية ومرض التوحد وثنائي القطب أن ينتج عن مزيج من العوامل الوراثية والبيئية التي قد تؤدي إلى تغيرات جينية في التعبير الجيني ، وعلم الأمراض الجزيئية الأخرى. تقليديا ، ومع ذلك ، اقتصرت الدراسات التعبير في الدماغ بعد الوفاة لتقدير حجم مرنا أو البروتين. القيود التي تصادف في أبحاث الدماغ بعد الوفاة مثل المتغيرات في وقت وانحلال ذاتي integrities الأنسجة ومن المرجح أيضا أن تؤثر أي دراسات العليا لونين هياكل النظام. ومع ذلك ، فإن منظمة nucleosomal من الحمض النووي DNA الجينومية بما في ذلك : هيستون الأساسية ملزمة — على ما يبدو الى حد كبير في الحفاظ على عينات ممثلة المقدمة من البنوك المختلفة في المخ. ولذلك ، فمن الممكن لدراسة نمط مثلأيشن التساهمية والتعديلات الأخرى في histones الأساسية في مواضع محددة في الدماغ الجينومية بعد الوفاة. هنا ، نقدم مبسطة الأصلي مناعي لونين (NChIP) بروتوكول لعينات الدماغ المجمدة (ثابت أبدا) الإنسان. يمكن إكمال عملية الهضم بدءا من الخليط nuclease micrococcal الدماغ ، تليها NChIP qPCR في غضون ثلاثة أيام. وينبغي للمنهجية المعروضة هنا يكون من المفيد توضيح آليات التعبير اللاجينية الجينات في دماغ الإنسان العادي ومريضة.
Protocol
Discussion
الخطوط العريضة لبروتوكول هنا هو مفيدة بشكل خاص للمحققين مهتمة التواقيع مثلأيشن هيستون و / أو الحامض النووي من الدماغ البشري ، وذلك لأن هذه العلامات لونين قد تكون أقل عرضة للالتحف بعد الوفاة بالمقارنة مع أنواع أخرى من التعديلات ، بما في ذلك (هيستون) والفسفرة أستلة 1 2. الدماغ…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة العقلية (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
- Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 .
- Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 .
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 .
- Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .
- Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, .
- Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 .
